ε-聚賴氨酸對關中黑豬精液常溫保存效果研究

魏 寧，候震坤，謝景興，劉兆軍，楊公社，龐衛(wèi)軍

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100）

ε-聚賴氨酸對關中黑豬精液常溫保存效果研究

魏 寧，候震坤，謝景興，劉兆軍，楊公社，龐衛(wèi)軍*

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100）

欄目協(xié)辦

試驗通過對在常溫保存的關中黑豬精液中添加ε-聚賴氨酸效果的研究，探究新的減少稀釋液中抗生素使用的可能性。向稀釋后的精液中分別添加0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 g/L的ε-聚賴氨酸，檢測其保存1～5 d的精液質量。結果表明：ε-聚賴氨酸在濃度為0.04～0.64 g/L不會影響精液滲透壓，添加ε-聚賴氨酸可以提高關中黑豬精液的保存效果，其中最適濃度為0.16 g/L。

ε-聚賴氨酸；公豬精液；常溫保存

由于采精不可能在無菌條件下操作，精液不可避免地會受到來自周圍環(huán)境如空氣、糞便、尿液等中細菌的污染，故能從精液中檢測出細菌。相關研究表明，污染精液的細菌主要是革蘭氏陰性菌，其中以腸桿菌科菌為主，且精液中細菌的濃度一般為104～105cfu/mL[1]。精液中的細菌會降低精子的品質，影響母豬的繁殖成績[2]。

目前，主要通過在稀釋液中添加抗生素來抑制精液中的細菌生長。然而，由于近年來抗生素在畜牧業(yè)中的濫用導致許多抗藥性細菌的產(chǎn)生，使得添加在稀釋液中的抗生素效果大大降低。一份報告表明，某公豬站中的公豬精液由于受到對慶大霉素具有耐藥性的粘質沙雷氏菌污染，精液在常溫保存36～48 h后發(fā)生大量的凝集，精子的運動能力顯著降低[3]。若繼續(xù)在精液中添加常規(guī)抗生素，則可能會使精液中耐藥性細菌定向感染母豬。因此，尋找新的抗菌物質完全替代或部分替代傳統(tǒng)抗生素是解決這一問題的主要方法之一。

ε-聚賴氨酸（ε-PL）是一種天然的陽離子抗菌肽，ε-PL的特點是對人體無毒無害，結構穩(wěn)定，在高溫下仍然具有抗菌活性，易溶于水[4]，故ε-PL對于環(huán)境幾乎不會造成任何影響[5]。由于ε-PL具有安全無害，抗菌廣譜和可被生物降解等特點。目前該物質已經(jīng)被廣泛用于食品、工業(yè)、醫(yī)療等領域。在美國和日本，已允許在食品中添加ε-PL。本實驗室過去通過體外抑菌試驗已知ε-聚賴氨酸擁有一定的抑菌能力，并可以替代一定量的抗生素。本試驗在關中黑豬精液中添加不同濃度ε-PL，探究其對關中黑豬精液的影響，為其在關中黑豬精液常溫保存的使用提供實踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 關中黑豬精液精液來源于西北農(nóng)林科技大學畜牧生產(chǎn)實踐基地成年健康關中黑豬公豬。使用BTS液進行稀釋，試驗組分別添加 0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 g/Lε-聚賴氨酸，放入17℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

異硫氰酸熒光素-花生凝集素（FITC-PNA），羅丹明(Rh123)，碘化丙啶(PI)。

1.1.3 儀器

CASA（計算機精子輔助分析儀），滲透壓測定儀，無菌操作臺，17℃恒溫培養(yǎng)箱，熒光顯微鏡，37℃恒溫水浴鍋等。

1.2 方法

1.2.1 精液滲透壓的測定

使用滲透壓測定儀進行滲透壓檢測。

1.2.2 不同時間段中精液中菌落數(shù)的測定

根據(jù)常溫保存的時間段，將精液用無菌水稀釋至合理的倍數(shù)。取100 μL稀釋后的精液均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基表面，而后倒置放37℃恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)12 h。計數(shù)不同稀釋倍數(shù)下培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)（每個平板上以30～300個菌落為宜），乘以相應的倍數(shù)即為對應精液中細菌的個數(shù)。

1.2.3 精子活率的測定

取出關中黑豬精液，將精液輕輕搖勻，取200 μL公豬精液置于1.5 mL的離心管中，放37℃水浴鍋中孵育4 min，并將蓋玻片和載玻片放37℃恒溫載物臺上預熱。使用精子計算機輔助分析系統(tǒng)（CASA）檢測精子活率。分別記下3個視野下精子的活率，取其平均值。

1.2.4 精子質膜完整性的測定

按檸檬酸鈉7.35 g/L，果糖13.5 g/L配制檸檬酸鈉-果糖低滲液（現(xiàn)配現(xiàn)用），待溶液溶解后，從各試驗組中吸取1 mL精液，分別加入9 mL檸檬酸鈉—果糖低滲液，在37 ℃條件下水浴30 min，期間不時輕晃試管，以免精子沉積。完畢后，在400倍光學顯微鏡下觀察精子彎尾率。計算在200個精子中尾部彎曲的精子所占比例，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 精子頂體完整性的測定

使用熒光染料異硫氰酸熒光素-花生凝集素（FITC-PNA）對精子進行染色檢測頂體完整率。取30 μL精液均勻涂抹于干凈的載玻片上，自然風干。風干后的樣品玻片置于無水甲醇中，固定10 min后放置于空氣中，自然風干。取30 μL FITC-PNA工作液，均勻覆蓋樣品，再將玻片置于濕盒內(nèi)，37℃，避光孵育30min。孵育結束后使用PBS沖洗玻片2～3次，洗去浮色，后迅速在熒光顯微鏡下觀察拍照，使用450～490 nm紫外光激發(fā)。選擇5個以上清晰的視野，且每個視野精子數(shù)200個以上，計算頂體完整精子比例。試驗全程避光操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2016進行統(tǒng)計整理，利用 SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），最終以Mean±SD形式表現(xiàn)。P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 ε-PL對稀釋液滲透壓的影響

由表1可知ε-聚賴氨酸對精液的滲透壓影響很小。ε-PL添加量在0.04～0.64 g/L以及0.25 g/L慶大霉素時對于精液的滲透壓影響不大（P＞0.05），當該物質添加至1.28 g/L時，精液中的滲透壓顯著高于其他組（P＜0.05）。

表1 不同濃度ε-聚賴氨酸對精液滲透壓的影響

2.2 ε-PL對精液中菌落數(shù)的影響

由圖1可知，在稀釋液中添加0.04～1.28 g/L的ε-聚賴氨酸在常溫1～3 d內(nèi)能有效抑制細菌的生長。當保存至第3天，0.04 g/L與0.16 g/L組內(nèi)的細菌開始迅速生長，但這兩組的菌落數(shù)量仍然低于空白對照組，說明在此濃度下ε-聚賴氨酸仍然具有抑菌效果；隨著保存時間的增加，ε-聚賴氨酸的抑菌能力降低；而0.64 g/L，1.28 g/L處理組在1～5d內(nèi)均保持強抑菌效果。

2.3 ε-PL對精子活率的影響

如表2所示常溫保存第1天后各處理組與對照組的精子活率差異不明顯（P＞0.05)。當保存至第2天時對照組和添加0.08 g/L ε-PL處理組的活率顯著高于其他組（P＜0.05）。隨著保存時間增加，當保存至第3天時0.04 g/L，0.08 g/L，0.16 g/L ε-PL的處理組顯著高于其他組（P＜0.05）。而其他處理組精子的活力均高于對照組。當保存至第4、5天時0.16 g/L ε-PL處理組的保存效果最好。此外，各處理組的精子活力均高于對照組。因此，相比于其他處理組添加0.16 g/L ε-PL常溫保存5 d后精子活率最高。

圖1 不同濃度ε-聚賴氨酸對精液中菌落數(shù)的影響

表2 不同濃度ε-聚賴氨酸對精子活率的影響

2.4 ε-PL對精子質膜完整性影響

如表3所示常溫保存兩天后，添加0.64 g/L、1.28 g/L ε-PL處理組的質膜完整性顯著低于其他組（P＜0.05）。當保存至第3天時，0.16 g/L ε-PL處理組的精子質膜完整性最高。各處理組的質膜完整性高于對照組。而當保存至第5天時，各處理組的質膜完整性均顯著高于對照組（P＜0.05)。相對于其他處理組，0.16 g/L ε-PL的處理組質膜完整率最高。

2.5 ε-PL對精子頂體完整性影響

關中黑公豬精液在常溫保存第1、2天，公豬精子的頂體完整性差異不顯著（P＞0.05）。當保存至第3天時，各處理組中的精子頂體完整性顯著高于對照組（P＜0.05），而處理組間添加0.16 g/L ε-PL的處理組精子頂體完整性最高。在第4天時，各處理組的精子頂體完整性仍顯著高于對照組，其中0.04g/L、0.08 g/L、0.16 g/L3個處理組精子頂體完整性相近（P＞0.05），且高于其他處理組（P＜0.05）。第 5天時0.16 g/L ε-PL的處理組頂體完整性最高。

表3 不同濃度ε-PL對精子質膜完整性影響

表4 不同濃度ε-PL對精子頂體完整性影響

3 討論

稀釋液的穩(wěn)定滲透壓為保證精子在液態(tài)常溫保存，而精子的耐受滲透壓為240～380 mosm之間，過低的滲透壓會影響精子質膜的完整性[6-7]。本試驗發(fā)現(xiàn)在使用BTS稀釋后的關中黑豬精液中添加0.04～0.64 g/L ε-PL后，其滲透壓基本不變，說明該物質對于滲透壓的影響較小。

ε-PL是一種由賴氨酸殘基構成的陽離子抗菌肽，其表面帶有大量的正電荷，能黏附到帶有大量負電荷的菌體膜上，使菌體膜表面成孔洞狀以影響細菌的正常生命活動，從而起到抑菌的作用[8]，其對于G+和G-均具有不錯的抑制效果[9]。本試驗發(fā)現(xiàn)當精液中ε-PL添加量為0.04 g/L時，在0～3 d能有效抑制精液中細菌的生長，但隨著保存時間的增加抑制效果逐漸降低。當保存時間在3～5 d時，0.16 g/L處理組精液中細菌含量接近于空白對照組中第2天的細菌數(shù)量。因此，在0.16 g/L時就已經(jīng)能夠將公豬精液中的細菌量控制在安全范圍內(nèi)（不損傷精子）。但當精液常溫保存超過5 d，添加0.16 g/L ε-PL對精液中細菌控制效果可能會大大降低。

精子活率是評價精子運動能力的重要指標之一，研究發(fā)現(xiàn)，當使用精子活率低于60%的精液輸精，會降低母豬的繁殖成績[10]。精子活率是評價常溫保存后精子受精能力的重要指標[11]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)當精液常溫保存至第2天時，對照組中的精子活率高于其他處理組，一方面可能是因為ε-PL對精子有輕微的毒害作用，另一方面是由于常溫保存至第2天精液中存在細菌還不足以影響到精子的運動。

精子質膜和頂體是否完整是精子能否發(fā)揮其正常生理功能的保證。2004年曾發(fā)現(xiàn)與用傳統(tǒng)的精子活率估計母豬繁殖成績相比，精子質膜和頂體完整性能更準確地評估輸精后母豬的繁殖成績[11]。精子的受精能力不僅與質膜完整性有關還與頂體完整性相關。本試驗發(fā)現(xiàn)，在常溫保存第1天各組間的質膜和頂體完整性差異不顯著。當保存至第2天時高濃度ε-PL處理組（0.64 g/L，1.28 g/L），精子質膜完整性顯著低于低濃度及對照組。這是由于ε-PL對于精子可能具有輕微的毒性作用。由于公豬精子與其他哺乳動物精子相比，質膜中的膽固醇含量較低，因此，陽離子抗菌肽可能會結合到豬精子膜表面輕微的影響精子質膜和完整性，而公豬精子的頂體幾乎未受到影響?？傊褐械募毦焕诰拥某乇４?，其會損傷精子的質膜和提前引發(fā)精子的頂體反應。而對照組的質膜和頂體完整性在常溫保存第3天后顯著低于處理組，是因為細菌在第2天開始大量的繁殖，保存至第3天對照組中的細菌數(shù)量已威脅精子存活。當保存至第4、5天時，各處理組的質膜和頂體完整性均高于對照組，而在0.04 g/L處精子仍能夠保持較高的頂體完整性，仍可能是由于ε-聚賴氨酸減少了細菌對精子的黏附作用[12]。

4 結論

0.04～0 .64 g/Lε-PL不影響稀釋精液的滲透壓，但能有效控制精液中細菌的生長，提高關中黑豬精液的保存效果，其中ε-PL的最佳濃度為0.16 g/L。

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2017-08-04）

國家生豬產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-36）和西北農(nóng)林科技大學試驗示范站（基地）科技成果推廣項目（TGZX2015-18）

魏寧(1993-)，男，在讀碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：wein0513@163.com通訊作者：龐衛(wèi)軍(1972-)，教授，博士生導師，研究方向：肌肉生物學與豬遺傳改良，E-mail：pwj1226@nwafu.edu.cn