• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于萘酰亞胺的生物硫醇探針的合成及對含硫醇氨基酸的檢測

    2017-10-16 20:18:32郭靖劉慶文杜建時孔祥怡宋巖楊清彪趙晴李耀先
    分析化學(xué) 2017年9期
    關(guān)鍵詞:同型半胱氨酸谷胱甘肽半胱氨酸

    郭靖 劉慶文 杜建時 孔祥怡 宋巖 +楊清彪+趙晴 李耀先

    摘要合成了以4羥基萘酰亞胺為熒光團,2,4二硝基苯磺酰氧基為特異性識別基團的生物硫醇探針4(2,4二硝基苯磺酰氧基)正丁基1,8萘酰亞胺(DNSBN)。吸收光譜和熒光光譜結(jié)果表明, DNSBN對半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)3種生物硫醇分子具有高效的檢測識別能力,不受其它17種天然氨基酸的干擾。同時,通過熒光滴定實驗證實了此探針是一種比率型探針,555 nm處的熒光強度與溶液中的生物硫醇分子濃度在0 ~ 20 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,對Cys、Hcy和GSH的檢出限(3σ)分別為25.9、92.0和77.9 nmol/L。而吸收光譜、熒光光譜和質(zhì)譜表征數(shù)據(jù)顯示,生物硫醇與2,4二硝基苯磺酸酯發(fā)生親核取代反應(yīng)并導(dǎo)致磺酸酯的分解。隨著識別基團的解離,探針分子的dPeT (donorexcited photoinduced electron transfer) 效應(yīng)被解除,并出現(xiàn)非常明顯的比色與熒光變化。HeLa細胞成像實驗表明,探針DNSBN具有良好的生物相容性,能夠?qū)毎庠葱陨锪虼挤肿舆M行檢測。

    關(guān)鍵詞熒光探針; 萘酰亞胺; 半胱氨酸; 同型半胱氨酸; 谷胱甘肽

    1引 言

    生物硫醇(包括半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽)是與人體健康息息相關(guān)的重要物質(zhì),其含量出現(xiàn)異常時,就會產(chǎn)生某些疾病。例如肝損傷、浮腫、頭發(fā)脫色或兒童生長緩慢,都與體內(nèi)半胱氨酸(Cys)含量異常有關(guān)[1~3];血清中同型半胱氨酸(Hcy)是心腦血管疾病的一種標志物[4,5],老年人的髖骨骨折和阿爾茲海默病等疾病也被認為與其密切相關(guān)[6~9];谷胱甘肽(GSH)作為一種重要抗氧化劑,對維持細胞內(nèi)部的還原環(huán)境和保護細胞器免收活性氧(ROS)的損害起著重要作用[10]。目前,生物硫醇檢測已經(jīng)成為某些疾病診斷的重要依據(jù)。

    傳統(tǒng)的分析檢測生物硫醇的方法如高效液相色譜法[11~13]、質(zhì)譜法[14]、毛細管電泳法[15]、比色分析法[16~18]、電化學(xué)分析法[19]等,雖然具有檢出限低、重現(xiàn)性好、精確度高等優(yōu)點,但也存在一些明顯的缺陷,如檢測成本高、預(yù)處理復(fù)雜、難以用于體內(nèi)檢測等,限制了其進一步的發(fā)展和應(yīng)用。有機熒光傳感器由于操作簡單、能夠?qū)崟r檢測及可用于體內(nèi)檢測等優(yōu)勢,近年被廣泛用于生物、醫(yī)療和環(huán)境檢測領(lǐng)域。目前,針對生物硫醇檢測的熒光探針可以分為反應(yīng)型熒光探針與配位絡(luò)合型熒光探針兩類,主要通過邁克爾加成[20]、醛的環(huán)化[21]、二硫鍵的斷裂[22]或其它識別機理[23,24]進行識別。但這些探針大都存在檢測限較高、不能在中性環(huán)境中使用以及合成復(fù)雜等問題。近年來,以2,4二硝基苯磺酰氧基/胺基為識別基團的熒光探針引起了研究者的關(guān)注[25,26]。該類探針利用硝基的強吸電子作用,使探針分子在激發(fā)態(tài)時出現(xiàn)dPeT (Donorexcited photoinduced electron transfer) 效應(yīng),從而引起熒光淬滅。而生物硫醇的引入導(dǎo)致分子內(nèi)的苯磺酰氧基/胺基的離去,dPeT效應(yīng)被抑制,熒光團的固有熒光得以發(fā)射。這類探針具有合成簡單、檢測限低、靈敏度高等優(yōu)點,具有很好的實際應(yīng)用價值。

    本研究計合成了以萘酰亞胺為熒光團、2,4二硝基苯磺酰氧基為識別基團的比率型生物硫醇熒光探針4(2,4二硝基苯磺酰氧基)正丁基1,8萘酰亞胺 (4(2,4Dinitrophensulfonyloxy)nbutyl1,8Naphthalimide, DNSBN),實現(xiàn)了中性環(huán)境下對生物硫醇的檢測,Cys、Hcy和 GSH的熒光檢出限分別為2.59×10

    Symbolm@@ 8 mol/L、9.20×10

    Symbolm@@ 8 mol/L和7.79×10

    Symbolm@@ 8 mol/L,并具有很好的細胞成像檢測能力。

    2實驗部分

    2.1儀器與試劑

    AV400(MHz)型核磁共振波譜儀(美國Bruker公司):Agilent1290micrOTOF Q II型液相色譜質(zhì)譜分析儀(美國Agilent公司); F4500熒光光譜儀, U3010紫外可見吸收光譜儀(日本日立公司);IX71F22FL型熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

    N2羥乙基哌嗪N′ 2乙磺酸(HEPES)和N乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)(分析純,阿拉?。ㄉ虾#┰噭┯邢薰荆?;2,4二硝基苯磺酰氯和谷胱甘肽(分析純,薩蒽化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司);半胱氨酸(分析純,98.5%,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);同型半胱氨酸(分析純,95%,SigmaAldrich公司);無甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、賴氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈胺酸和蘇氨酸(分析純,北京百靈威科技有限公司 (J&K Chemical));DMEM細胞培養(yǎng)基(ThermoFisher Scientific 公司);其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

    2.2實驗方法

    2.2.1探針DNSBN的合成中間體1、2和NIOH按照文獻[27]的方法合成,如圖1所示: 在100 mL圓底燒瓶中,加入20 mL無水四氫呋喃、0.45 g(1.67 mmol)NIOH和350 μL(2.5 mmol)三乙胺,0℃下攪拌15 min,隨后緩慢滴加含有0.49 g(1.84 mmol)2,4硝基苯磺酰氯的15 mL無水四氫呋喃,室溫攪拌5 h,加2 mL水淬滅反應(yīng),減壓蒸干溶劑,洗滌、抽濾,真空干燥,將得到的粗產(chǎn)物用二氯甲烷/石油醚(3∶1, V/V)柱層析洗脫分離,得到0.54 g淡黃色的探針DNSBN,產(chǎn)率64.7%。1H NMR (400 MHz, d6DMSO) δ 9.17 (d, J=2.2 Hz, 1H), 8.62 (dd, J=8.7, 2.2 Hz, 1H), 8.56 (d, J =7.2 Hz, 1H), 8.47 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.38 (d, J=7.3 Hz, 1H), 8.36 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.95 (t, J=7.9 Hz,endprint

    2.2.2測試前溶液的配制以及測試參數(shù)配制5 × 10

    Symbolm@@ 3 mol/L DNSBN的乙腈溶液,儲存于冰箱中,各種氨基酸和谷胱甘肽各自配制成0.01 mol/L的溶液 (20 mmol/L HEPES緩沖液,pH=7.4),低溫保存。移取DNSBN原液用pH=7.4的乙腈HEPES(1∶1,V/V)緩沖液稀釋濃度為1.0 × 10

    Symbolm@@ 5 mol/L,用于DNSBN對各種氨基酸的比色與熒光的裸眼識別測試。移取0.5 mL DNSBN原液,并用pH=7.4的乙腈HEPES(1∶1,V/V)緩沖液稀釋至5.0 × 10

    Symbolm@@ 6 mol/L的DNSBN溶液,用于探針的熒光發(fā)射光譜測試。激發(fā)波長為456 nm,激發(fā)與發(fā)射狹縫均為5 nm。各待檢測物與探針的作用時間均為90 min,溫度為室溫(25℃)。

    2.2.3細胞培養(yǎng)與細胞成像實驗參照文獻[29]方法,在37℃,5% CO2的氣氛中,HeLa細胞在含有10%(V/V)胎牛血清 (FBS)的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在細胞成像前,HeLa細胞接種在24孔板中并孵育24 h,向一部分HeLa細胞加入2 μmol/L探針并孵育30 min;用HEPES緩沖液清洗細胞3次。用熒光顯微鏡觀察,暗場下HeLa細胞發(fā)出黃綠色熒光。另一部分HeLa細胞在加入2 μmol/L探針前,先用5 mmol/L N乙基馬來酰亞胺(NEM,生物硫醇抑制劑)預(yù)處理30 min,熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細胞的熒光強度明顯減弱。由此證實了活細胞內(nèi)部存在大量的生物硫醇。向已被NEM處理的含有熒光探針的HeLa細胞中再分別加入40 μmol/L 半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽,37℃下繼續(xù)孵育1 h,用HEPES緩沖液清洗3次,并用熒光顯微鏡進行細胞成像觀察。

    3結(jié)果與討論

    3.1探針DNSBN對生物硫醇的裸眼識別

    向10 μmol/L DNSBN溶液中分別加入200 μmol/L的19種氨基酸以及谷胱甘肽,觀察探針溶液的比色與熒光變化情況(圖2)。結(jié)果表明,加入半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽后,溶液由無色變?yōu)辄S色,并在365 nm紫外光下發(fā)出強烈的黃綠色熒光;而加入另外17種氨基酸時,溶液未出現(xiàn)明顯變化。

    3.2探針的紫外可見吸收滴定實驗

    向DNSBN溶液中分別加入不同濃度的生物硫醇,得到DNSBN對Cys、Hcy和GSH的紫外可見吸收滴定曲線。當3種生物硫醇的濃度分別從0增加到500 μmol/L時,吸收光譜均在450 nm處出現(xiàn)明顯的吸收峰;以生物硫醇濃度為橫坐標,(A/A0-1)為縱坐標(A 為450 nm處吸收峰強度,A0為未加入生物硫醇時吸收峰強度),結(jié)果如圖3所示。在檢測Cys時,當Cys濃度增加到200 μmol/L后,峰強度達到穩(wěn)定值;GSH則在250 μmol/L以上濃度時,吸收峰強度達到穩(wěn)定值;Hcy在300 μmol/L以上,450 nm處吸收值達到穩(wěn)定值。上述結(jié)果說明,在相同條件下,3種氨基酸與探針反應(yīng)的活性略有差異,依次為Cys>GSH>Hcy。

    3.3熒光滴定實驗

    考察溶液pH值對DNSBN探針與生物硫醇分子反應(yīng)的熒光強度的影響,結(jié)果如圖4所示,當pH<4.5時,無論生物硫醇加入與否,探針的熒光強度均很弱,這可能是由于溶液酸性過大,不利于巰基親核反應(yīng)的進行;當pH>4.5,隨著溶液pH值增加,DNSBN溶液的熒光強度逐漸增加;

    對于Cys和GSH,溶液pH值達到7.0后,再增大pH值,熒光強度不再出現(xiàn)明顯變化。而對于Hcy,當溶液pH值達到9.0后,熒光強度才不再明顯增大。以上現(xiàn)象說明,Cys與GSH的巰基性質(zhì)比較接近,Hcy的巰基有所不同,推測認為同型半胱氨酸中巰基的性質(zhì)比較類似于羧基,因此在堿性條件下檢測Hcy才更為有利。同時,當溶液的pH>8.0后,即使不加入生物硫醇,探針的熒光強度也明顯增強,說明探針在強堿性環(huán)境下苯磺酸酯基會發(fā)生分解。因此,檢測3種生物硫醇的合適pH范圍為6.0~8.0,考慮到人體生理pH=7.35~7.45,因此后續(xù)測試時pH值選擇pH=7.4。

    在5 μmol/L DNSBN溶液中逐漸加入3種生物硫醇(每次增加濃度均為2.5 μmol/L),分別得到DNSBN對Cys、Hcy和GSH的熒光滴定曲線,如圖5所示。隨生物硫醇濃度逐漸增加,探針在555 nm處的熒光強度逐漸增大;在相同濃度時,Cys對探針溶液的熒光強度影響最大。上述實驗結(jié)果進一步說明探針與Cys的反應(yīng)活性最強,這與吸收光譜的實驗結(jié)果一致。

    5 μmol/L, 20 mmol/L HEPES (pH 7.4)ACN (1∶1, V/V), λex=456 nm, 狹縫: 5 nm/5 nm。

    Fig.5Fluorescence intensity of DNSBN in buffer solution with the increasing of Cys (A), Hcy (B) or GSH (C), the internal graph exhibits that fluorescence intensity of DNSBN at 555 nm with the increasing of biothiols. Concentration of DNSBN is 5 μmol/L; 20 mmol/L HEPES (pH 7.4)ACN (1∶1, V/V). λex=456 nm, slit width: 5 nm/5 nm

    以圖5中的Cys濃度為X軸,對應(yīng)濃度下的555 nm處熒光強度(I)與未加入生物硫醇時熒光強度(I0)的比值(I/I0)作為Y軸,得到Cys熒光滴定曲線的散點圖(圖6),從圖6A可見,Cys濃度在25.9 nmol/L~20 μmol/L濃度范圍內(nèi),I/I0與Cys濃度有很好的線性關(guān)系,回歸方程為Y =3.50324 X + 5.13217,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9916,檢出限(3σ)為25.9 nmol/L。如表1所示,本方法的檢出限明顯低于一些文獻報道的探針[28,32]。 同樣,根據(jù)圖6B與6C,得到檢測Hcy和GSH的線性回歸方程分別為Y=1.44533X + 2.26647和Y=1.70686X + 5.42335,線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9974與 0.9921,線性范圍分別為92.0 nmol/L~20 μmol/L和77.9 nmol/L~20 μmol/L,檢出限分別為92.0 和77.9 nmol/L。endprint

    3.4探針的選擇性和競爭性實驗

    為進一步確認DNSBN對檢測異生物硫醇的特性,采用紫外可見吸收光譜和熒光光譜考察了探針對19種氨基酸以及谷胱甘肽的響應(yīng)情況。結(jié)果表明,除Cys、Hcy或GSH 3種生物硫醇分子外,10倍濃度的其它氨基酸對吸收光譜以及熒光光譜沒有明顯影響。對于紫外可見吸收光譜,引入生物硫醇后,350和450 nm處出現(xiàn)兩處非常明顯的吸收峰,而其它17種干擾性氨基酸則不會引起上述變化(圖7A)。

    熒光光譜實驗表明(圖7B),向DNSBN溶液中加入其它氨基酸后,熒光強度幾乎沒有變化。只有加入3種生物硫醇分子后,555 nm處的熒光才出現(xiàn)明顯增強,這進一步證實了DNSBN對生物硫醇有選擇性。向探針溶液中引入各種干擾氨基酸(Hcy與GSH的濃度為100.0 μmol/L,其它氨基酸濃度為1.0 mmol/L)的同時,再加入100.0 μmol/L Cys,發(fā)現(xiàn)即使在高濃度干擾氨基酸存在下,DNSBN依然對半胱氨酸具有良好的識別能力(圖7C)。

    3.5探針的識別機理

    為了確定探針DNSBN與生物硫醇反應(yīng)后的產(chǎn)物,分別對DNSBN與Cys、Hcy和GSH的反應(yīng)產(chǎn)物進行質(zhì)譜表征,均出現(xiàn)m/z 270.1的碎片峰(圖8A)。對檢測后所得溶液與NIOH的吸收光譜與發(fā)射光譜進行了比對(圖8B),峰型基本吻合,

    spectra of DNSBN treated with biothiols and NIOH而NIOH的分子離子峰也是m/z 270.1,由此初步證實探針DNSBN與生物硫醇反應(yīng)后轉(zhuǎn)化為NIOH。結(jié)合文獻[25,33]的結(jié)果,推測加入生物硫醇后,硫醇上的巰基與識別基團2,4二硝基苯磺酸酯鍵發(fā)生親核取代反應(yīng),酯鍵斷裂分解,DNSBN轉(zhuǎn)化為NIOH。實驗中發(fā)現(xiàn),由于反應(yīng)前分子內(nèi)存在強吸電子基團——硝基, 致使激發(fā)態(tài)的DNSBN分子出現(xiàn)dPeT (Donorexcited photoinduced electron transfer) 效應(yīng),熒光團萘酰亞胺的熒光發(fā)射被抑制;而加入生物硫醇后,探針的dPeT效應(yīng)被抑制,萘酰亞胺的熒光得以發(fā)射,溶液出現(xiàn)明顯的熒光增強現(xiàn)象。探針的識別機理如圖 1所示。

    3.6探針的細胞成像實驗

    文獻[34]已經(jīng)證實,活細胞內(nèi)存在大量的GSH與Cys,細胞內(nèi)濃度分別為1~10 mmol/L和30~200 μmol/L。因此,在細胞成像實驗中,需要使用生物硫醇抑制劑N乙基順丁烯二酰亞胺 (NEM) 對HeLa細胞進行預(yù)處理[35,36],隨后再加入探針和生物硫醇進行熒光成像。如圖9所示,經(jīng)過NEM處理后的HeLa細胞,加入熒光探針未發(fā)出很強的熒光,而加入Cys、Hcy和GSH后,暗場下可以看到細胞發(fā)出明顯的黃綠色熒光;而從明場下的實驗圖片可見,HeLa細胞的邊緣輪廓完整,細胞形態(tài)正常,從而證實DNSBN的細胞毒性很小,可以在活細胞內(nèi)對外源引入的生物硫醇進行細胞成像。

    4結(jié) 論

    本研究以萘酰亞胺為熒光團、2,4二硝基苯磺酰氧基為識別基團,設(shè)計合成了對生物硫醇(Cys、Hcy和GSH)有特異性熒光和比色雙重檢測性能的染料探針DNSBN。此探針利用生物硫醇能夠與2,4二硝基苯磺酸酯發(fā)生反應(yīng)生成硫醚,dPeT效應(yīng)被抑制,使萘酰亞胺發(fā)出其固有熒光,實現(xiàn)了在中性環(huán)境中對生物硫醇的高效特異性檢測,有望在特定疾病檢測和細胞和體內(nèi)成像中得到應(yīng)用。

    References

    1Wang Y, Zheng J, Zhang Z, Yuan C, Fu D. Colloids Surf. A, 2009, 342(13): 102-106

    2Zhang N, Qu F, Luo H Q, Li N B. Biosens. Bioelectron., 2013, 42: 214-218

    3Shahrokhian S. Anal. Chem., 2001, 73(24): 5972-5978

    4Cattaneo M. J. Thromb. Haemost., 1999, 81(2): 165-176

    5Jager A, Kostense P J, Nijpels G, Dekker M J, Heine J R, Bouter M L, Donker M J, Stehouwer A D. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2001, 21(1): 74

    6McLean R R, Jacques P F, Selhub J, Tucker L K, Samelson J E, Broe E K, Hannan T M, Cupples A L, Kiel P D. N. Engl. J. Med., 2004, 350(20): 2042-2049

    7van Meurs J B J, DhonuksheRutten R A M, Pluijm S M F, van der Klift M, Jonge R, Lindemans J, Groot C P G M L , Hofman A, Witteman C M J , van Leeuwen P T M J, Breteler M B M , Lips P , Pols A P H, Uitterlinden G A. N. Engl. J. Med., 2004, 350(20): 2033-2041

    8Morris M S. Lancet, 2003, 2(7): 425-428

    9Smach M A, Jacob N, Golmard J L, Charfeddine B, Lammouchi T, Ben Othman L, Dridi H, Bennamou S, Limem K. Eur. Neurol., 2011, 65(5): 270-278endprint

    10Townsend D M, Tew K D, Tapiero H, Biomed. Pharmacother., 2003, 57(34): 145-155

    11Ivanov A R, Nazimov I V, Baratova L A. J. Chromatogr. A, 2000, 870(12): 433-442

    12Ivanov A R, Nazimov I V, Baratova L A. J. Chromatogr. A, 2000, 895(12): 157-166

    13Nekrassova O, Lawrence N S, Compton R G. Talanta, 2003, 60(6): 1085-1095

    14Xu K, Zhang Y, Tang B, Laskin J, Roach J.P, Chen H. Anal. Chem., 2010, 82(16): 6926-6932

    15Aléssio A C M, AnnichinoBizzacchi J M, Bydlowski S P, Eberlin N M, Vellasco P A, Hehr F N. Am. J. Med. Genet. A, 2004, 128A(3): 256-260

    16Guo Y, Shao S, Xu J, Shi Y, Jiang S. Tetrahedron Lett., 2004, 45(34): 6477-6480

    17RosLis J V, García B, Jiménez D, MartínezMez R, Sancenón F, Soto J, Gonzalvo F, Valldecabres C M. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126(13): 4064-4065

    18Zhu J, Dhimitruka I, Pei D. Org. Lett., 2004, 6(21): 3809-3812

    19Lee T P, Thomson E J, Karina A, Salter C, Johnston C, Davies G S, Compton G R. Analyst, 2015, 140(1): 236-242

    20Kim G J, Lee K, Kwon H, Kim H. Org. Lett., 2011, 13(11): 2799-2801

    21Rusin O, Luce N N, Agbaria A R, Escobedo O J, Jiang S, Warner M I, Dawan B F, Lian K, Strongin M R. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126(2): 438-439

    22Lee J H, Lim C S, Tian Y S, Han J H, Cho B R. J. Am. Chem. Soc., 2010, 132(4): 1216-1217

    23Shi Y, Yao J, Duan Y, Mi Q, Chen J, Xu Q, Gou G, Zhou Y, Zhang J. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2013, 23(9): 2538-2542

    24FU Xin, GU DanYu, ZHAO ShengDong, WEN ShiTong, ZHANG He. Chinese J. Anal. Chem., 2016, 44(10): 1487-1494

    傅 昕, 顧丹玉, 趙圣東, 溫世彤, 張 何. 分析化學(xué), 2016, 44(10): 1487-1494

    25Wei M, Yin P, Shen Y, Zhang L, Deng J, Xue S, Li H, Guo B, Zhang Y, Yao S. Chem. Comm., 2013, 49(41): 4640-4642

    26Zhang W, Huo F, Liu T, Yin C. Dyes Pigments, 2016, 133: 248-254

    27Liu T, Zhang X, Qiao Q, Zou C, Feng L, Cui J, Xu Z. Dyes Pigments, 2013, 99 (3): 537-542

    28Wei X, Yang X, Feng Y, Ning P, Yu H, Zhu M, Xi X, Guo Q, Meng X. Sens. Actuators B, 2016, 231: 285-292

    29Liao Y,Venkatesan P, Wei L, Wu S. Sens. Actuators B, 2016, 232: 732-737

    30Dai X, Wu Q, Wang P, Tian J, Xu Y, Wang S. Biosens. Bioelectron., 2014, 59: 35-39

    31Sun J, Yang F, Zhao D, Chen C, Yang X. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015, 7 (12): 6860-6866

    32WANG Xue, YANG KunCheng, MAO ZhiYuan, HUANG ChengZhi, WANG Jian. Chinese J. Anal. Chem., 2016, 44(10): 1482-1486

    王 雪, 楊焜誠, 毛智遠, 黃承志, 王 健. 分析化學(xué), 2016, 44(10): 1482-1486endprint

    33Yuan L, Lin W, Zhao S, Gao W, Chen B, He L, Zhu S. J. Am. Chem. Soc., 2012, 134(32): 13510-13523

    34Schafer F Q, Buettner G R. J. Free Radicals Biol. Med., 2001, 30(11): 1191-1212

    35Huo F, Kang J, Yin C, Zhang Y, Chao J. Sens. Actuators B, 2015, 207: 139-143

    36Yin J, Kwon Y, Kim D, Lee D, Kim G, Hu Y, Ryu J, Yoon J. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136: 5351-5358

    Synthesis of Naphthalimidebased Biothiols Probe and

    Detection of Amino Acids Containing Sulfhydryl Groups

    GUO Jing1,2, LIU QingWen2, DU JianShi1, KONG XiangYi1, SONG Yan2,

    YANG QingBiao2, ZHAO Qing*1, LI YaoXian2

    1(Department of Neurology, ChinaJapan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033, China)

    2(College of Chemistry, Jilin University, Changchun 130021, China)

    AbstractA novel probe (DNSBN) towards biothiols on the basis of 4hydroxynaphthalimide as fluorophores and 2, 4dinitrobenzenesulfonyloxy group as specific recognition site was designed and synthesized. The result of absorption and fluorescence spectral analyses indicated that the probe had high sensitivity and selectivity towards cysteine (Cys), homocysteine (Hcy) and glutathione (GSH), and the detection was not affected by other 17 kinds of natural amino acids. Meanwhile, it was confirmed that DNSBN was a ratiometric probe through the fluorescence titration experiment, and the fluorescent intensity at 555 nm had a high linear relationship with biothiols concentration in the range of 0-20 μmol/L. The detection limits (3σ) of Cys, Hcy and GSH were 25.9, 92.0 and 77.9 nmol/L, respectively. The absorption, emission and mass spectra indicated that biothiols could be engaged in nucleophilic substitution reaction with 2,4dinitrobenzenesulfonate, which induced the sulfonic esters decomposed. With the departure of receptor unit, the dPeT progress (donorexcited photoinduced electron transfer) was blocked with an obvious colorimetric and fluorescence change. Finally, HeLa cell imaging experiments verified that DNSBN had good biocompatibility and could be used to detect exogenous biothiols.

    KeywordsFluorescent probe; Naphthalimide; Cysteine; Homocysteine; Glutathione

    (Received 19 May 2017; accepted 20 July 2017)endprint

    猜你喜歡
    同型半胱氨酸谷胱甘肽半胱氨酸
    原發(fā)性高血壓患者血清同型半胱氨酸水平與靶器官損害的關(guān)系
    高血壓病患者血漿同型半胱氨酸與血脂關(guān)系分析研究
    急性腦梗死辨證分型與ADC、Hcy及hs—CRP的相關(guān)性研究
    短暫性腦缺血發(fā)作患者ABCD2評分與血漿同型半胱氨酸水平的關(guān)系
    西安地區(qū)同型半胱氨酸參考區(qū)間的初步建立
    蚯蚓谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶分離純化的初步研究
    分光光度法結(jié)合抗干擾補償檢測谷胱甘肽
    同型半胱氨酸與慢性心力衰竭合并腎功能不全的相關(guān)性分析
    TBBPA對美洲鰻鱺谷胱甘肽代謝相關(guān)指標的影響
    86例同型半胱氨酸與腦梗死相關(guān)性分析
    性色av一级| 久久久精品欧美日韩精品| 2018国产大陆天天弄谢| 一区二区三区乱码不卡18| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产91av在线免费观看| 国产毛片a区久久久久| 久久热精品热| 久久人人爽人人爽人人片va| 色婷婷久久久亚洲欧美| 夜夜爽夜夜爽视频| 日本免费在线观看一区| 亚洲av免费在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品蜜桃在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 男人舔奶头视频| 国产av不卡久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲精品一二三| 1000部很黄的大片| 最近最新中文字幕免费大全7| 嫩草影院精品99| 精品人妻熟女av久视频| 中文字幕久久专区| 身体一侧抽搐| 亚洲自偷自拍三级| 国产精品熟女久久久久浪| av黄色大香蕉| av天堂中文字幕网| 成人国产av品久久久| 观看免费一级毛片| 亚洲成人av在线免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精品一二三| 亚洲精品亚洲一区二区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 丝袜脚勾引网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲成色77777| av免费观看日本| 国产精品女同一区二区软件| 国产一级毛片在线| 成人免费观看视频高清| 少妇人妻久久综合中文| 日本一二三区视频观看| 丝袜喷水一区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一本色道久久久久久精品综合| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产乱人偷精品视频| 国产精品.久久久| eeuss影院久久| 久久久久久久精品精品| 熟妇人妻不卡中文字幕| 人体艺术视频欧美日本| 99久久中文字幕三级久久日本| 好男人视频免费观看在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲在久久综合| 国产精品成人在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美 日韩 精品 国产| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲真实伦在线观看| 搡老乐熟女国产| 99热6这里只有精品| 久热这里只有精品99| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | av卡一久久| 晚上一个人看的免费电影| 欧美激情国产日韩精品一区| 一区二区av电影网| 在线 av 中文字幕| 欧美高清成人免费视频www| 久久久亚洲精品成人影院| 麻豆国产97在线/欧美| 麻豆成人午夜福利视频| 99久久精品一区二区三区| 午夜福利高清视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费av观看视频| 2022亚洲国产成人精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日韩强制内射视频| 色视频在线一区二区三区| 久久精品久久精品一区二区三区| 一本久久精品| 国产精品99久久99久久久不卡 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲av日韩在线播放| 久久久成人免费电影| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美性感艳星| 免费观看的影片在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美成人午夜免费资源| 成人无遮挡网站| 午夜激情福利司机影院| 99久久人妻综合| 精品一区二区三卡| 亚洲最大成人中文| 午夜福利在线观看免费完整高清在| av在线观看视频网站免费| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 免费观看的影片在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 大码成人一级视频| av在线播放精品| 国产淫片久久久久久久久| 热99国产精品久久久久久7| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久久久久性生活片| 看十八女毛片水多多多| 大片电影免费在线观看免费| 美女视频免费永久观看网站| 熟女电影av网| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久热久热在线精品观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 99久久中文字幕三级久久日本| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 精品一区二区免费观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产成人一区二区在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 能在线免费看毛片的网站| 国产色爽女视频免费观看| 91久久精品电影网| 天美传媒精品一区二区| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产爱豆传媒在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 人妻夜夜爽99麻豆av| 九色成人免费人妻av| 人妻系列 视频| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美精品国产亚洲| 成年免费大片在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 三级国产精品片| 亚洲国产日韩一区二区| 有码 亚洲区| 国产精品一二三区在线看| 亚洲色图av天堂| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 久久精品国产自在天天线| 最后的刺客免费高清国语| 免费人成在线观看视频色| 91aial.com中文字幕在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 天堂网av新在线| 亚洲精品视频女| 国产av国产精品国产| 国产 一区 欧美 日韩| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久综合国产亚洲精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产极品天堂在线| 久久韩国三级中文字幕| 久久久欧美国产精品| 精华霜和精华液先用哪个| 婷婷色综合www| 国产午夜精品一二区理论片| 色吧在线观看| 一级av片app| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产高清国产精品国产三级 | 少妇高潮的动态图| 久久久久久国产a免费观看| 免费看日本二区| 九九在线视频观看精品| 日本av手机在线免费观看| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品,欧美精品| videossex国产| 午夜免费观看性视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产淫片久久久久久久久| 一个人看视频在线观看www免费| 我的女老师完整版在线观看| 极品教师在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 免费观看无遮挡的男女| 在线观看人妻少妇| 国产免费福利视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 欧美 日韩 精品 国产| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产精品99久久久久久久久| 国产成人免费观看mmmm| 国产成人免费无遮挡视频| 国产成人a区在线观看| av在线观看视频网站免费| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲伊人久久精品综合| 美女视频免费永久观看网站| 永久网站在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产成人精品一,二区| 国产精品偷伦视频观看了| 最后的刺客免费高清国语| 18+在线观看网站| 少妇人妻 视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 全区人妻精品视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 成人综合一区亚洲| 亚洲欧美成人综合另类久久久| av女优亚洲男人天堂| 久久久久国产网址| 激情五月婷婷亚洲| 成人美女网站在线观看视频| 又大又黄又爽视频免费| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产 一区 欧美 日韩| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 97热精品久久久久久| 97超碰精品成人国产| 少妇人妻久久综合中文| 晚上一个人看的免费电影| 午夜福利网站1000一区二区三区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| kizo精华| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 国产成人精品婷婷| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日本与韩国留学比较| 国产又色又爽无遮挡免| 精品久久国产蜜桃| 免费黄网站久久成人精品| 国产永久视频网站| 国产精品嫩草影院av在线观看| 伦精品一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲精品456在线播放app| 精品熟女少妇av免费看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 91久久精品国产一区二区成人| 欧美潮喷喷水| 99久久中文字幕三级久久日本| 51国产日韩欧美| 亚洲成人av在线免费| 青青草视频在线视频观看| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲怡红院男人天堂| 三级国产精品片| 在线看a的网站| 久久6这里有精品| 波多野结衣巨乳人妻| 国产成人91sexporn| 久久99热6这里只有精品| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲色图综合在线观看| 久久久久久久久久成人| 97在线视频观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 精品国产三级普通话版| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久久久精品性色| 国产成人精品久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产成人午夜福利电影在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 久久久久久久亚洲中文字幕| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 国产精品国产三级专区第一集| 国产在视频线精品| 成人亚洲精品一区在线观看 | 美女内射精品一级片tv| 日本熟妇午夜| 午夜免费鲁丝| 人妻 亚洲 视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 22中文网久久字幕| 国内精品宾馆在线| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产黄片视频在线免费观看| 国产成人一区二区在线| 一级二级三级毛片免费看| 美女被艹到高潮喷水动态| 中国三级夫妇交换| 国产综合懂色| 久久久成人免费电影| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 在线 av 中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 精品久久久噜噜| 美女国产视频在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲av成人精品一二三区| 免费看日本二区| 婷婷色麻豆天堂久久| 婷婷色综合www| 亚洲经典国产精华液单| 欧美激情在线99| 色5月婷婷丁香| 成人特级av手机在线观看| 欧美97在线视频| 成人国产av品久久久| 亚洲精品,欧美精品| 熟女人妻精品中文字幕| 国产爱豆传媒在线观看| 乱系列少妇在线播放| 精品熟女少妇av免费看| 国产亚洲精品久久久com| 三级经典国产精品| 久久韩国三级中文字幕| 久久久久久久久久久免费av| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产探花极品一区二区| 观看美女的网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久ye,这里只有精品| 秋霞伦理黄片| 亚洲国产欧美人成| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲在线观看片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 久久久久久国产a免费观看| 国产成人a区在线观看| 一级毛片 在线播放| 久久精品国产亚洲av天美| 最新中文字幕久久久久| 中文字幕免费在线视频6| 黄片无遮挡物在线观看| 国产一级毛片在线| 欧美bdsm另类| 日本三级黄在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 亚洲av在线观看美女高潮| 久久精品国产自在天天线| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩中字成人| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲av在线观看美女高潮| 男女下面进入的视频免费午夜| 婷婷色av中文字幕| 亚洲天堂av无毛| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | h日本视频在线播放| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 看免费成人av毛片| 国精品久久久久久国模美| 亚洲国产日韩一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| www.av在线官网国产| 青春草亚洲视频在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 九色成人免费人妻av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 大片电影免费在线观看免费| 久久久精品免费免费高清| 大片电影免费在线观看免费| 人妻 亚洲 视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久这里有精品视频免费| 精品久久国产蜜桃| 亚洲精品一二三| 我要看日韩黄色一级片| 久久久久久久久久成人| 欧美zozozo另类| 欧美激情久久久久久爽电影| 美女内射精品一级片tv| 国产精品久久久久久久电影| 99久国产av精品国产电影| 天堂中文最新版在线下载 | 看十八女毛片水多多多| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 久久99热这里只有精品18| av线在线观看网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 2018国产大陆天天弄谢| 成人午夜精彩视频在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 伦精品一区二区三区| 午夜免费鲁丝| 亚洲成色77777| www.色视频.com| videos熟女内射| 成人国产av品久久久| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲国产精品成人综合色| 另类亚洲欧美激情| 欧美精品国产亚洲| av黄色大香蕉| 少妇丰满av| 少妇熟女欧美另类| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品蜜桃在线观看| 久久99精品国语久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美日韩综合久久久久久| 色视频在线一区二区三区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产成人91sexporn| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美区成人在线视频| 亚洲av一区综合| 日韩视频在线欧美| 日韩大片免费观看网站| 久久久久久久国产电影| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产人妻一区二区三区在| 欧美最新免费一区二区三区| 69av精品久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 精品久久久久久久久av| 伊人久久国产一区二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 免费在线观看成人毛片| 色视频www国产| 天堂网av新在线| 精品国产乱码久久久久久小说| 99久久精品热视频| 久久精品国产亚洲网站| 26uuu在线亚洲综合色| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲av福利一区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 欧美zozozo另类| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品成人在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 黑人高潮一二区| 看黄色毛片网站| 午夜免费鲁丝| 国产av码专区亚洲av| 黄色视频在线播放观看不卡| 日本色播在线视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 夫妻午夜视频| 特级一级黄色大片| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久久久九九精品影院| 老司机影院毛片| 少妇人妻 视频| 插阴视频在线观看视频| 色综合色国产| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美97在线视频| 日日撸夜夜添| 国产综合懂色| 免费av毛片视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲真实伦在线观看| 免费在线观看成人毛片| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 水蜜桃什么品种好| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲成人av在线免费| 亚洲高清免费不卡视频| 波野结衣二区三区在线| 国产成人a∨麻豆精品| 不卡视频在线观看欧美| 久久影院123| 中文资源天堂在线| 在线观看国产h片| 97超碰精品成人国产| 久久ye,这里只有精品| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品久久久久久精品电影| 成人二区视频| 国产精品一区二区性色av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲色图av天堂| 色播亚洲综合网| 日本一本二区三区精品| 一区二区av电影网| 亚洲人成网站在线播| 男女下面进入的视频免费午夜| 直男gayav资源| av免费在线看不卡| 国产在线一区二区三区精| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美日韩视频精品一区| 午夜激情福利司机影院| 中文天堂在线官网| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美三级亚洲精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲在久久综合| 亚洲内射少妇av| 亚洲精品国产av蜜桃| 黄片无遮挡物在线观看| 99热全是精品| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人免费观看视频高清| 精品一区在线观看国产| 国产精品国产av在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品夜色国产| 男女啪啪激烈高潮av片| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 毛片一级片免费看久久久久| 精品视频人人做人人爽| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 中文字幕免费在线视频6| 少妇丰满av| 欧美高清性xxxxhd video| 久久国产乱子免费精品| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 最新中文字幕久久久久| 国产久久久一区二区三区| 欧美bdsm另类| 国产乱人偷精品视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 97超视频在线观看视频| 黄色欧美视频在线观看| 夫妻午夜视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 日本爱情动作片www.在线观看| 精品酒店卫生间| 97热精品久久久久久| 永久网站在线| 水蜜桃什么品种好| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 在线观看一区二区三区| av在线app专区| 一级片'在线观看视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 热re99久久精品国产66热6| 日韩制服骚丝袜av| 69av精品久久久久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 色哟哟·www| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲精品成人av观看孕妇| 免费av毛片视频| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品日本国产第一区| 美女主播在线视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 天天躁日日操中文字幕| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| av在线播放精品| 男女啪啪激烈高潮av片| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产精品女同一区二区软件| 欧美三级亚洲精品| 中文字幕亚洲精品专区| 精品一区在线观看国产| 国产精品久久久久久久电影| 久久99热6这里只有精品| 亚洲美女视频黄频| 99热这里只有是精品50| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日本熟妇午夜| 国产亚洲精品久久久com| 夫妻性生交免费视频一级片| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产 一区精品| 亚洲天堂国产精品一区在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 熟女av电影| 在线观看免费高清a一片| 高清午夜精品一区二区三区| 成年人午夜在线观看视频| 精品人妻视频免费看| 亚洲精品一区蜜桃| 一级a做视频免费观看| av在线亚洲专区| 毛片一级片免费看久久久久| 永久网站在线| 国产精品国产三级国产专区5o| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产成人a区在线观看|