亞洲棉EST-SNP的挖掘及其在陸地棉中的驗證

徐鵬，蔡繼鴻，郭琪，張香桂，徐珍珍，沈新蓮

亞洲棉EST-SNP的挖掘及其在陸地棉中的驗證

徐鵬，蔡繼鴻，郭琪，張香桂，徐珍珍，沈新蓮*

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所/農(nóng)業(yè)部長江下游棉花油菜重點實驗室，江蘇南京210014）

【目的】隨著不同棉種序列數(shù)據(jù)庫的逐步完善以及高通量測序技術(shù)的發(fā)展，棉花單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotidepolymorphism，SNP）標記開發(fā)可利用的公共數(shù)據(jù)資源逐步增加?！痉椒ā勘狙芯炕陉懙孛拮嫦然蚪M的現(xiàn)代種亞洲棉表達序列標簽（Expressed sequencetag，EST）數(shù)據(jù)庫，利用CAP3對亞洲棉EST數(shù)據(jù)庫進行拼接。拼接獲得7 187個重疊群（Contig），再利用QualitySNP軟件進行SNP位點分析?！窘Y(jié)果】在807條含有4條以上EST序列的Contig中查找到2 690個SNP位點。通過篩選次要等位基因頻率大于30%的位點，獲得953個可靠度較高的候選SNP，通過電子篩選，最終獲得可用于陸地棉分析的SNP 149個，利用位點特異性聚合酶鏈式反應以及酶切擴增多態(tài)序列驗證了EST-SNP的準確性?！窘Y(jié)論】本研究證實基于亞洲棉EST數(shù)據(jù)庫挖掘用于陸地棉研究的EST-SNP切實可行，并有望將EST-SNP用于陸地棉遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀的基因定位以及分子標記輔助育種。

亞洲棉；單核苷酸多態(tài)性；酶切擴增多態(tài)性序列；表達序列標簽

Abstract:[Objective]With the development of the cotton genome sequence database and next-generation high-throughput sequencing techniques,the resources available for generating single nucleotide polymorphism (SNP)markers are gradually expanding.[Method]The Gossypium arboreum expressed sequence tags(ESTs)downloaded from the NCBIdatabase were assembled into 7 187 contigs using the CAP3 program.Additionally,the QualitySNPprogram was used for SNPmining.[Result]A total of 2 690 SNPs were obtained from 807 contigs that consisted of more than four ESTs.We obtained 953 highly reliable candidate SNPsby screening for a minor loci frequency of more than 30%.Finally,a total of 149 candidate EST-SNPsthat may be used in G.hirsutum were obtained through in silico screening.An allele-specific polymerase chain reaction and cleaved amplified polymorphic sequencemolecular markerswereused to validatethe accuracy of the selected candidate SNPsin G.hirsutum.[Conclusion]The EST-SNPmarkers from G.arboreum may be used to analyze G.hirsutum.The obtained EST-SNPmarkers will beused to construct genetic maps,map important traits,and completemarker-assisted selection in G.hirsutum.

Keywords:Gossypium arboreum;single nucleotide polymorphism;cleaved amplified polymorphic sequence;expressed sequence tag

目前棉花分子標記的開發(fā)和應用主要集中于利用公用數(shù)據(jù)庫開發(fā)的簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標記。由于陸地棉的遺傳基礎(chǔ)狹窄，種內(nèi)遺傳圖譜所含的SSR標記數(shù)較少，覆蓋率低，不能滿足實際育種的需要；所以，開發(fā)更多其他類型的分子標記成為研究者迫切需要解決的問題。單核苷酸多態(tài)性 （Single nucleotide polymorphism，SNP）分子標記廣泛分布于基因組范圍內(nèi)，具有變異來源豐富、潛在數(shù)量巨大等優(yōu)點，具有廣闊的應用前景[1]。

較高的前期測序成本是大規(guī)模開發(fā)SNP標記的主要限制因素。因此，通過生物信息學方法利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)進行SNP位點的查找并通過后期試驗加以驗證已成為1種快捷高效的SNP開發(fā)途徑。隨著不同棉種序列數(shù)據(jù)庫的逐步完善以及高通量測序技術(shù)的發(fā)展，棉花SNP標記開發(fā)的可利用公共數(shù)據(jù)資源逐步增加，使得利用表達序列標簽（Expressed sequence tag，EST）進行 SNP 標記的開發(fā)具有很多的優(yōu)勢。當前，異源四倍體棉花中存在2個不同進化來源的亞基因組，在進行SNP檢測時，亞基因組間和亞基因組內(nèi)SNP位點的區(qū)分較困難。通過序列比對所發(fā)現(xiàn)的SNP很多是部分同源（異源多倍體內(nèi)亞基因組間的同源性）序列間的差異，而不是等位同源序列間的差異[2]。陸地棉A、D亞基因組種間同源序列的差異使得基于陸地棉EST開發(fā)SNP具有較高的假陽性，開發(fā)效率很低。亞洲棉（Gossypium arboreum）、雷蒙德氏棉（G.raimondii）被認為是異源多倍體祖先基因組的現(xiàn)代種。陸地棉中具有部分同源性的A、D亞基因組分別與亞洲棉、雷蒙德氏棉的基因組具有極小的序列分歧[3]。二倍體與多倍體亞基因組間的相似性、共線性為多倍體陸地棉基因組中區(qū)分SNP提供了材料基礎(chǔ)。

SNP標記檢測方法由于操作復雜、成本昂貴，需要高端的儀器設備；因此，SNP標記技術(shù)在動植物遺傳育種中的應用受到了嚴重限制。酶切擴增多態(tài)性序列 （Cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）是1種將特異引物聚合酶鏈式反應（Polymerasechain reaction，PCR）與限制性內(nèi)切酶消化結(jié)合的分子標記檢測技術(shù)，具有共顯性、位點特異性、操作簡單和成本低等特點，是檢測SNP位點的常用方法[4]。本研究基于陸地棉祖先基因組的現(xiàn)代種亞洲棉EST數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學手段大規(guī)模查找SNP位點，通過電子篩選，獲得可用于陸地棉分析的SNP，對部分SNP位點在陸地棉中進行位點特異性PCR以及對含有酶切位點的SNP位點在陸地棉中CAPS驗證，以期用于陸地棉遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀的基因定位以及分子標記輔助育種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

截至2016年6月，61 898條亞洲棉EST序列下載于美國國立生物技術(shù)信息中心 （NCBI）網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），所有 EST 序列以fasta格式保存。

用于SNP驗證的陸地棉品種分別為DP555、Miscott7913-83、蘇 12、枝棉 3 號、徐州 142、魯棉研28。

1.2 EST序列的聚類和拼接

為了得到更可靠的SNP位點，首先要對EST序列進行預處理，從而獲得clean序列用于后續(xù)SNP位點分析。利用Cross_match[5]對EST序列進行載體序列屏蔽，通過 EST_trimmer.pl（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/download/est_trinimer.pl）腳本進行PolyA以及過短和過長EST的處理， 具體參數(shù)為-amb=2，50；-tr5=T，5，50；-tr3=A，5，50；-cut=100 700（參數(shù)含義分別為去掉末端50 bp內(nèi)不明確的堿基，去掉5'的Poly T，去掉3'端Poly A，選擇長度介于100到700 bp的序列）；CAP3軟件對EST序列進行聚類與拼接，拼接最小重疊堿基為100 bp，具體參數(shù)為-p 95-o 100（相似度95%，最小重疊堿基數(shù)100 bp)。

1.3 EST-SNP位點的挖掘

提取在CAP3拼接結(jié)果中4條及以上的EST序列重疊群用于SNP位點開發(fā)。利用軟件Qual itySNP[6]（http://www.bioinformatics.nl/tools/snpweb/）對含有4條以上亞洲棉EST序列的重疊群開發(fā)SNP位點，同時分析SNP的類型，并對次要等位基因的頻率進行篩選。

1.4 候選SNP位點的驗證

根據(jù)突變位點設計特異PCR引物（http://ausubellab.mgh.harvard.edu/，SNAP program）。 引物設計的主要參數(shù)：引物長度20～36 bp；Tm62～70℃（最適為67℃）；GC含量為45%～65%，最適為 50%。95℃預變性 5 min；94℃變性30 s，65℃退火45 s，72℃延伸 1 min，36個循環(huán)；72℃延伸 10 min；4 ℃保存。產(chǎn)物在 12 g·L－1瓊脂糖凝膠上電泳，觀察電泳條帶是否具有多態(tài)性。

在候選SNP中隨機選取具有酶切位點的候選SNP進行CAPS驗證。首先保證目標序列中只存在1個目標酶切位點，然后在目標酶切位點兩側(cè)用Primer5.0進行引物設計，引物設計的主要參數(shù)為引物長度18～22 bp（最適為20 bp），Tm55～65℃（最適為60℃），GC含量為45%～65%（最適為50%）。95℃預變性5 min；94℃變性30 s，60 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，36 個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃永久保存。酶切分析參照TaKaRa的內(nèi)切酶操作指南，用限制性核酸內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，酶切體系包括10 U·μL－1限制酶 0.3μL、1μL buffer、5.7μL ddH2O、3μL PCR 產(chǎn)物，酶切2 h。酶切完畢后酶切產(chǎn)物在12 g·L－1瓊脂糖凝膠上電泳，觀察電泳條帶的多態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞洲棉EST的處理及拼接

利用Cross_match和EST_trimmer.pl對原始EST序列進行預處理后，最終獲得57 308條clean亞洲棉EST序列。利用CAP3對clean EST拼接，拼接最小重疊堿基為100 bp，序列相似度為95%。亞洲棉EST拼接后獲得7 187條重疊群（Contig），平均每個重疊群含有4.54條EST，含有2條EST序列的重疊群3 363條，含有3條EST序列的重疊群1 336條，含有4條及以上EST序列的重疊群2 488條，24 688條EST未參與拼接（表 1）。

表1 亞洲棉EST序列拼接結(jié)果Table 1 Assembling results of G.arboreum EST

2.2 EST-SNP位點分析

由于序列的拼接需要大量的冗余序列作為基礎(chǔ)，才能保證候選SNP的可靠度，所以本研究選擇2 488條含有4條以上亞洲棉EST序列的Contig利用QualitySNP軟件查找SNP位點 （圖1）。結(jié)果表明，所有用于開發(fā)SNP的Contig序列總長為2 293 541 bp，其中807個Contig含2 690個候選SNP，平均每852 bp出現(xiàn) 1個SNP，每個Contig含有1～87個SNP，平均每個Contig含有3.33個SNP。隨著Contig所含的EST數(shù)目的增加，SNP數(shù)目也表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢（圖2）。其中Contig88由132條EST拼接而成，共含有87個SNP位點。在2 690個候選SNP位點中，顛換類型有1 139個，轉(zhuǎn)換類型1 106個，單堿基插入缺失類型445個。其中A-G轉(zhuǎn)換類型的SNP最多，占22.71%；其次為C-T轉(zhuǎn)換類型，占18.40%；C-插入缺失類型則最少，僅占2.83%（表2）。為了提高候選SNP的可靠度，進一步篩選候選SNP次要等位基因的頻率至少為30%的SNP位點，最終獲得953個可靠度較高的候選SNP用于后續(xù)的分析。

2.3 可用于陸地棉分析的EST-SNP的電子篩選及其驗證

圖1 EST-SNP位點的挖掘Fig.1 Identification of EST-SNP

圖2 不同規(guī)格重疊群平均候選SNP數(shù)量Fig.2 Average amounts of candidate SNP from different contigs

表2 候選SNP的類型分析Table 2 Analysis of candidate SNP types

利用以上獲得的807條含候選SNP的Contig作為查詢序列，以陸地棉EST數(shù)據(jù)庫（下載于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）作為參考序列進行本地 Blastn[7]（E-value＜10－10），獲得與 807 條亞洲棉Contig聯(lián)配的陸地棉EST 40 728條。以QualitySNP分析后產(chǎn)生的allavailsnp文件作為查詢序列，以上獲得的40 728條與亞洲棉Contig聯(lián)配的陸地棉EST作為參考數(shù)據(jù)庫，利用短序列比對軟件 bowtie（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）進行比對，總共681個SNP能夠比對到參考數(shù)據(jù)庫（圖3），其中532個SNP位點只有1個基因型能夠匹配，即該類型的SNP在陸地棉中表現(xiàn)為單態(tài)性。篩選SNP位點2種基因型均能夠與陸地棉EST完全匹配的序列作為候選，最終獲得149個可用于陸地棉分析的候選EST-SNP（表 3）。

為了驗證候選SNP的可靠性，從149個候選的EST-SNP中隨機選擇位點進行驗證。為了保證獲得合適大小的PCR產(chǎn)物，隨機選擇SNP位于序列5'端的Contig2325，利用SNAPprogram根據(jù)突變位點設計特異PCR引物Contig2325-F：5'-AATGGCTTCCATGCTTAGCTCTGGACT-3'，Contig2325-R：5'-CAAAGGCCTCAGGGTCGGCTG-3'。驗證結(jié)果表明，在不同的陸地棉品種中Contig2325的候選SNP具有多態(tài)性（圖4）。

圖3 候選SNP在陸地棉EST中的匹配分析Fig.3 Analysis of SNP mapping to EST database of Gossypium hirsutum

表3 149個可用于陸地棉分析的候選EST-SNP信息Table 3 Information of 149 candidate EST-SNPs

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

表3 （續(xù)）Table 3(Continued)

隨機選取具有酶切位點的候選SNP進行CAPS驗證，用酶切位點識別序列去搜索149條候選的SNP序列信息。本研究用常用的限制性內(nèi)切酶識別序列去搜索allavailsnp文件中149個SNP序列信息 （表 3）， 發(fā)現(xiàn) Contig167、Contig3231在 Eco RⅠ酶切位點處有 SNP。由于Contig3231的酶切位點識別序列位于序列的5'端，無法設計引物；因此，僅對Contig167設計引物，引物序列為Contig167-F：5'-CATACCTCCC CGATCTTACACC-3'，Contig167-R：5'-ACTAATGCACTGCACTTGACGC-3'。PCR擴增酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，Contig167的候選SNP具有多態(tài)性（圖5）。因此，通過亞洲棉EST開發(fā)用于陸地棉分析的EST-SNP基本可行。

圖4 Contig2325候選SNP位點特異性PCR驗證Fig.4 Validation of the candidate SNP of the contig2325 using allele-specific PCR

圖5 Contig167候選SNP位點的CAPS驗證結(jié)果Fig.5 Validation of the candidate SNP of the contig167 using CAPS

3 討論

利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)，結(jié)合生物信息學知識及相關(guān)分析軟件進行SNP標記開發(fā)，再制定針對候選SNP位點的驗證方法，因其具有開發(fā)成本低快捷高效等優(yōu)點，而被廣大科研工作者青睞。公共數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)積累了大量的EST序列，很多來源于不同的個體或品種，大量的冗余序列拼接時往往會出現(xiàn)不一致的堿基，即為EST-SNP突變位點，這些位點可以通過生物信息學方法檢測到[8]。近些年來，在植物方面從模式植物擬南芥[9]，到主要糧食作物水稻[10]、玉米[11]、小麥[12]和大麥[13]，及一些小物種植物，如番茄[14]、松樹[15]、蘋果[16]等，該方法均得到了普遍應用。EST來源于功能基因表達的cDNA片段，相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫中增速最快的核苷酸序列是EST序列，使得以EST序列為基礎(chǔ)進行相關(guān)分子標記開發(fā)變得越來越方便。同時利用EST序列開發(fā)出的候選SNP位點很可能與表達基因緊密相關(guān)或直接位于基因的編碼區(qū)內(nèi)，可直接應用于植物分子育種的研究實踐。本研究基于陸地棉祖先基因組的現(xiàn)代種亞洲棉EST數(shù)據(jù)庫，利用軟件QualitySNP查找到953個可靠度較高的SNP位點，通過在陸地棉EST數(shù)據(jù)庫中電子篩選，最終獲得149個可用于陸地棉分析的候選EST-SNP，以期用于陸地棉遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀的基因定位以及分子標記輔助育種的研究。

棉花上SNP標記大規(guī)模開發(fā)的首次報道是在2009年Van Deynze等[17]以陸地棉和海島棉為主要研究對象，開發(fā)了約1 000個海陸棉種之間的SNP。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，在棉花SNP標記的開發(fā)方面已獲得初步進展。Hulse-Kemp等[18]首先對陸地棉遺傳標準系TM-1的細菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC） 文庫進行末端測序，然后利用這些末端序列為參考對12個陸地棉材料、1個海島棉及1個長萼棉（G.longicalyx Hutchinson&Lee）基因組重測序并進行序列比對，在12個陸地棉材料中發(fā)現(xiàn)了132 262個種內(nèi)SNP標記，在陸地棉與海島棉間挖掘到了223 138個SNP標記，在陸地棉與長萼棉間挖掘了70631個SNP標記。Zhu等[19]通過簡化基因組測序 （RAD-seq）在22個陸地棉品種中得到3 090個SNP標記。目前利用公共數(shù)據(jù)庫開發(fā)棉花SNP的研究則報道較少。Li等[20]利用HaploSNPer軟件對收集到的陸地棉和海島棉的EST進行序列比對，開發(fā)出了356個SNP標記。

棉花栽培種主要為異源四倍體，A和D亞基因組間的部分同源序列區(qū)分困難，難以區(qū)別棉花中2個亞基因組間的單核苷酸變異和亞基因組內(nèi)的單核苷酸變異。這在很大程度上阻礙了棉花中SNP標記的開發(fā)和應用進程。此外，棉花測序工作完成較晚，無法提供參考基因組，這些對棉花中SNP標記的開發(fā)進程有一定的影響。陸地棉中具有部分同源性的A、D亞基因組分別與亞洲棉、雷蒙德氏棉的基因組具有極小的序列分歧[3]。隨著不同棉種基因組測序的完成，基于基因組重測序能夠快速找到大量的基因組變異，因此它是目前發(fā)掘SNP標記最強大的工具。Wang等[21]對陸地棉TM-1和海島棉海7124進行了基因組重測序，以TM-1基因組序列作為參考序列，共在2個材料間鑒定出6 476 899個SNP標記。

4 結(jié)論

本研究基于陸地棉祖先基因組的現(xiàn)代種亞洲棉EST數(shù)據(jù)庫，消除部分同源序列之間的干擾，提高了開發(fā)效率，證實了通過亞洲棉EST開發(fā)用于陸地棉基因組分析的EST-SNP的可行性。

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Development of EST-SNP Markers in Gossypium arboreum and Their Validation in G.hirsutum

Xu Peng,Cai Jihong,Guo Qi,Zhang Xianggui,Xu Zhenzhen,Shen Xinlian*
(Institute of Industrial Crops,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Cotton and Rapeseed,Ministry of A-griculture,Nanjing 210014,China)

S562.03

A

1002-7807（2017）05-0401-14

10.11963/1002-7807.xpsxl.20170628

2016-10-17 第一作者簡介：徐鵬（1981―），男，Semon528@hotmail.com。*通信作者：xlshen68@126.com

國家自然科學基金（31471545）；江蘇省自然科學基金（BK20160580）；國家科技重大專項——轉(zhuǎn)基因生物新品種培育（2014ZX08005-004-002）；棉花生物學國家重點實驗室開放課題（CB2015A12）；江蘇省協(xié)同創(chuàng)新中心