棉花BZR基因家族的全基因組鑒定及表達(dá)分析

郭新磊，路普，王園園，蔡小彥，王星星，周忠麗，王玉紅，王春英，王坤波*，劉方*

棉花BZR基因家族的全基因組鑒定及表達(dá)分析

郭新磊1#，路普1#，王園園2，蔡小彥1，王星星1，周忠麗1，王玉紅1，王春英1，王坤波1*，劉方1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng)455000；2.河南科技學(xué)院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng)453003）

【目的】油菜素唑抗性因子 （Brassinazole resistant transcription factor，BZR）是植物油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroid，BR）信號(hào)通路中的1類重要轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。本研究旨在探索棉花中BZR基因的數(shù)量及其功能?！痉椒ā坷蒙镄畔W(xué)方法，對(duì)雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉中的BZR基因進(jìn)行全基因組鑒定及表達(dá)模式分析?！窘Y(jié)果】雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉中分別有7、7和14個(gè)BZR基因；通過(guò)序列特征分析和系統(tǒng)發(fā)育分析可將棉花BZR基因分為2組（a組和b組）。內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：大部分BZR基因具有2個(gè)外顯子，a組成員中均具有較長(zhǎng)的內(nèi)含子序列，b組成員的內(nèi)含子序列較短，同組BZR成員具有相似的基因結(jié)構(gòu)?；驈?fù)制分析表明：片段復(fù)制是棉花BZR基因家族擴(kuò)增的主要方式，棉花BZR基因在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了嚴(yán)格的純化選擇。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明：14個(gè)GhBZR基因在陸地棉的7個(gè)組織中特異表達(dá)，大多數(shù)GhBZR基因在莖、葉、花瓣和雌蕊中高表達(dá)；許多GhBZR基因的表達(dá)受非生物脅迫誘導(dǎo)?！窘Y(jié)論】推測(cè)GhBZR基因可能參與棉花抗逆及纖維發(fā)育。本研究結(jié)果可為棉花BZR基因的生物學(xué)功能研究提供信息。

棉花；BZR基因；系統(tǒng)發(fā)育分析；表達(dá)分析

Abstract:[Objective]Brassinazole resistant transcription factors(BZR)play important roles in Brassinosteroid(BR)signal transduction in plants.The BZR gene family isinvolved in plant developmental processes by regulating the expression of related genes.The aim of this study isto characterize the number,evolutionary characteristics,and biological function of BZR genes in cotton.[Method]We conducted genome-wide identification and expression analysis of the BZR gene family in Gossypium raimondii,G.arboreum,and G.hirsutum.[Result]In this study,seven,seven,and 14 BZR genes were identified from G.raimondii,G.arboreum,and G.hirsutum,respectively.These BZR genes were grouped into two groups,a and b,based on their amino acid sequences and phylogenetic analysis.Gene structure analysis showed that most BZR genes contain two exons.Additionally,BZR genes in"a"group had a longer intron than those in"b"group;within the same group,BZR genes had a similar gene structure.Analysis of gene duplication revealed that segmental duplications played crucial roles in BZR gene family expansion,with cotton BZR genes experiencing purifying selection during evolution.Transcriptome data analysis showed that 14 GhBZR s had differing expression patterns in different organs;most GhBZR s were highly expressed in stem,leaf,petal,and pistil tissue,and were induced or repressed by abiotic stress.[Conclusion]These results suggest that GhBZR genes may beinvolved in stressresistance and fiber development in cotton.Furthermore,they provide information for further analysis aimed at uncovering the biological functions of BZR genes in cotton.

Keywords:cotton;BZR genes;phylogenetic analysis;expression analysis

油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroid，BR）是植物中的1類多羥基類固醇，參與發(fā)育和多種生理過(guò)程，包括細(xì)胞伸長(zhǎng)、細(xì)胞分裂、衰老、維管分化、繁殖和光形態(tài)建成[1-4]。此外，BR作為應(yīng)激緩解劑廣泛分布于植物中，保護(hù)植物免受各種環(huán)境脅迫的傷害，包括熱激、低溫、干旱、鹽堿、除草劑藥害和病蟲(chóng)害[5-8]。油菜素唑抗性因子（Brassinazole resistant transcription factor，BZR）是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于植物各種組織中，如根、莖、葉和花[9]，此類轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控響應(yīng)BR基因的表達(dá)在BR信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用[10-11]。

研究發(fā)現(xiàn)BZR蛋白質(zhì)具有高度保守的N-末端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在體外和體內(nèi)均具有DNA結(jié)合活性[10-11]。BZR1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由BZR基因的第1個(gè)外顯子編碼，是BZR家族蛋白最保守的區(qū)域，因此命名為BZR結(jié)構(gòu)域[11]。擬南芥中的BZR1和BZR2/BR不敏感蛋白1-MES抑制子 1（BR insensitive 1-EMS-suppressor 1，BES1）是BR信號(hào)途徑中研究比較透徹的2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。在BZR1和BES1的N末端均有1個(gè)非典型的螺旋 -環(huán) -螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）的DNA結(jié)合基序，它們分別能與E-box（CANNTG）和 BRRE（CGTGT/CG）元件結(jié)合[10-11]。這些蛋白質(zhì)的中部含有22～24個(gè)氨基酸的糖原合成酶激酶3（Glycogen synthase kinase，GSK3）家族磷酸化位點(diǎn)。另外，部分BZR成員還含有富含脯氨酸（Proline，P）、谷氨酸（Glutamic acid，E）、絲氨 酸（Serine，S）和蘇氨酸（Threonine，T）的序列（PEST基序），該基序控制蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[10]。

BR信號(hào)通路中，BR結(jié)合并激活受體激酶BR 不敏感蛋白 1（BRinsensitive1，BRI1），激活的BRI1與BRI1相關(guān)受體激酶（BRI1-associated receptor kinase，BAK1）相互作用，激活 BR 信號(hào)[12-13]，而激活的BRI1又可磷酸化BR信號(hào)激酶（BR-signaling kinase1，BSK1）， 磷酸化的 BSK1激活磷酸酶 BRI1抑制子 （BRI1 suppressor 1，BSU1），進(jìn)而使BR感應(yīng)蛋白（Brassinosteroid-insensitive 2，BIN2）激酶脫磷酸化而失活。失活的BIN2對(duì)BZR1轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用消失，BZR1轉(zhuǎn)錄因子在蛋白磷酸酶2A （Protein phosphatase 2A，PP2A）作用下去磷酸化（活化），并在核內(nèi)富集[14-18]?；罨腂ZR1和BES1能夠與下游基因啟動(dòng)子特定區(qū)域結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)BR靶基因的表達(dá)[10-11]。在植物BR信號(hào)通路中，BZR1和BZR2/BES1調(diào)控不同性狀基因的表達(dá)，參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。Jiang等[19]發(fā)現(xiàn)BZR基因通過(guò)調(diào)控MINISEED3和HAIKU2等基因的表達(dá)控制種子的大小和形狀。BZR轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與光敏色素相互作用因子（Phytochrome-interacting factor，PIF）家族基因及DELLA基因互作，參與植物細(xì)胞生長(zhǎng)和光形態(tài)建成[20-22]。此外，異位表達(dá)擬南芥BZR1-1D基因可提高番茄中類胡蘿卜素、可溶性糖和抗壞血酸含量，從而提升番茄果實(shí)的品質(zhì)[23]。

通過(guò)鑒定和研究BZR的目標(biāo)基因，揭示了BR信號(hào)通路中BZR轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制和轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)[24-27]。許多轉(zhuǎn)錄因子家族除調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育外，還參與脅迫應(yīng)答。但目前有關(guān)BZR轉(zhuǎn)錄因子與抗逆性關(guān)系的研究還極少有報(bào)道。鑒于亞洲棉、雷蒙德氏棉和陸地棉基因組測(cè)序已完成[28-31]，本研究對(duì)棉花BZR基因家族成員進(jìn)行了鑒定，對(duì)BZR轉(zhuǎn)錄因子的理化特性、相關(guān)基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因復(fù)制方式進(jìn)行了分析，并對(duì)陸地棉中BZR基因的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步克隆和研究棉花BZR基因奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 棉花BZR蛋白家族成員的鑒定與分類注釋

雷 蒙 德 氏 棉 （Gossypium raimondii，D5，JGI_v2.1）、亞洲棉（G.arboreum，A2，BGI_v1.0）和陸地棉（G.hirsutum，AD1，NBI_v1.1）的基因組數(shù)據(jù)下載自Cottongen數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.cottongen.org/）。 從 Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.sanger.ac.uk/）下載BZR蛋白保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾科夫模型文件（PF05687.10）[32]，然后以 PF05687.10 為探針，利用HMMER 3.0軟件搜索這3個(gè)棉種蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，參數(shù)為默認(rèn)值。同時(shí)，以擬南芥（Arabidopsis thaliana）[10]、水稻（Oryza sativa）[33]、蕪菁（Brassica rapa）[34]的BZR家族蛋白序列為探針，利用本地BLASTP程序，搜索這3個(gè)棉種蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（E值為10－2）。這2種方法所得蛋白序列即為候選的棉花BZR蛋白家族成員。將這些候選蛋白序列分別提交到在線軟件Pfam、SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）[35]和 National Center for Biotechnology Information（NCBI）保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（Conserved domain database，CDD）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）[36]，驗(yàn)證是否具有BZR保守結(jié)構(gòu)域，若存在BZR保守結(jié)構(gòu)域則屬于BZR家族。目前BZR基因家族尚無(wú)系統(tǒng)的命名準(zhǔn)則，本研究依據(jù)BZR家族基因成員所在的染色體以及在染色體上的位置進(jìn)行命名。

1.2 序列分析與進(jìn)化分析

根據(jù)BZR家族基因的gff注釋文件信息，利用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)GSDS（http://gsds.cbi.pku.e-du.cn/）[37]分析基因結(jié)構(gòu)特征，繪制基因結(jié)構(gòu)圖。利用在線工具 ProtComp 9.0（http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc）預(yù)測(cè)BZR家族基因的亞細(xì)胞定位。利用在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）和等電點(diǎn)（pI）。 利用 DNAMAN 軟件對(duì)BZR家族蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，并展示保守位點(diǎn)。此外，利用在線程序MEME（http://meme.sdsc.edu/meme/）鑒定棉花BZR家族基因的保守基序。

采用ClustalW方法對(duì)擬南芥、蕪菁、水稻、雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉的BZR家族蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件通過(guò)Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。參數(shù)設(shè)置：模式采用 “Poisson correction”，數(shù)據(jù)缺失設(shè)置為“Pairwise deletion”， 校驗(yàn)參數(shù)為 Bootstrap=1000。

1.3 染色體定位與基因復(fù)制分析

根據(jù)棉花基因組測(cè)序的基因注釋信息，利用MapChart 2.2軟件繪制棉花BZR基因的染色體定位圖，并確定其復(fù)制方式：在同一染色體上，如果2個(gè)同源BZR基因相鄰或間隔1個(gè)基因，可認(rèn)為是通過(guò)串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生；利用MCScanX[38-39]軟件查找棉花基因組內(nèi)染色體間的共線性區(qū)域（E值設(shè)為1×10－10），位于共線性區(qū)域的BZR基因看作是通過(guò)片段復(fù)制產(chǎn)生。使用在線工具PAL2NAL （http://www.bork.embl.de/pal2nal/，是基于PAML軟件中的codeml程序）[40]計(jì)算復(fù)制基因的堿基非同義替換率（Ka）和同義替換率（Ks）及Ka/Ks，若Ka/Ks＞1，則認(rèn)為有正選擇效應(yīng)；如果Ka/Ks=1，則認(rèn)為存在中性選擇；如果 Ka/Ks＜1，則認(rèn)為有純化選擇作用。 利用公式 T=Ks/r（r=7×10－9）估算復(fù)制事件發(fā)生的時(shí)間。

1.4 上游順式作用元件分析

根據(jù)雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉基因組數(shù)據(jù)，利用perl程序（由本實(shí)驗(yàn)室編寫(xiě)）提取各BZR基因序列轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG上游1500 bp序列，在PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）中檢索，從而鑒定基因上游區(qū)域可能存在的順式作用元件。

1.5 BZR家族基因的表達(dá)分析

從 NCBI的 Sequence Read Archive（SRA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載陸地棉TM-1的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，登錄號(hào)為PRJNA248163（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA248163）[31]。采用有參基因組的轉(zhuǎn)錄組分析方法進(jìn)行分析，利用公式log2(FPKM)標(biāo)準(zhǔn)化FPKM （Fragmentsper kilobase of transcript per million fragments mapped），導(dǎo)入軟件Mev 4.8繪制陸地棉BZR基因表達(dá)量熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花BZR家族基因的鑒定與命名

通過(guò)BLASTP和HMMER搜索獲得的候選氨基酸序列，用Pfam、SMART、CDD工具預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域，剔除不含完整BZR結(jié)構(gòu)域的冗余序列，從雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉中分別鑒定出7、7和14個(gè)候選基因。目前該基因家族沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的命名準(zhǔn)則，本研究依據(jù)各基因所在的染色體 （從第1號(hào)染色體到第13號(hào)染色體再到scaffold）及在染色體上的位置進(jìn)行命名 （表1），即GrBZR1～GrBZR7，GaBZR1～GaBZR7 和 Gh-BZR1～GhBZR14。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：雷蒙德氏棉和亞洲棉中的BZR基因均定位于細(xì)胞核，

而陸地棉中BZR基因都定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

表1 棉花BZR 基因家族信息Table 1 The information of BZR gene family in cotton

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果表明：棉花BZR基因編碼蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為313～349個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為33 980.0～37 711.2，理論等電點(diǎn)為7.60～9.12，為堿性。

2.2 序列分析與進(jìn)化分析

根據(jù)棉花BZR基因系統(tǒng)發(fā)育分析，棉花BZR基因可分為2組，即a組和b組，分別包含16和12個(gè)成員，且各組內(nèi)成員間具有相似的基因結(jié)構(gòu)，編碼相似的結(jié)構(gòu)域（圖1）。利用GSDS軟件對(duì)BZR基因的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)BZR基因具有2個(gè)外顯子，僅4個(gè)成員具有3個(gè)外顯子，且a組成員的內(nèi)含子序列較b組的長(zhǎng)。

利用在線工具M(jìn)EME鑒定棉花BZR家族的保守基序，結(jié)果表明：棉花BZR家族中存在10個(gè) motif，所有成員都包含 motif 1、2、7（圖 1 和圖2）。此外，a組成員還具有 motif 3、5、6，部分成員具有motif 10，部分具有motif 8；b組成員均具有motif 4、9、10。 其中，motif 1 是 N 端的 bHLH 結(jié)構(gòu)，motif 2和motif 7是C端結(jié)構(gòu)，motif 6是絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，motif 8是PEST基序，motif 4則包含了絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和PEST基序。

利用擬南芥、水稻、蕪菁、雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉中的BZR蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) （圖3），可將BZR家族分為2組，與上面系統(tǒng)發(fā)育分析的分組一致，推測(cè)這2組成員的不同結(jié)構(gòu)可能賦予了它們不同的功能。其中，第1組中棉花具有16個(gè)成員，擬南芥僅有2個(gè)成員，在第2組中棉花含有12個(gè)成員，擬南芥有4個(gè)成員，與擬南芥相比，第1組BZR的編碼基因在棉花中發(fā)生了倍增。在進(jìn)化樹(shù)中，水稻BZR與其他物種BZR親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同為十字花科的擬南芥和蕪菁聚類，3個(gè)棉種 （雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉）聚類，表明BZR在近緣物種中相似度更高，并可能具有相似的功能。

2.3 基因定位與基因復(fù)制

雷蒙德氏棉的7個(gè)GrBZR基因分布在6條染色體上；亞洲棉的7個(gè)GaBZR基因分布在7條染色體上；陸地棉的14個(gè)GhBZR基因，有13個(gè)和1個(gè)基因分別定位于11條染色體和scaffold1329_A06上。串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制是基因家族擴(kuò)增的主要方式[41]，利用MCScanX對(duì)雷蒙德氏棉和亞洲棉基因組中的基因復(fù)制事件進(jìn)行檢測(cè)表明：雷蒙德氏棉和亞洲棉中分別至少有5個(gè)和4個(gè)BZR基因經(jīng)歷了片段復(fù)制，且這2個(gè)棉種均不存在BZR基因的串聯(lián)復(fù)制，表明片段復(fù)制是棉花BZR基因家族擴(kuò)增的主要方式。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)所有Ka/Ks均小于1，最大僅為0.154 8（表2），表明棉花BZR基因在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了嚴(yán)格的純化選擇作用，暗示復(fù)制基因在進(jìn)化中較為保守，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，功能具有一致性。

2.4 BZR基因上游順式元件分析

對(duì)雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉BZR基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游區(qū)域1500 bp序列的順式作用元件分析結(jié)果顯示，棉花BZR基因上游存在許多植物激素響應(yīng)元件、環(huán)境脅迫響應(yīng)元件和植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件（附表1，印刷版省略，參見(jiàn)本刊網(wǎng)站）。BZR基因上游發(fā)現(xiàn)的植物激素響應(yīng)元件包括 ABRE、TGA、ERE、GARE、TATC、P-box、TCA、TGACG 和 CGTCA。 其 中 ，ABRE、TGA、ERE和TCA分別響應(yīng)脫落酸、生長(zhǎng)素、乙烯和水楊酸。GARE、TATC和P-box是赤霉素響應(yīng)元件，TGACG和CGTCA均響應(yīng)茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）。環(huán)境脅迫響應(yīng)元件有7 種，包括 HSE、LTR、MBS、ARE、TC-rich repeats、Box-W1和GCmotif。HSE、LTR和MBS分別是熱、低溫和干旱響應(yīng)元件，ARE和GCmotif是水淹或缺氧響應(yīng)元件，Box-W1是真菌響應(yīng)元件，TC-rich repeats是防御和脅迫響應(yīng)元件。生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件有：Skn-1_motif、circadian、GCN4_motif、CAT-box和CCGTCC-box，它們和植物的胚乳發(fā)育、分生組織發(fā)育及生物節(jié)律有關(guān)。

2.5 陸地棉BZR基因的表達(dá)分析

對(duì)GhBZR基因在棉花根、莖、葉、花瓣、雌蕊、雄蕊和副萼中的表達(dá)模式分析表明，14個(gè)GhBZR基因在這7個(gè)組織中都能夠特異性表達(dá)（圖5-A）。其中，GhBZR3和GhBZR9具有相似的表達(dá)特征，在7個(gè)組織中都高表達(dá)，暗示這2個(gè)基因可能具有相似的功能。相反，GhBZR4和GhBZR10在這些組織表達(dá)水平較低。GhBZR11、GhBZR12、GhBZR2、GhBZR5、GhBZR8 和 GhBZR14具有明顯的組織特異性表達(dá)特征，它們?cè)谇o、葉和雌蕊中高水平表達(dá)，而在其他組織中低水平表達(dá)。此外，大多數(shù)BZR基因在莖、葉、花瓣和雌蕊中都高表達(dá)，暗示了BZR基因可能參與棉花莖、葉和雌蕊的發(fā)育。

圖1 棉花BZR 家族基因的結(jié)構(gòu)與編碼的結(jié)構(gòu)域Fig. 1 The gene structures and encoding domains of BZR genes in cotton

圖2 雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉（TM-1）BZR蛋白的多序列比對(duì)分析Fig.2 Alignment of amino acid sequences of BZR proteins in G.raimondii,G.arboreum and G.hirsutum

圖3 棉花BZR與其他植物BZR的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of BZRs in cotton and other plants

圖4 BZR家族基因在棉花染色體上的分布及復(fù)制分析Fig.4 Chromosomal distribution and duplication analysis of BZR genes in cotton

表2 雷蒙德氏棉和亞洲棉中發(fā)生復(fù)制的BZR基因的堿基替換率Table 2 Synonymous and nonsynonymous substitution rates for the duplication events in GaBZR and GrBZR genes

BZR是1類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在BR信號(hào)通路中發(fā)揮了重要作用，但有關(guān)棉花BZR轉(zhuǎn)錄因子抗逆性的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)陸地棉BZR基因在PEG-6000、鹽、低溫和高溫處理下的表達(dá)情況進(jìn)行了研究（圖5-B）。PEG和鹽處理后BZR基因表現(xiàn)相似的表達(dá)特征，一半左右的BZR基因在處理1 h后上調(diào)表達(dá)，這部分基因全都是a組基因；而另一半基因則在處理6 h后上調(diào)，該部分基因主要是b組基因。在高溫處理下，大部分基因在處理6 h后上調(diào)表達(dá)；而在低溫下，大部分基因在處理3 h后呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。

圖5 14個(gè)陸地棉BZR家族基因表達(dá)模式Fig.5 Expression patterns of 14 GhBZR genes

3 討論

BZR家族作為BR信號(hào)通路中的1類重要轉(zhuǎn)錄因子[10-11]，其家族基因成員的鑒定對(duì)棉花BZR基因的生物學(xué)功能分析及BR信號(hào)通路的研究具有重要意義。亞洲棉、雷蒙德氏棉和陸地棉基因組測(cè)序的完成，為棉花BZR基因家族的預(yù)測(cè)和分析提供了便利。擬南芥和蕪菁分別有6個(gè)和15個(gè)BZR基因[10,34]。本研究分別從雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉中鑒定出7、7和14個(gè)BZR轉(zhuǎn)錄因子。棉花BZR基因在二倍體棉中數(shù)目相等，結(jié)構(gòu)相似（如GrBZR1和GaBZR2），表明BZR基因在雷蒙德氏棉和亞洲棉間高度保守。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析及基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：棉花BZR基因可分為2組，同組基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)，且外顯子數(shù)目幾乎一致；a組基因內(nèi)含子序列較b組的長(zhǎng)。結(jié)構(gòu)域分析及序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，組內(nèi)BZR基因編碼的蛋白具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，2組基因編碼的蛋白具有不同的保守結(jié)構(gòu)域，推測(cè)這2組基因可能具有不同的功能。

棉花BZR基因上游存在環(huán)境脅迫響應(yīng)元件，包括LTR低溫響應(yīng)元件、MBS干旱響應(yīng)元件等，以適應(yīng)環(huán)境變化。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，得到蕪菁BZR基因與雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉BZR基因的進(jìn)化關(guān)系，有助于推測(cè)BZR基因在棉花中的功能。蕪菁的2個(gè)自交系Chiifu和Kenshin經(jīng)冷害、凍害脅迫后，BrBZR1-1、BrBES1-3、BrBEH4、BrBEH6、BrBEH7 和 BrBEH8的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，經(jīng)冷害處理的耐低溫自交系Chiifu中BrBZR1-1和BrBES1-3的表達(dá)量要比凍害處理高，而自交系Kenshin中BrBEH8在2種脅迫下表達(dá)量均較高[42]，蕪菁的BZR基因家族中BrBEH基因在冷害或凍害下的誘導(dǎo)性比BrBZR1、BrBES1更強(qiáng)[43]。蕪菁的BrBEH基因與本研究的棉花a組GhBZR基因同源性較高，暗示a組GhBZR基因可能在棉花抵御冷害、凍害脅迫中起重要作用。Sun采用ChIP-chip的方法鑒定出許多BZR的靶標(biāo)基因，其中包括參與抗旱耐鹽的基因RD26、ERD14和STZ以及耐冷相關(guān)基因CBF2[25]，暗示BZR可能在植物抗旱耐鹽等過(guò)程具有重要作用。本研究中，GhBZR6、GhBZR1和GhBZR7在PEG及鹽處理后的1、3和6 h均上調(diào)表達(dá)，它們可能參與棉花抗逆過(guò)程。

前人研究發(fā)現(xiàn)BZR轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞伸長(zhǎng)和植物的光形態(tài)建成[20-22]。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)BR信號(hào)時(shí)，磷酸化的BZR1和14-3-3蛋白結(jié)合而滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)有BR信號(hào)時(shí)，BZR1去磷酸化，與14-3-3蛋白分離，進(jìn)入細(xì)胞核中聚集，從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[10,44-45]。目前已從陸地棉中得到8個(gè)14-3-3基因，有6個(gè)在棉花纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，其中5個(gè)的編碼產(chǎn)物與BZR蛋白存在互作[46]。周穎等從陸地棉中鑒定出1個(gè)BZR轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)保守基序與14-3-3蛋白相互作用，參與棉纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)發(fā)育[45]。本研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)GhBZR基因在莖、葉、花瓣和雌蕊中都高表達(dá)，由此推測(cè)BZR轉(zhuǎn)錄因子在棉花纖維發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

以二倍體雷蒙德氏棉、亞洲棉和四倍體陸地棉為研究對(duì)象，分別鑒定得到7、7和14個(gè)BZR基因，分析了其位置、結(jié)構(gòu)及編碼產(chǎn)物的等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)域，并通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析將棉花BZR家族基因分為2組。一些GhBZR基因的表達(dá)具有組織特異性并響應(yīng)非生物脅迫，推測(cè)GhBZR基因可能參與棉花抗逆及纖維發(fā)育。棉花BZR基因的全基因組鑒定及表達(dá)分析，為挖掘棉花BZR基因潛在的功能奠定了基礎(chǔ)。

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Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the Gene Family Encoding Brassinazole Resistant Transcription Factors in Cotton

Guo Xinlei1#,Lu Pu1#,Wang Yuanyuan2,Cai Xiaoyan1,Wang Xingxing1,Zhou Zhongli1,Wang Yuhong1,Wang Chunying1,Wang Kunbo1*,Liu Fang1*
(1.Institute of Cotton Research of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology,Anyang,Henan 455000,China;2.Henan Institute of Science and Technology/Collaborative Innovation Center of Modern Biological Breeding,Henan Province,Xinxiang,Henan 453003,China)

S562.01

A

1002-7807（2017）05-415-13

10.11963/1002-7807.gxllf.20170830

2016-12-29 第一作者簡(jiǎn)介：郭新磊（1989―），男，碩士，guoxlcaas@163.com；路普（1992―），男，碩士研究生，lupu1992@163.com；#同等貢獻(xiàn)。*通信作者：劉方，liufcri@163.com；王坤波，wkbcri@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金（31671745）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0101401，2016YFD0100203）