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    水體總毒性在線檢測儀器的研制

    2017-10-16 06:45:31翟俊峰余登斌董紹俊
    分析化學 2017年9期
    關(guān)鍵詞:在線檢測微生物

    翟俊峰 余登斌+董紹俊

    摘要研制了基于電化學媒介體法的水體總毒性在線檢測儀器, 通過對比水樣和標樣中微生物的呼吸活性差異, 實現(xiàn)對水體總毒性的在線監(jiān)測。毒性檢測的受試體微生物為原位培養(yǎng)微生物。電化學檢測采用三電極系統(tǒng), 其中鉑微陣列電極、Ag/AgCl(3 mol/L KCl)電極和金絲電極分別作為工作電極、參比電極和對電極。對濃度為5.0、10.0和20.0 mg/L的模型毒物3,5二氯苯酚(DCP)進行檢測, 獲得的微生物呼吸活性抑制率分別為24.4%、48.9%和59.2%。在連續(xù)在線監(jiān)測過程中, 儀器能夠?qū)λ须S機加入毒性物質(zhì)(5.0 mg/L DCP)的水樣輸出毒性警報(以10%的呼吸抑制率為毒性報警臨界值), 表明此儀器可以用于水體總毒性在線檢測和預(yù)警。

    關(guān)鍵詞水體急性毒性;在線檢測;微生物;呼吸抑制

    1引言

    隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展, 我國的水體環(huán)境日益惡化, 突發(fā)性水污染事件日益頻繁。為了保障居民的用水安全和準確評估復(fù)合污染程度, 有必要進行水體急性毒性的在線檢測。傳統(tǒng)的生物毒性檢測方法多基于生物終點的方法, 例如:死亡率、生長率、繁殖率等。采用的受試體則包括高等動物浮游生物(D. magna)、藻類、魚類等。但是, 這些方法耗時長、成本高、需要專業(yè)的測試人員, 且存在道德爭議[1~3]。近年來, 基于微生物的水體急性毒性檢測方法得到快速的發(fā)展, 其中較為成熟的是以海洋細菌費希爾弧菌(Vibro fischeri)為毒性檢測受試體的發(fā)光細菌法[4~6]。然而, 考慮到實際水體的濁度和色度對光學檢測的影響、檢測所需的高鹽度對水體急性毒性測試結(jié)果的影響、較高的費希爾弧菌價格, 以及單一菌種對毒性的選擇性, 發(fā)光細菌法在水體急性毒性的在線檢測應(yīng)用中受到一定的限制。

    媒介體法是以微生物的呼吸抑制作用為毒性響應(yīng)機理, 并以媒介體分子代替氧氣作為微生物呼吸鏈中的電子受體, 最終通過檢測媒介體分子的電化學信號實現(xiàn)水體急性毒性的快速檢測[7~10]。2010年王學江等[11]開發(fā)了基于媒介體法的多通道生物毒性傳感器, 該儀器通過使用固定有微生物的一次性生物芯片解決了微生物受試體的供給與電極污染問題, 適合實驗室測試及應(yīng)對突發(fā)事件的野外現(xiàn)場檢測, 但是仍然需要人工更換芯片, 無法進行水體總毒性的自動在線檢測。

    本研究在前期工作的基礎(chǔ)上, 開發(fā)了基于媒介體法的水體總毒性在線檢測儀器。此儀器使用低溫保存的原位培養(yǎng)微生物作為毒性檢測受試體。建立了新的電極維護方法, 解決了電極的污染問題, 保證了在線檢測數(shù)據(jù)的準確性與穩(wěn)定性。使用此儀器對含有5.0、10.0和20.0 mg/L模型毒物3,5二氯苯酚(DCP)的水溶液進行檢測, 測得的微生物呼吸活性抑制率分別為24.4%、48.9%和59.2%。 此外, 在線連續(xù)測試過程中, 儀器能夠?qū)λ须S機加入的含有5.0 mg/L DCP的毒性樣品進行毒性報警。結(jié)果表明, 此儀器不僅可以連續(xù)、自動檢測水體總毒性, 還可用于水體總毒性的預(yù)警。

    2實驗部分

    2.1儀器與試劑

    802離心機 (浙江力辰儀器科技有限公司); AtA7500氣泵(中山市創(chuàng)星電器有限公司); DK8AD恒溫水浴槽 (常州市國旺儀器制造有限公司); 酵母浸出粉(BR, 北京奧博星生物技術(shù)有限公司); 蛋白胨(BR, 北京奧博星生物技術(shù)有限公司); NaCl、K3Fe(CN)6(分析純, 阿拉丁試劑有限公司); DCP(SigmaAldrich公司)。1000 mL去離子水中加入100 g酵母浸出粉、40 g蛋白胨和100 g NaCl, 121℃濕熱滅菌15 min, 冷卻后獲得微生物培養(yǎng)基母液, 在4℃保存, 備用。5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液用去離子水配制, 室溫避光放置于儀器內(nèi)的藥品儲存杯中。

    2.2微生物培養(yǎng)

    用目標水(本研究為地下水)將微生物培養(yǎng)基母液稀釋至所需體積, 稀釋后的液體培養(yǎng)基濃度為母液的1/10。然后將此液體培養(yǎng)基在37℃恒溫水浴中恒溫并用氣泵爆空氣。14 h后, 離心收集微生物, 重新分散到體積為初始體積1/4的新鮮培養(yǎng)基中[12]。隨后, 將此微生物溶液培養(yǎng)基于4℃保存, 或加入儀器的微生物溶液儲藏罐中。

    2.3毒性在線檢測

    2.3.1毒性檢測原理此儀器使用微生物作為毒性檢測受試體,并以微生物的呼吸抑制作用作為毒性響應(yīng)原理[13]。當毒性物質(zhì)存在時,微生物的呼吸活性受到抑制, 從而導致單位時間內(nèi)微生物傳遞給人工電子媒介體 (K3Fe(CN)6)的電子的量減少, 即生成的K4Fe(CN)6的量減少。因此, 通過采用電化學方法檢測K4Fe(CN)6的生成量, 即可實現(xiàn)對微生物呼吸活性的測試, 進一步通過對比微生物在水樣和標樣中的呼吸活性差異可實現(xiàn)對水體毒性的檢測, 如圖1所示。毒性的強度用呼吸抑制率表示, 其計算公式如圖1所示。其中it是毒性物質(zhì)存在條件下的K4Fe(CN)6陽極氧化的極限電流值, in是沒有毒性物質(zhì)存在條件下的K4Fe(CN)6陽極氧化的極限電流值。在線毒性檢測過程中, 以10%的抑制率為毒性報警的預(yù)警值。抑制率超出10%時, 儀器輸出報警。

    2.3.2儀器結(jié)構(gòu)及測試流程水體總毒性在線分析儀由機械部分和電子控制部分組成(見圖2)。其中機械部分包含線性導軌、蠕動泵、轉(zhuǎn)臺、注射泵、電磁閥等, 用于實現(xiàn)反應(yīng)器的轉(zhuǎn)換、電極的移動、樣品的加入、反應(yīng)器清洗等操作。電子部分負責控制機械部分的運動并完成采集信號的處理和輸出。電化學檢測器采用三電極結(jié)構(gòu), 其中工作電極為鉑微陣列電極, 參比電極為Ag/AgCl(3 mol/L KCl)參比電極, 對電極為金絲電極。工作電極的電位為0.4 V。儀器有3組反應(yīng)器, 分別位于加樣、反應(yīng)和檢測位置, 利用轉(zhuǎn)臺控制3組反應(yīng)器的位置循環(huán)轉(zhuǎn)換, 實現(xiàn)清洗、加樣、反應(yīng)過程同時進行, 縮短檢測時間, 保證儀器的連續(xù)運行。每組反應(yīng)器中包括兩個反應(yīng)池, 即水樣反應(yīng)池和標樣反應(yīng)池。endprint

    樣品測試流程:利用蠕動泵將20 mL水樣和標樣分別加入到水樣和標樣反應(yīng)池, 用注射泵向兩個反應(yīng)池中分別加入1 mL微生物和K3Fe(CN)6溶液, 并曝氣混勻。待混合溶液反應(yīng)1 h后, 機械臂懸掛的電化學檢測探頭分別浸入水樣和標樣進行電化學檢測, 獲取電流值it和in, 單個樣品的檢測結(jié)束。每次檢測結(jié)束后, 反應(yīng)池中加入1 mol/L NaOH溶液浸泡約20 min, 避免反應(yīng)池內(nèi)壁生成生物膜。電化學檢測探頭不工作時浸泡在9% (w/w)NaCl溶液中。樣品檢測前30 min, 電化學檢測器浸入前一樣品反應(yīng)液中, 進行電極表面鈍化處理直至開始當前樣品檢測, 當樣品檢測完成后, 電化學檢測器重新浸泡到9% (w/w) NaCl溶液中。

    3結(jié)果與討論

    3.1工作電極的維護

    電極污染問題是電化學在線分析儀器的普遍問題。本儀器在測試過程中需要使用分散到培養(yǎng)基中的微生物, 因此微生物的加入必然給測試溶液帶來大量的有機物。這些有機物可以通過氫鍵或者庫倫作用等方式吸附到電極表面, 導致電極的電化學活性面積減小。為了解決吸附污染的問題, 本研究采用了本研究組前期工作[14]中的策略, 即利用吸附動力學隨吸附時間延長而快速下降的特點, 在工作電極表面預(yù)先吸附有機物, 從而使得電極在測試樣品時表現(xiàn)出較慢的有機物吸附動力學, 進而保證測試數(shù)據(jù)的穩(wěn)定。如圖3A所示, 當標準樣和測試樣為同一水源時, 工作電極連續(xù)測試水樣和標準樣的電流值一致, 因此, 預(yù)先吸附的方法能夠抑制檢測過程中有機物在電極表面發(fā)生吸附。然而, 水樣和標準樣的測試電流強度都表現(xiàn)出隨時間延長而增大的特性, 這一特性表明, 電極表面生長了微生物膜。為抑制電極表面微生物的生長, 加入了將電極浸入到9% (w/w) NaCl溶液中的步驟, 利用滲透壓變化引起微生物脫水死亡。由圖3B可見, 增加的9% (w/w)NaCl溶液浸泡過程, 水樣和標準樣的測試極限電流值強度基本穩(wěn)定不變, 表明微生物在電極表面的生長得到抑制。因此, 儀器使用的電極維護方法為在電極處于空閑時間時, 將電極連續(xù)浸泡在9% NaCl(w/w)溶液中和前一組水樣測試溶液中, 其中在水樣測試溶液中的浸泡時間固定為30 min, 以保證有機物的充分吸附。

    3.2反應(yīng)池的清洗

    與懸浮微生物相比, 微生物膜對毒性物質(zhì)具有更高的耐受性, 因此當反應(yīng)池中有微生物膜生成時, 會降低儀器對毒性物質(zhì)的檢測靈敏度。以5 mg/L DCP為例, 當反應(yīng)器內(nèi)壁有微生物膜時, 其對受試體微生物的呼吸活性抑制率測試值約為6%。因此每次測試之后, 都會在反應(yīng)池中加入約20 mL 1 mol/L NaOH溶液浸泡30 min, 利用強堿性溶液殺滅吸附在反應(yīng)池內(nèi)表面的微生物, 避免微生物膜的生成。

    3.3水體總毒性的在線分析

    在確定儀器維護方法的基礎(chǔ)上, 以地下水為檢測水體, 進行水體總毒性的在線連續(xù)測試。儀器用的標準水是相同來源的地下水(假設(shè)地下水無毒)。儀器在連續(xù)運行過程中, 隨機對濃度為5.0、10.0和20.0 mg/L的DCP進行檢測, 獲得的微生物呼吸活性抑制率均值分別為24.4%、48.9%和59.2%, 展現(xiàn)了很好的劑量依賴的毒性響應(yīng)特性。需要指出的是, 由于毒性物質(zhì)對不同微生物的呼吸抑制效果不同, 當使用不同的微生物進行毒性測試時, 所得呼吸抑制率不同[15]。微生物對毒性物質(zhì)響應(yīng)的差異表明, 使用原位微生物種群進行毒性測試, 能夠更有效反映復(fù)合污染對目標水體生態(tài)環(huán)境的影響。雖然使用DCP作為毒性物質(zhì)進行測試, 但是實際測試的毒性響應(yīng)是DCP與水中物質(zhì)綜合作用后的結(jié)果, 并非是單純DCP與微生物作用的結(jié)果。當使用此儀器對自來水進行檢測時, 5.0 mg/L DCP的微生物呼吸抑制率為50.0%, 明顯高于用地下水時檢測獲得的呼吸抑制率值。

    毒性預(yù)警是水體總毒性在線分析儀的主要功能, 本儀器將10%微生物呼吸活性抑制率作為毒性預(yù)警臨界值, 當呼吸抑制率超出10%, 輸出毒性報警信號。圖4是儀器連續(xù)運行所得的抑制率圖, 儀器在連續(xù)測試過程中能夠?qū)? mg/L DCP的水樣進行報警, 表明儀器具有很好的穩(wěn)定性和可靠性。

    4結(jié) 論

    研發(fā)了基于媒介體法的水體總毒性在線分析儀器, 采用新穎的維護方法, 解決了電極污染、反應(yīng)池微生物生長等問題, 保證了測試信號的穩(wěn)定性和檢測結(jié)果的可靠性。儀器的毒性報警功能, 可在突發(fā)水污染事件中確保用水安全。使用原位微生物作為毒性檢測受試體, 能夠更加有效反映水環(huán)境污染情況, 用于地表水的總毒性在線檢測, 可為地表水環(huán)境復(fù)合污染評估及治理效果評估提供依據(jù)。

    致 謝感謝吉林光大分析技術(shù)有限公司為儀器組裝和測試提供的幫助。

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    An Online Equipment for Monitoring of Water Total Toxicity

    ZHAI JunFeng*, YU DengBin, DONG ShaoJun

    (State Key Laboratory of Electroanalytical Chemistry, Changchun Institute of Applied Chemistry,

    Chinese Academy of Sciences, Changchun 130022, China)

    AbstractThe monitoring of total toxicity of water is of great importance to guarantee the safety of drinking water and estimate the level of water pollution from multiple pollutants. Here, we reported an online equipment for monitoring toxicity of water, where insite cultured microorganisms were used as the test organism and respiratory inhibition of microorganisms was regarded as the toxicity response. A threeelectrode electrochemical detector was integrated in the equipment, where an array electrode composed of microsized Pt disks, a Ag/AgCl (3 mol/L KCl) electrode and a gold wire were used as the working, reference and counter electrodes, respectively. The average respiratory inhibition ratios obtained with this equipment for 5.0, 10.0, 20.0 mg/L 3,5dichlorophenol (DCP) were 24.4%, 48.9% and 59.2%, respectively. The equipment was further used for continuous online monitoring of the total toxicity of underground water, and successfully showed the toxicity alarm when challenged randomly by toxicity samples containing 5.0 mg/L DCP. The present results suggested the good promise of the equipment in online monitoring of water total toxicity.

    KeywordsWater total toxicity; Online detection; Microorganism; Respiratory inhibition.

    (Received 25 May 2017; accepted 5 July 2017)

    This work was supported by Ministry of Science and Technology of China (Nos. 2016YFA0203200,2013YQ170585), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 21675151,21405148) and the Foundation of Young Scholars of Jilin Province, China (No. 20150520010JH).endprint

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