九味肝泰對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠急性免疫性肝損傷的干預(yù)研究*

鄧衛(wèi)平 鄭紅梅 李勝保 郜元軍 金 曙 陳德森

1.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)消化內(nèi)科 (湖北 十堰， 442000) 2.太和醫(yī)院技能培訓(xùn)中心 3.湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室

九味肝泰對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠急性免疫性肝損傷的干預(yù)研究*

鄧衛(wèi)平1鄭紅梅2李勝保1郜元軍1金 曙1陳德森3△

1.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)消化內(nèi)科 (湖北 十堰， 442000) 2.太和醫(yī)院技能培訓(xùn)中心 3.湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室

目的：建立C57BL/6Jd小鼠急性免疫性肝損傷模型，觀察九味肝泰對(duì)其免疫損傷及肝功能的影響。方法按隨機(jī)原則將30只接種乙型肝炎病毒(HBV )的C57BL/6J品系轉(zhuǎn)基因雄性小鼠分為對(duì)照組、模型組和九味肝泰組。采用尾靜脈注射12mg/kg刀豆蛋白A(ConA)的方法誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠急性免疫性肝損傷模型；成模8 h后九味肝泰組小鼠按(0.5mL/10g·d)灌10%九味肝泰混懸液干預(yù)性治療7d，對(duì)照組及模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。檢測(cè)干預(yù)前和干預(yù)7 d后小鼠肝功能[總膽紅素(TBil)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、總膽汁酸(TBA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)]、還原型谷胱甘肽(GSH)、血清中超氧化物歧化酶( SOD)和肝組織中丙二醛( MDA)。結(jié)果九味肝泰組小鼠在干預(yù)治療7d后，TBil、AST、GGT、TBA、ALT與對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性意義；GSH 和SOD升高、MDA明顯降低，與同組干預(yù)前及模型組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論九味肝泰可抑制ConA誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷小鼠的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，促進(jìn)其肝功能恢復(fù)。

九味肝泰；C57BL/6J小鼠；刀豆蛋白A；急性免疫性肝損傷模型；肝功能

AbstractObjective:To establish the acute immune C57BL/6J mice liver injury model and observe the effect of nine kinds of Gantai on immune injury and liver function.Methods:Thirty male BABL/cJ mice were randomly divided into control group, model group and nine kinds of Gantai group;acute immune C57BL/6J mice liver injury model was set by intravenous injection of 12mg/ concanavalin A;nine kinds of Gantai group (0.5mL/10g in mice d) with 10% nine kinds of Gantai turbid suspension intervention for 7 days (d), blank control group and model group were given normal saline.Detected the mice liver function[total bilirubin (TBil), aspartate aminotransferase (AST), glutamyl transferase (GGT), total bile acid (TBA), alanine aminotransferase (ALT), glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD) content and in liver tissue (MDA)]before and after intervention.Results：Compared with the same group before treatment and model group ,Nine kinds of Gantai group in the intervention treatment of 7 days, TBil, AST, GGT, TBA and ALT near the level of the control group, GSH and SOD increased, MDA decreased significantly (P<0.05).Conclusion：nine kinds of Gantai inhibited concanavalin A induced lipid peroxidation in acute immunological liver injury and promote the recovery of liver function in acute immunological liver injury.

KeyWordsnine kinds of Gantai; C57BL/6J mice; acute immune liver injury model; liver function

肝損傷的原因復(fù)雜，如HBV感染、藥物毒性或副作用等[1]。其中HBV引起的急、慢性病毒性肝炎多會(huì)造成嚴(yán)重的肝損傷，最終發(fā)展為肝硬化或肝癌[2，3]。研究表明，用ConA靜脈注射接種HBV的C57BL/6J品系轉(zhuǎn)基因小鼠可誘導(dǎo)出與人類極相似的急性肝損傷，這種動(dòng)物模型被公認(rèn)為最適合研究人類自身免疫性肝病及感染HBV的病毒性肝炎的病理機(jī)制[4]。九味肝泰具有化瘀通絡(luò)、清熱利濕、健脾疏肝之功效[5]。本實(shí)驗(yàn)以接種HBV的C57BL/6J品系轉(zhuǎn)基因雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，試圖探討九味肝泰防治肝損傷的作用機(jī)制，以期為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1. 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雌性C57BL/6J小鼠30只，7周齡，體質(zhì)量(20.76±3.05)g，動(dòng)物由十堰市太和醫(yī)院肝病研究所提供，許可證：[SCXK(京)2005-0013]。實(shí)驗(yàn)前先用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)，然后隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和九味肝泰組(每組10只)。動(dòng)物房恒溫，22 ℃，濕度50%～75 %，單籠無(wú)菌飼料飼養(yǎng)，12 h交替光照，自由飲水，保證動(dòng)物福利[6]。

1.2 藥物與試劑 九味肝泰(湖南新匯制藥股份有限公司，規(guī)格：0.35g/粒，批號(hào)：B1400073185)。HBV病毒質(zhì)粒( pUC18-HBV1.3)，本質(zhì)粒具有繁殖能力，為十堰市太和醫(yī)院肝病研究所在pUC18-HBV的BamHI和 Hind Ill位點(diǎn)插入1.3拷貝加長(zhǎng)的HBV DNA重組質(zhì)粒。ConA試劑(美國(guó) Sigma公司，規(guī)格：100mg/支，批號(hào)：80M7680V)。

1.3 動(dòng)物造模 造模前所有動(dòng)物均禁食12h，不禁水， 模型組和九味肝泰組小鼠造模時(shí)采用高壓水注射方法將pUC18-HBV1.3質(zhì)粒(50μL)從小鼠尾靜脈注入造成HBV病毒感染模型[7]。然后從尾靜脈注射ConA試劑(12mg/kg)，8h后成模。對(duì)照組小鼠則從尾靜脈注射(50μL)生理鹽水。成模判斷依據(jù)：預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)我們用了6只SPF級(jí)雌性C57BL/6J小鼠按以上方法造模，在尾靜脈注射ConA試8 h后，取小鼠尾靜脈血50μL用RT-PCR法對(duì)HBV DNA定量分析，HBV DNA實(shí)時(shí)定量≥2.0×103copies/mL，均為陽(yáng)性，且肝功能五項(xiàng)指標(biāo)均顯著升高，符合感染HBV后急性免疫性肝損傷指標(biāo)[8]。模型組和九味肝泰組小鼠造模后HBV DNA均為陽(yáng)性(100%)。

1.4 給藥方法 尾靜脈注射ConA 8h后，用小鼠灌胃針抽取預(yù)先配制好的10%九味肝泰混懸液(0.5mL/10 g·d)灌胃，2次/d，共7 d，對(duì)照組及模型組小鼠灌等量生理鹽水(0.5mL/10 g·d)。

1.5 觀察指標(biāo)及方法 ①血清HBV DNA實(shí)時(shí)定量檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法，在動(dòng)物造模8 h和治療7 d后，分別處死5只，摘取眼球取血進(jìn)行HBV DNA定量分析，檢測(cè)時(shí)取50μL靜脈血加入10μL DNase液混勻，370C消化l6 h，然后用乙戊醇抽提HBV DNA。引物設(shè)計(jì)：CP2：5'-CTACAAACCTATGCGTGAG- 3fcw3a：5-TCAGCTTCCACCTAACCGTCA-3。②肝功能、血清SOD、GSH及肝組織MDA檢測(cè)：取靜脈血100μL，3000 r/min離心15 min， 離心半徑87mm，分離出血清。按試劑盒說(shuō)明測(cè)定小鼠血清TBil、AST、GGT、TBA、ALT水平。 小鼠取血后剪開(kāi)腹部，取50mg肝組織，搗碎研磨，加入200μL 緩沖液勻漿，5000 r/min離心15min，取肝組織勻漿液的上清液檢測(cè)MDA含量[8]。

2. 結(jié)果

2.1 3組小鼠兩時(shí)段血清HBV DNA檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 3組小鼠兩時(shí)HBV DNA.檢測(cè)結(jié)果比較

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組同時(shí)段比較，△P<0.05；與本組成模8h比較，#P<0.05

2.2 3組小鼠兩時(shí)段肝功能檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 3組小鼠肝功能指標(biāo)比較

與對(duì)照組同時(shí)段比較，*P<0.05；與模型組治療7d時(shí)比較，△P<0.05；與本組成模 8 h比較，#P<0.05

2.3 九味肝泰對(duì)小鼠血清SOD、GSH和肝組織MDA的影響 見(jiàn)表3。

表3 3組小鼠血清SOD、GSH和肝組織MDA結(jié)果比較

與對(duì)照組同時(shí)段比較，*P<0.05；與模型組治療7d時(shí)比較，△P<0.05；與本組成模 8 h比較，#P<0.05

3 討論

ConA是T細(xì)胞絲裂原,是從刀豆中提取的一種植物凝聚蛋白，有較強(qiáng)的嗜肝性,ConA可與多種細(xì)胞表面糖分子殘基結(jié)合，激活T細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子、趨化因子等細(xì)胞因子，引起由T細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟損傷[9]。ConA可在很短時(shí)間內(nèi)(8 h)導(dǎo)致小鼠肝臟T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞大量聚集，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)會(huì)造成血液轉(zhuǎn)氨酶明顯升高[10]。免疫系統(tǒng)在肝炎的發(fā)病過(guò)程中起到重要作用，ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型就是通過(guò)活化T淋巴細(xì)胞引起免疫應(yīng)答而致肝損傷，該模型與GaLN模型相比，更能真實(shí)模擬人類病毒性肝炎引發(fā)的免疫性肝損傷[11]。

從模型組及九味肝泰組小鼠成模8 h時(shí)HBV DNA定量分析來(lái)看，HBV DNA實(shí)時(shí)定量指標(biāo)均為陽(yáng)性，然后從尾靜脈注射ConA試劑(12mg/kg)8 h，肝功能五項(xiàng)均顯著升高，符合感染HBV后急性免疫性肝損傷情況，HBV DNA在復(fù)制時(shí)會(huì)破壞肝細(xì)胞，同時(shí)，ConA激活T細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子、趨化性因子等細(xì)胞因子，引起由T細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟損傷，此時(shí)肝細(xì)胞大量變性、壞死， 肝細(xì)胞膜通透性增加，胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶AST、TBil、GGT、TBA、ALT大量溢出到血漿中，轉(zhuǎn)氨酶升高是急性肝損傷的重要判斷指標(biāo)[12]。在治療7 d后，九味肝泰組小鼠AST、TBil、GGT、TBA、ALT基本恢復(fù)到對(duì)照組水平。九味肝泰由五味子、大黃(酒制)、姜黃、三七、郁金、蜈蚣、山藥、黃芩和蒺藜等中藥精制而成。其味苦氣微，具有化瘀通絡(luò)、健脾疏肝的作用，臨床用于氣滯血瘀兼肝郁脾虛患者[5]。九味肝泰組小鼠轉(zhuǎn)氨酶降低應(yīng)與九味肝泰活血化瘀，增加肝組織血流量，改善肝組織內(nèi)微循環(huán)等作用有關(guān)[13]。本觀察還發(fā)現(xiàn)，九味肝泰組小鼠在治療7d后，MDA較模型組明顯降低，SOD、GSH 明顯增高，這提示九味肝泰可抑制刀豆蛋白A誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷時(shí)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，清除機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基。組方中姜黃含有的姜黃素、三七的三七皂苷、大黃的大黃素等均能降低機(jī)體氧自由基，這可能是其機(jī)制之一[14]。

總之，九味肝泰可能通過(guò)抑制ConA誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷時(shí)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，促進(jìn)肝功能恢復(fù)。但急性免疫性肝損傷是由T細(xì)胞介導(dǎo)而引起的，九味肝泰降酶機(jī)制復(fù)雜，也有可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，改善Thl和Th2免疫調(diào)節(jié)水平來(lái)達(dá)到降酶護(hù)肝的目的。但本實(shí)驗(yàn)未記錄這方面的生化指標(biāo)，其對(duì)細(xì)胞凋亡和T淋巴細(xì)胞功能的干預(yù)機(jī)制將在下一步進(jìn)行研究。

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TheinterventionstudyonacuteimmuneC57BL/6JmiceliverinjurymodelofninekindsofGantaiinducedbytheConcanavalinA

DENGWei-ping1,ZhENGHong-mei2,LISheng-bao1,CHENDe-sen△etal.

1.Departmentofdigestivemedicine,ShiyanTaiheHospital(theAffiliatedHospitalofHubeiMedicalCollege)(Shiyan,Hubei,442000)China

2016-9-18 編輯：韋 怡)

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.01.015

湖北省教育指導(dǎo)項(xiàng)目(No.B2016125)；△通訊作者，E-mail：dwpdenweipinjob@163.com