• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    五氯酚(PCP)對雞肝癌細(xì)胞(LMH)毒性效應(yīng)的機(jī)制研究

    2017-10-13 04:02:28蔣鵬盛南王建設(shè)戴家銀
    生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2017年3期
    關(guān)鍵詞:雞肝毒性培養(yǎng)基

    蔣鵬,盛南,王建設(shè),戴家銀

    中國科學(xué)院動物研究所中國科學(xué)院動物生態(tài)與保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101

    五氯酚(PCP)對雞肝癌細(xì)胞(LMH)毒性效應(yīng)的機(jī)制研究

    蔣鵬,盛南,王建設(shè),戴家銀*

    中國科學(xué)院動物研究所中國科學(xué)院動物生態(tài)與保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101

    五氯酚(pentachlorophenol, PCP)是一種持久性有機(jī)污染物,廣泛用于滅釘螺、木材防腐、除草劑等方面,由于PCP在環(huán)境中的持久性和生物累積性,其對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成潛在危害。本文以雞肝癌細(xì)胞系(chicken hepatoma cells, LMH)為受試對象,探討了PCP對細(xì)胞色素P450(CYP450)和抗氧化系統(tǒng)的影響。MTT結(jié)果顯示LMH細(xì)胞經(jīng)不同濃度PCP暴露后,呈現(xiàn)出先促進(jìn)細(xì)胞增殖后抑制的J-型曲線,PCP對LMH細(xì)胞24 h的半數(shù)效應(yīng)濃度(24 h-EC50)為427.52 μmol·L-1。LMH細(xì)胞在1.56、6.25、25、100 μmol·L-1PCP染毒條件下可增加細(xì)胞EROD、MROD、PROD和BFC活性,并可使CYP1A、1B、1C、2H及3A家族基因mRNA表達(dá)水平升高。LMH細(xì)胞在0.4~100 μmol·L-1PCP染毒下可顯著降低硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT1B1和SULT 1C1)基因mRNA水平。此外,LMH細(xì)胞在6.25、25、100 μmol·L-1PCP染毒下可引起細(xì)胞內(nèi)ROS升高,同時PCP(1.56~100 μmol·L-1)可顯著增加細(xì)胞內(nèi)MDA含量和降低GSH/GSSH比值。這些結(jié)果表明細(xì)胞色素P450(CYP450)基因及酶活性的變化、細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量及GSH/GSSH可作為評價(jià)LMH細(xì)胞PCP毒性效應(yīng)的敏感性生物標(biāo)志物。此研究在細(xì)胞水平上利用多個評價(jià)指標(biāo)研究PCP對細(xì)胞的毒性效應(yīng),為PCP環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供依據(jù)。

    五氯酚;雞肝癌細(xì)胞系;細(xì)胞色素P450;硫酸基轉(zhuǎn)移酶;氧化應(yīng)激

    Received12 December 2016accepted10 February 2017

    Abstract: Pentachlorophenol (PCP), a persistent organic pollutant, has been used for wood preservation and as a herbicide and insecticide. Due to its persistence in the environment and bioaccumulation, PCP causes potential harm to the ecological environment and human health. In this study, chicken hepatoma cells (LMH) were used to explore the effect of PCP on antioxidant systems and cytochrome P450 (CYP450) levels. The results revealed that 1.56, 6.25, 25 and 100 μmol·L-1PCP could increase EROD, MROD, PROD and BFC levels, and remarkably upregulated the expressions of CYP1A, 1B, 1C, 2H and 3A families. Data obtained from 24 h-exposure studies demonstrated that 0.4-100 μmol·L-1PCP could decrease sulfotransferase (SULT1B1 and SULT 1C1) expression levels. When LMH cells were exposed to 6.25, 25, and 100 μmol·L-1PCP for 24 h, ROS and MDA content increased, while GSH/GSSH deceased significantly. These experimental results showed that PCP exposure could change CYP450 gene expression and activity, ROS and MDA content, and GSH/GSSH ratioin LMH cells. In this view, multiple evaluation indexes should be used to assess the cell toxicity of PCP, which will provide better understanding for PCP risk assessment and mechanism studies.

    Keywords: pentachlorophenol; chicken hepatoma cells; cytochrome 450; sulfotransferase; oxidative stress

    五氯酚(pentachlorophenol, PCP)作為氯代烴類殺蟲劑和滅真菌劑,具有低成本優(yōu)勢,被廣泛地用作農(nóng)業(yè)殺蟲劑、除草劑和木材防腐劑等[1]。PCP因具有穩(wěn)定的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)和高氯含量而不容易被降解,已成為重要的環(huán)境污染物[2],PCP污染所造成的環(huán)境問題也日益受到全社會的高度重視[3]。PCP可以通過雨水等擴(kuò)散,從而轉(zhuǎn)移到水果、蔬菜和谷物中[4]。已有研究表明,PCP在水系統(tǒng)中半衰期長達(dá)200 d[5];PCP在人體內(nèi)的半衰期為33 h至16 d[6]。PCP對動物體毒性研究表明慢性暴露可造成嚙齒類動物多種不良效應(yīng),包括免疫系統(tǒng)損傷等[7-10]。PCP是潛在的致癌物質(zhì),在實(shí)驗(yàn)動物中可誘發(fā)腫瘤,其氧化脫氯生成的生物大分子在PCP的毒性中具有重要作用[11]。

    流行病學(xué)研究顯示,職業(yè)人群在PCP暴露后增加了患惡性淋巴瘤和白血病的風(fēng)險(xiǎn)[9]。因此開展PCP對生物體的毒理學(xué)研究,特別是在細(xì)胞水平上利用多個評價(jià)指標(biāo)研究PCP對細(xì)胞的毒性效應(yīng),對有毒物質(zhì)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)PCP可通過解偶聯(lián)氧化磷酸化產(chǎn)生細(xì)胞毒性[12]。生物體細(xì)胞中CYP3A4酶承擔(dān)PCP的生物轉(zhuǎn)化作用,通過產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的四氯代氫醌(tetrachlorohydroquinone, TCHQ)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性[13]。TCHQ是PCP的主要毒性代謝產(chǎn)物,活性氧(ROS)參與了TCHQ的毒性作用。同時PCP的毒性也可能與生成的高反應(yīng)性代謝物——四氯-1,4-苯醌(tetrachloro-1,4-benzoquinone, TCBQ)有關(guān)[14]。作為親電子分子,TCBQ與脫氧鳥苷形成加合物,從而導(dǎo)致細(xì)胞遺傳毒性[15]。此外,TCBQ易迅速產(chǎn)生四氯醌(tetrachlorosemiquinone, TCSQ)自由基,并使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。這些研究表明PCP及代謝產(chǎn)物對人和動物細(xì)胞具有遺傳毒性和潛在的致癌性。鳥類作為生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中的頂級生物類群與人類處于相似的食物鏈地位,已經(jīng)成為監(jiān)測生態(tài)環(huán)境中鹵代有機(jī)污染物的指示生物[16],因此本研究開展了PCP對雞肝癌細(xì)胞的毒性效應(yīng),并初步探討了其毒性機(jī)制,為評價(jià)PCP環(huán)境污染水平和對人群的潛在威脅提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    PCP(CAS號87-86-5,純度97%)和Gelatin購自Sigma-Aldrich(美國);Waymouth’s MB 752/1培養(yǎng)基(貨號:11220-035)和進(jìn)口胎牛血清(貨號:10099141)購自Gibco(美國);H2DCF-DA(Life Technologies,美國)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    雞肝癌細(xì)胞系(chicken hepatoma cells, LMH)(CRL-2117)購自ATCC公司(美國)。在無菌條件下,用0.1% gelatin溶液包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶。LMH細(xì)胞用Waymouth’s MB 752/1培養(yǎng)基和15%進(jìn)口胎牛血清于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

    1.3 細(xì)胞暴露實(shí)驗(yàn)

    首先將PCP溶解在二甲基亞砜(DMSO)中,配成200 mmol·L-1PCP母液[12]。然后用含有血清的培養(yǎng)基將PCP母液稀釋成不同的濃度。對照組用含有血清的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),然后在6或96孔板中加入一定的細(xì)胞個數(shù)。24 h后,可將原有的培養(yǎng)基倒掉,加入含不同PCP濃度的培養(yǎng)基,在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.4 細(xì)胞活力檢測(MTT法)

    設(shè)置96孔板中間6×10陣列共60個孔為實(shí)驗(yàn)孔,取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)為3×104。細(xì)胞培養(yǎng)4 h后,棄去原有培養(yǎng)基,加入200 μL用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的PCP溶液(0~1 mol·L-1設(shè)定濃度梯度),在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每組設(shè)6個平行孔。

    在PCP處理細(xì)胞24 h后,每孔中加入20 μL現(xiàn)配制的5 g·L-1MTT溶液,放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄去培養(yǎng)基,每孔中加入150 μL DMSO,然后在酶標(biāo)儀中設(shè)置程序震蕩5 min,選擇光吸收模式,在570 nm讀取每孔中光吸收值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞抑制率:細(xì)胞抑制率(%)=(1﹣實(shí)驗(yàn)組OD平均值/對照組OD平均值)×100%。

    1.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的測定

    將H2DCF-DA配制成10 mmol·L-1的母液,再用waymouth’s MB 752/1培養(yǎng)基(不含血清)將母液稀釋1 000倍,稀釋成10 μmol·L-1的工作液。不同濃度PCP處理LMH細(xì)胞方法同前,每組設(shè)6個平行孔,重復(fù)3次。細(xì)胞染毒24 h后在96孔板中加入5 μL H2DCF-DA的工作液,37 ℃條件下反應(yīng)30 min。每孔加入200 μL不含血清的waymouth’s MB 752/1培養(yǎng)基洗滌LMH細(xì)胞3次。在每孔中加入100 μL 1×PBS,檢測反應(yīng)生成的DCF熒光。

    1.6 實(shí)時熒光定量PCR

    細(xì)胞樣品總RNA的提取:6孔板中每孔的LMH細(xì)胞約106個,每組設(shè)6個平行孔,重復(fù)3次。經(jīng)過不同濃度的PCP暴露后,用TRIzol法提取細(xì)胞RNA。

    熒光定量PCR檢測目的基因用天根公司試劑盒。定量引物在表1中列出。

    1.7 細(xì)胞P450酶活性和抗氧化指標(biāo)的檢測

    細(xì)胞染毒方法同前,每組設(shè)6個平行孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞色素P450酶活性(EROD、MROD、PROD、BROD和BFC)用試劑盒(Genmed Scientifics Inc.,美國)檢測。MDA含量和GSH/GSSH比值的測定采用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒。

    1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    通過SPSS軟件(SPSS, Inc., 美國)進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean± SD)表示。使用單因素的方差及最小顯著差法(LSD)分析對照組和實(shí)驗(yàn)組間的差異,P< 0.05表示差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果(Results)

    2.1 LMH細(xì)胞經(jīng)PCP處理后的細(xì)胞活力變化

    用不同濃度的PCP處理LMH細(xì)胞24 h后,計(jì)算出各濃度PCP對細(xì)胞的抑制率,采用biphasic濃度效應(yīng)模型擬合[17],劑量-效應(yīng)曲線見圖1。結(jié)果顯示LMH細(xì)胞經(jīng)不同濃度PCP暴露24 h后,呈現(xiàn)出先促進(jìn)細(xì)胞增殖后抑制的J-型曲線。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果推導(dǎo)出PCP對LMH的24 h-EC50為427.52 μmol·L-1。

    表1 雞肝癌細(xì)胞系(LMH)細(xì)胞經(jīng)PCP暴露后熒光定量PCR引物列表Table 1 The primers for genes in chicken hepatoma cells (LMH) exposed to PCP

    圖1 不同濃度的PCP處理LMH細(xì)胞24 h后 細(xì)胞活力變化Fig. 1 MTT assay in LMH cells exposed to PCP for 24 h

    LMH細(xì)胞在0.4~25 μmol·L-1PCP染毒劑量下,細(xì)胞活性未受到影響。100 μmol·L-1PCP使細(xì)胞活力增加17%(圖2)。為了研究在不引起LMH細(xì)胞活性受到抑制的情況下,低濃度PCP對細(xì)胞內(nèi)酶活性和抗氧化反應(yīng)的影響,LMH細(xì)胞經(jīng)0.4、1.56、6.25、25和100 μmol·L-1PCP處理后測定細(xì)

    胞內(nèi)CYP450酶活性等指標(biāo)。

    2.2 PCP處理LMH細(xì)胞CYP450及SULT1s基因表達(dá)的變化

    經(jīng)不同濃度PCP暴露24 h的LMH細(xì)胞,細(xì)胞CYP1A4、CYP1A5、CYP1B1、CYP1C1、CYP3A4和CYP3A37基因表達(dá)變化見圖3。其中,25和100 μmol·L-1PCP可引起LMH細(xì)胞內(nèi)CYP1A4表達(dá)量升高,CYP1A5在6.5~100 μmol·L-1PCP濃度下較對照組顯著升高,在100 μmol·L-1組升高6.27倍。而CYP1B1基因只在6.5 μmol·L-1PCP暴露組升高,CYP1C1只在25 μmol·L-1PCP暴露組升高。芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AHR)和芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)在1.56 μmol·L-1PCP濃度暴露下可被誘導(dǎo)。PCP濃度為0.4~100 μmol·L-1可引起細(xì)胞中SULT1B1和SULT1B1表達(dá)明顯下降(圖3)。

    圖2 不同濃度PCP處理LMH細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力變化Fig. 2 The viability of LMH cells treated with different concentration of PCP for 24 h

    圖3 PCP處理LMH細(xì)胞24 h后,CYP450及SULT1B基因表達(dá)的變化Fig. 3 Effects of PCP on CYP450 and SULT1B mRNA expression in LMH cells

    圖4 PCP處理LMH細(xì)胞24 h后,CYP450酶活性變化注:乙氧基異酚惡唑脫乙基酶(EROD),甲氧基異酚惡唑脫甲基酶(MROD),芐氧基試鹵靈-O-脫烷基化酶(BROD), 戊氧基異酚惡唑脫甲基酶(PROD),芐氧基三氟甲基香豆素脫烷基化酶(BFC)。Fig. 4 Effects of PCP on the CYP450 enzyme activities of the LMH cellsNote: ethoxyresorufin O-deethylation (EROD), methoxyresorufin O-demethylation (MROD), benzyloxyresorufin O-debenzylation (BROD), pentoxyresorufin O-depentylation (PROD), benzyloxy-trifluoromethyl-coumarin (BFC).

    2.3 PCP處理的LMH細(xì)胞CYP450酶活性

    LMH細(xì)胞暴露于PCP 24 h后,發(fā)現(xiàn)1.56、6.25、25、100 μmol·L-1PCP可增加細(xì)胞EROD、MROD、PROD和BFC活性,而并未引起LMH細(xì)胞BROD酶活性的變化(圖4)。其中,100 μmol·L-1PCP對LMH細(xì)胞中的EROD、MROD和PROD酶活性的促進(jìn)作用最顯著。

    2.4 LMH細(xì)胞對PCP處理的氧化應(yīng)激響應(yīng)

    LMH細(xì)胞暴露于PCP 24 h后,發(fā)現(xiàn)6.25、25、100 μmol·L-1PCP可誘導(dǎo)細(xì)胞ROS升高,在100 μmol·L-1PCP作用下,ROS可升高23%。GSH/GSSH在1.56~100 μmol·L-1PCP作用下顯著降低,其中100 μmol·L-1PCP可使GSH/GSSH比值下降45%,同時,1.56~100 μmol·L-1PCP可以增加LMH細(xì)胞內(nèi)MDA的含量(圖5)。

    3 討論(Discussion)

    本研究中PCP對雞肝癌細(xì)胞(LMH)活性影響表現(xiàn)為低濃度0.4~25 μmol·L-1PCP對細(xì)胞活性無影響,100 μmol·L-1PCP使LMH細(xì)胞增殖,高濃度PCP明顯抑制LMH生長。AML12小鼠正常肝細(xì)胞經(jīng)PCP染毒后,MTT結(jié)果也顯示0~3.87 μg·mL-1PCP促進(jìn)AML12細(xì)胞增殖,7.75~31.0 μg·mL-1PCP對AML12細(xì)胞出現(xiàn)明顯抑制效應(yīng)[18]。已有研究結(jié)果表明PCP暴露對不同類型細(xì)胞的生長影響表現(xiàn)出差異性[19]。本研究中PCP對LMH細(xì)胞24 h的半數(shù)效應(yīng)濃度24 h-EC50為427.52 μmol·L-1,而PCP對人肝癌細(xì)胞系HepG2(human liver carcinoma cell)細(xì)胞24 h-EC50為(23.0 ± 5.6) μg·L-1[20],PCP對人宮頸癌細(xì)胞的24 h-EC50為66.59 mmol·L-1[21],說明與雞肝癌細(xì)胞相比,人肝癌細(xì)胞對PCP更敏感。

    細(xì)胞色素P450(CYPs)是含有血紅素結(jié)合位點(diǎn)的蛋白家族。由于它們參與多種內(nèi)源和外源物質(zhì)的代謝,在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的作用[22]。不同的藥物和其他外源化合物對生物體CYPs的表達(dá)和酶活性影響不同[23]。在眾多CYPs中,CYP1A家族是有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮主要作用的亞族[24]。PCP可引起HepG2細(xì)胞CYP1A1表達(dá)升高[20],在LMH細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)25 μmol·L-1和6.5 μmol·L-1PCP可分別誘導(dǎo)CYP1A4和CYP1A5的表達(dá)。CYP1A基因通過外源物質(zhì)與芳香烴受體(AHR)結(jié)合進(jìn)而使芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ARNT)與特定的DNA識別位點(diǎn)結(jié)合而被誘導(dǎo)表達(dá)[25]。激活的AHR/ARNT復(fù)合物識別位位于基因啟動子區(qū)的外源性反應(yīng)元件序列(XRE),進(jìn)而調(diào)控下游基因表達(dá),如CYP1A1和UGTA1酶等[26]。本研究中PCP可顯著誘導(dǎo)LMH細(xì)胞中AHR和ARNT的表達(dá),進(jìn)而通過AHR通路誘導(dǎo)其調(diào)控基因CYP1A的表達(dá)。已有文獻(xiàn)表明PCP在生物體內(nèi)通過形成二聚物導(dǎo)致四氯二苯-p-二噁英(TCDD)生成,而TCDD可以結(jié)合AHR誘導(dǎo)CYP1A[27]。本研究中LMH細(xì)胞中CYP1B1和CYP1C1分別在6.25和25 μmol·L-1PCP作用下表達(dá)水平升高,說明PCP是CYP1B1和CYP1C1的誘導(dǎo)劑。細(xì)胞色素P450單加氧酶3A4(CYP3A4)可代謝多種外源物質(zhì),體外暴露實(shí)驗(yàn)表明PCP可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞CYP3A4表達(dá)[28],在LMH細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)6.25~100 μmol·L-1PCP可誘導(dǎo)CYP3A4表達(dá)。由于CYP450對外源物質(zhì)有解毒作用,CYP450基因表達(dá)的改變可減輕有毒物質(zhì)發(fā)揮毒性作用[29]。

    圖5 PCP處理LMH細(xì)胞24 h后其氧化應(yīng)激反應(yīng)的測定Fig. 5 Effects of PCP on the ROS of the LMH cells

    EROD、MROD、BROD和PROD是重要的CYP450酶,在外源化學(xué)品解毒中發(fā)揮重要作用[30-31]。目前,對外源性物質(zhì)的代謝研究中,CYP450基因表達(dá)的誘導(dǎo)或抑制已經(jīng)成為生態(tài)毒理學(xué)和環(huán)境污染生物監(jiān)測的一個有效手段[32-34]。本研究中1.25 μmol·L-1PCP可使細(xì)胞EROD、MROD、PROD和BFC活性增加。這表明PCP可改變不同CYP450的酶活性,CYP450酶活性可成為PCP污染監(jiān)測的指標(biāo)之一。這些結(jié)果說明雖然低濃度PCP未對細(xì)胞活性抑制,但細(xì)胞內(nèi)CYP450活性增加,低濃度PCP可通過激活CYP450酶活性而使細(xì)胞免受損傷。

    生物體內(nèi)發(fā)生的硫酸化反應(yīng)與環(huán)境污染物、致癌物質(zhì)、激素等各種內(nèi)源性和外源性化合物的活化及解毒作用有關(guān)[35]。硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULTs)可催化從3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)轉(zhuǎn)移SO3-至親核受體底物而發(fā)揮生物轉(zhuǎn)化作用[36]。大量研究表明PCP是SULTs的抑制劑[37-39],如小鼠SULT1C1活性可被PCP抑制[40]。SULT1B1與脂質(zhì)代謝有關(guān),芯片的數(shù)據(jù)顯示,SULT1B1在生長快速的雞肝組織中比生長慢的雞肝臟組織中表達(dá)量高7倍[41]。已有數(shù)據(jù)顯示雞SULT1C1酶與小鼠SULT1C1結(jié)構(gòu)類似,表明鳥類及哺乳類硫酸基轉(zhuǎn)移酶在結(jié)構(gòu)和功能上是相似的[42]。本研究中發(fā)現(xiàn)0.4~100 μmol·L-1PCP暴露可引起LMH細(xì)胞SULT1B1和SULT1C1的表達(dá)降低,但在此濃度下細(xì)胞活性有增強(qiáng),說明PCP在細(xì)胞內(nèi)通過硫酸基轉(zhuǎn)移酶發(fā)生生物轉(zhuǎn)化,減少了PCP對細(xì)胞的毒性作用。

    活性氧(ROS)通常是線粒體能量代謝的產(chǎn)物,與細(xì)胞生長、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有關(guān)[43]。持續(xù)升高的ROS水平是腫瘤發(fā)生、腫瘤生長和腫瘤轉(zhuǎn)移的特征現(xiàn)象[44]。LMH細(xì)胞經(jīng)低濃度PCP暴露后可引起細(xì)胞內(nèi)ROS升高,同時引起GSH/GSSG比值下降和MDA含量增加,說明PCP也可引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),這與白腰文鳥體內(nèi)暴露實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致[45]。

    本論文中雞肝癌細(xì)胞(LMH)經(jīng)6.25~100 μmol·L-1PCP染毒后細(xì)胞內(nèi)ROS及MDA含量升高,進(jìn)而造成機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),同時PCP影響CYP450基因及激活A(yù)HR1表達(dá),表明PCP可通過AHR1與ARNT1通路作用于CYP1A基因。此外,PCP在LMH細(xì)胞內(nèi)還參與硫酸基轉(zhuǎn)移酶的生物轉(zhuǎn)化作用。用離體培養(yǎng)的細(xì)胞來評價(jià)環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)的毒性作用,是近年來生物和環(huán)境相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。本文從細(xì)胞、蛋白質(zhì)和基因水平上分析了PCP對細(xì)胞的毒性作用,對PCP環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)具有重要意義。

    [1] Crosby D G. IUPAC reports on pesticides. 14. Environmental chemistry of pentachlorophenol [J]. Pure and Applied Chemistry, 1981, 53: 1051-1080

    [2] Okeke B C, Paterson A, Smith J E, et al. Comparative biotransformation of pentachlorophenol in soils by solid substrate cultures of Lentinula edodes [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1997, 48: 563-569

    [3] Zheng W W, Yu H, Wang X, et al. Systematic review of pentachlorophenol occurrence in the environment and in humans in China: Not a negligible health risk due to the re-emergence of schistosomiasis [J]. Environment International, 2012, 42: 105-116

    [4] Jorens P G, Schepens P J C. Human pentachlorophenol poisoning [J]. Human & Experimental Toxicology, 1993, 12:479-495

    [5] Law W M, Lau W N, Lo K L, et al. Removal of biocide pentachlorophenol in water system by the spent mushroom compost of Pleurotus pulmonarius [J]. Chemosphere, 2003, 52: 1531-1537

    [6] Reigner B G, Bois F Y, Tozer T N. Assessment of pentachlorophenol exposure in humans using the clearance concept [J]. Human & Experimental Toxicology, 1992, 11: 17-26

    [7] Blakley B R, Yole M J, Brousseau P, et al. Effect of pentachlorophenol on immune function [J]. Toxicology,1998, 125: 141-148

    [8] Chhabra R S, Maronpot R M, Bucher J R, et al. Toxicology and carcinogenesis studies of pentachlorophenol in rats [J]. Toxicological Sciences, 1999, 48: 14-20

    [9] Roberts H J. Pentachlorophenol-associated aplastic anemia, red cell aplasia, leukemia and other blood disorders [J]. The Journal of the Florida Medical Association, 1990, 77:86-90

    [10] Umemura T, Kai S, Hasegawa R, et al. Pentachlorophenol (PCP) produces liver oxidative stress and promotes but does not initiate hepatocarcinogenesis in B6C3F1 mice [J]. Carcinogenesis, 1999, 20: 1115-1120

    [11] Zhu B Z,Shan G Q. Potential mechanism for pentachlorophenol-induced carcinogenicity: A novel mechanism for metal-independent production of hydroxyl radicals [J]. Chemical Research in Toxicology, 2009, 22: 969-977

    [12] Shan G Q, Ye M Q, Zhu B Z, et al. Enhanced cytotoxicity of pentachlorophenol by perfluorooctane sulfonate or perfluorooctanoic acid in HepG2 cells [J]. Chemosphere, 2013, 93: 2101-2107

    [13] Westerink W M A, Schoonen W G E J. Cytochrome P450 enzyme levels in HepG2 cells and cryopreserved primary human hepatocytes and their induction in HepG2 cells [J]. Toxicology in Vitro, 2007, 21: 1581-1591

    [14] Dong H, Xu D M, Hu L H, et al. Evaluation of N-acetyl-cysteine against tetrachlorobenzoquinone-induced genotoxicity and oxidative stress in HepG2 cells [J]. Food and Chemical Toxicology, 2014, 64: 291-297

    [15] Nguyen T N T, Bertagnolli A D, Villalta P W, et al. Characterization of a deoxyguanosine adduct of tetrachlorobenzoquinone: Dichlorobenzoquinone-1,N-2-etheno-2'-deoxyguanosine [J]. Chemical Research in Toxicology,2005, 18: 1770-1776

    [16] 孫毓鑫. 鳥類作為指示生物監(jiān)測陸生環(huán)境中鹵代有機(jī)污染物的研究[D]. 北京: 中國科學(xué)院研究生院, 2012

    [17] Hu J Y, Li J, Wang J S, et al. Synergistic effects of perfluoroalkyl acids mixtures with J-shaped concentration-responses on viability of a human liver cell line [J]. Chemosphere, 2014, 96: 81-88

    [18] Dorsey W C, Tchounwou P B, Ford B D. Neuregulin 1-beta cytoprotective role in AML 12 mouse hepatocytes exposed to pentachlorophenol [J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2006, 3: 11-22

    [19] Ling B, Gao B, Yang J. Evaluating the effects of tetrachloro-1,4-benzoquinone, an active metabolite of pentachlorophenol, on the growth of human breast cancer cells [J]. Journal of Toxicology, 2016(5): 1-8

    [20] Dorsey W C,Tchounwou P B. CYP1a1, HSP70, P53, and c-fos expression in human liver carcinoma cells (HepG2) exposed to pentachlorophenol [J]. Biomedical Sciences Instrumentation, 2003, 39: 389-396

    [21] 金幫明, 王輔明, 熊力, 等. 五氯酚對Hela細(xì)胞毒性及DNA損傷的研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2012, 33(2): 658-664

    Jin B M, Wang F M, Xiong L, et al. Effects of pentachlorophenol on DNA damage and cytotoxicity of Hela cells [J]. Environmental Science, 2012, 33(2): 658-664 (in Chinese)

    [22] Ibrahim Z S. Chenodeoxycholic acid increases the induction of CYP1A1 in HepG2 and H4IIE cells [J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2015, 10(5): 1976-1982

    [23] Pelkonen O, Turpeinen M, Hakkola J, et al. Inhibition and induction of human cytochrome P450 enzymes: Current status [J]. Archives of Toxicology, 2008, 82: 667-715

    [24] He X T, Nie X P, Wang Z H, et al. Assessment of typical pollutants in waterborne by combining active biomonitoring and integrated biomarkers response [J]. Chemosphere,2011, 84: 1422-1431

    [25] Marshall N B, Kerkvliet N I. Dioxin and immune regulation: Emerging role of aryl hydrocarbon receptor in the generation of regulatory T cells [J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2010, 1183: 25-37

    [26] Sorg O. AhR signalling and dioxin toxicity [J]. Toxicology Letters, 2014, 230: 225-233

    [27] Jung D K, Klaus T, Fent K. Cytochrome P450 induction by nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons, azaarenes, and binary mixtures in fish hepatoma cell line PLHC-1 [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2001, 20: 149-159

    [28] Thummel K E,Wilkinson G R. In vitro and in vivo drug interactions involving human CYP3A [J]. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 1998, 38: 389-430

    [29] Mortensen A S, Arukwe A. Modulation of xenobiotic biotransformation system and hormonal responses in Atlantic salmon (Salmo salar) after exposure to tributyltin (TBT) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP, 2007, 145: 431-441

    [30] Hirakawa S, Iwata H, Takeshita Y, et al. Molecular characterization of cytochrome P450 1A1, 1A2, and 1B1, and effects of polychlorinated dibenzo-p-dioxin, dibenzofuran, and biphenyl congeners on their hepatic expression in Baikal seal (Pusa sibirica) [J]. Toxicological Sciences, 2007, 97: 318-335

    [31] Kubota A, Watanabe M X, Kim E Y, et al. Accumulation of dioxins and induction of cytochrome P450 1A4/1A5 enzyme activities in common cormorants from Lake Biwa, Japan: Temporal trends and validation of national regulation on dioxins emission [J]. Environmental Pollution, 2012, 168: 131-137

    [32] Esler D, Ballachey B E, Trust K A,et al. Cytochrome P4501A biomarker indication of the timeline of chronic exposure of Barrow's goldeneyes to residual Exxon Valdez oil [J]. Marine Pollution Bulletin, 2011, 62: 609-614

    [33] Bigorgne E, Custer T W, Dummer P M, et al. Chromosomal damage and EROD induction in tree swallows (Tachycineta bicolor) along the Upper Mississippi River, Minnesota, USA [J]. Ecotoxicology, 2015, 24: 1028-1039

    [34] Iwata H, Nagahama N, Kim E Y, et al. Effects of in ovo exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin on hepatic AHR/ARNT-CYP1A signaling pathways in common cormorants (Phalacrocorax carbo) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP, 2010, 152: 224-231

    [35] Honma W, Kamiyama Y, Yoshinari K, et al. Enzymatic characterization and interspecies difference of phenol sulfotransferases, ST1A forms [J]. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals, 2001, 29:274-281

    [36] Meloche C A, Falany C N. Expression and characterization of the human 3 beta-hydroxysteroid sulfotransferases (SULT2B1a and SULT2B1b) [J]. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 77: 261-269

    [37] Mulder G J, Scholtens E. Phenol sulphotransferase and uridine diphosphate glucuronyltransferase from rat liver in vivo and vitro. 2,6-Dichloro-4-nitrophenol as selective inhibitor of sulphation [J]. The Biochemical Journal, 1977, 165: 553-559

    [38] Koster H, Scholtens E, Mulder G J. Inhibition of sulfation of phenols in vivo by 2,6-dichloro-4-nitrophenol: Selectivity of its action in relation to other conjugations in the rat in vivo [J]. Medical Biology, 1979, 57: 340-344

    [39] Wang L Q, James M O. Inhibition of sulfotransferases by xenobiotics [J]. Current Drug Metabolism, 2006, 7:83-104

    [40] Nagata K, Ozawa S, Miyata M, et al. Isolation and expression of a cDNA-encoding a male-specific rat sulfotransferase that catalyzes activation of N-hydroxy-2-acetylaminofluorene [J]. Journal of Biological Chemistry,1993, 268: 24720-24725

    [41] D'Andre H C, Paul W, Shen X, et al. Identification and characterization of genes that control fat deposition in chickens [J]. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2013, 4(1): 1-16

    [42] Wilson L A, Reyns G E, Darras V M, et al. cDNA cloning, functional expression, and characterization of chicken sulfotransferases belonging to the SULT1B and SULT1C families [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2004, 428: 64-72

    [43] Landry W D, Cotter T G. ROS signalling, NADPH oxidases and cancer [J]. Biochemical Society Transactions, 2014, 42: 934-938

    [44] Chen E I. Mitochondrial dysfunction and cancer metastasis [J]. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2012, 44: 619-622

    [45] Jiang P, Wang J, Zhang J, et al. Effects of pentachlorophenol on the detoxification system in white-rumped munia (Lonchura striata) [J]. Journal of Environmental Sciences,2016, 44: 224-234

    TheToxicityandMechanismofPentachlorophenolExposureonChickenHepatomaCells

    Jiang Peng, Sheng Nan, Wang Jianshe, Dai Jiayin*

    Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Key Laboratory of Animal Ecology and Conservation Biology of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

    2016-12-12錄用日期2017-2-10

    1673-5897(2017)3-373-09

    X171.5

    A

    戴家銀(1965—),男,博士,研究員,主要從事持久性污染物的生態(tài)毒理學(xué)研究工作,發(fā)表學(xué)術(shù)論文100余篇。

    廣東省自然科學(xué)基金(2015A030312005)

    蔣鵬(1981-),女,博士,研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué),E-mail: jiangpeng169@163.com;

    *通訊作者(Corresponding author), E-mail: daijy@ioz.ac.cn

    10.7524/AJE.1673-5897.20161212001

    蔣鵬, 盛南, 王建設(shè), 等. 五氯酚(PCP)對雞肝癌細(xì)胞(LMH)毒性效應(yīng)的機(jī)制研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2017, 12(3): 373-381

    Jiang P, Sheng N, Wang J S, et al. The toxicity and mechanism of pentachlorophenol exposure on chicken hepatoma cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 373-381 (in Chinese)

    猜你喜歡
    雞肝毒性培養(yǎng)基
    補(bǔ)血養(yǎng)生吃雞肝燉蓮子
    補(bǔ)血吃雞肝燉蓮子
    山藥雞肝治嬰幼兒慢性腹瀉
    飲食保健(2020年13期)2020-12-04 02:40:28
    動物之最——毒性誰最強(qiáng)
    蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選
    各種培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個事項(xiàng)
    KBM581培養(yǎng)基:人T細(xì)胞誘導(dǎo)與擴(kuò)增培養(yǎng)基應(yīng)用指南
    RGD肽段連接的近紅外量子點(diǎn)對小鼠的毒性作用
    PM2.5中煤煙聚集物最具毒性
    茯磚茶中優(yōu)勢微生物在不同培養(yǎng)基的差異性比較
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:07
    亚洲国产精品sss在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 十八禁网站免费在线| 久久亚洲精品不卡| 美女黄网站色视频| 亚洲av免费在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美一区二区亚洲| 亚洲国产精品成人综合色| 一区二区三区免费毛片| 久久久久九九精品影院| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲欧美激情综合另类| 国产69精品久久久久777片| 如何舔出高潮| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜日韩欧美国产| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日本成人三级电影网站| 亚洲专区中文字幕在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产精品一区二区三区四区久久| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲天堂国产精品一区在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 美女黄网站色视频| 最近在线观看免费完整版| 真实男女啪啪啪动态图| 国产极品精品免费视频能看的| 日本 av在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 午夜激情欧美在线| 国产亚洲精品av在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 午夜福利在线在线| 久久中文看片网| 97热精品久久久久久| 亚洲美女搞黄在线观看 | 窝窝影院91人妻| 亚洲一区二区三区色噜噜| 99热只有精品国产| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 在线天堂最新版资源| 亚洲激情在线av| 亚洲五月天丁香| 成人亚洲精品av一区二区| 91在线观看av| 成人三级黄色视频| 免费大片18禁| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲18禁久久av| 欧美成狂野欧美在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产乱人伦免费视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 欧美高清性xxxxhd video| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲成av人片免费观看| 国产精品电影一区二区三区| 午夜影院日韩av| av在线天堂中文字幕| 99热这里只有是精品在线观看 | 在线观看午夜福利视频| 99热精品在线国产| 神马国产精品三级电影在线观看| 免费大片18禁| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 又紧又爽又黄一区二区| 国产成人福利小说| 美女高潮的动态| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美bdsm另类| 久久九九热精品免费| 校园春色视频在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 人人妻人人看人人澡| 又黄又爽又免费观看的视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日韩中字成人| 国产精品三级大全| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一边摸一边抽搐一进一小说| 老鸭窝网址在线观看| av女优亚洲男人天堂| 国产精品久久久久久久久免 | 亚洲 国产 在线| 精品一区二区免费观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 黄色视频,在线免费观看| 午夜福利在线观看吧| 桃色一区二区三区在线观看| 国产高清三级在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲精品在线观看二区| 国产欧美日韩一区二区三| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲av免费高清在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 中文字幕久久专区| 少妇高潮的动态图| 亚洲成av人片在线播放无| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品久久国产蜜桃| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美不卡视频在线免费观看| www.999成人在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 色综合婷婷激情| 色在线成人网| a在线观看视频网站| 亚洲在线自拍视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 欧美黑人巨大hd| 亚洲av成人精品一区久久| 国产爱豆传媒在线观看| 岛国在线免费视频观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 成人毛片a级毛片在线播放| 成人特级av手机在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 天天一区二区日本电影三级| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日本黄色片子视频| 免费av不卡在线播放| 精品乱码久久久久久99久播| 在线看三级毛片| 搞女人的毛片| 在线免费观看的www视频| 精品欧美国产一区二区三| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品久久久久久成人av| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲美女黄片视频| 听说在线观看完整版免费高清| 嫩草影院入口| 很黄的视频免费| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久久久亚洲av毛片大全| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美色欧美亚洲另类二区| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产真实伦视频高清在线观看 | 老鸭窝网址在线观看| 久久久精品大字幕| 成人三级黄色视频| 国产真实乱freesex| 日日夜夜操网爽| 午夜福利18| 色播亚洲综合网| 级片在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 69av精品久久久久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲国产精品999在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲人成网站高清观看| 五月伊人婷婷丁香| 精品熟女少妇八av免费久了| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲自偷自拍三级| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜两性在线视频| 极品教师在线免费播放| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲精品在线观看二区| 深爱激情五月婷婷| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产精品久久久久久精品电影| 中亚洲国语对白在线视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美日韩黄片免| avwww免费| 日韩av在线大香蕉| 99久国产av精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美黑人巨大hd| 成人亚洲精品av一区二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲国产精品999在线| 超碰av人人做人人爽久久| 免费在线观看亚洲国产| 欧美潮喷喷水| 国内精品美女久久久久久| 宅男免费午夜| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲不卡免费看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 午夜亚洲福利在线播放| 直男gayav资源| 日韩中文字幕欧美一区二区| 日韩欧美三级三区| 校园春色视频在线观看| 午夜影院日韩av| 毛片女人毛片| 日本熟妇午夜| 乱人视频在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美乱妇无乱码| 中文资源天堂在线| 国产三级黄色录像| 国产又黄又爽又无遮挡在线| av国产免费在线观看| 久9热在线精品视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美日韩黄片免| 久久久久久国产a免费观看| 久久性视频一级片| 国产综合懂色| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 91九色精品人成在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| АⅤ资源中文在线天堂| av女优亚洲男人天堂| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩免费av在线播放| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品电影一区二区三区| 精品福利观看| 最新中文字幕久久久久| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 99久久九九国产精品国产免费| 精品久久久久久久久亚洲 | 亚洲黑人精品在线| 成人亚洲精品av一区二区| 精品国内亚洲2022精品成人| 好男人电影高清在线观看| 久久久久久久午夜电影| xxxwww97欧美| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲片人在线观看| 午夜免费激情av| 怎么达到女性高潮| 97碰自拍视频| 久久6这里有精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 12—13女人毛片做爰片一| 嫩草影院精品99| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 无遮挡黄片免费观看| 精品一区二区三区视频在线| 国产老妇女一区| 观看美女的网站| 免费观看精品视频网站| 在线免费观看的www视频| 成人亚洲精品av一区二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 青草久久国产| 欧美日韩综合久久久久久 | 毛片女人毛片| 在线天堂最新版资源| 亚洲av熟女| 成人精品一区二区免费| 国产黄a三级三级三级人| 黄色丝袜av网址大全| 日韩欧美精品v在线| 成人av在线播放网站| 亚洲专区国产一区二区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 成人国产综合亚洲| 亚洲av熟女| 色5月婷婷丁香| 国产黄a三级三级三级人| 中文在线观看免费www的网站| 少妇人妻一区二区三区视频| 51国产日韩欧美| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美乱色亚洲激情| 欧美一区二区国产精品久久精品| 成人美女网站在线观看视频| 黄片小视频在线播放| 成人亚洲精品av一区二区| 久久精品人妻少妇| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美日韩综合久久久久久 | 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品一区二区性色av| 97热精品久久久久久| 日韩精品中文字幕看吧| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 成人特级av手机在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美午夜高清在线| av黄色大香蕉| 久久久成人免费电影| 国产中年淑女户外野战色| 悠悠久久av| 免费观看的影片在线观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品国产高清国产av| 日本免费a在线| 亚洲成av人片在线播放无| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美午夜高清在线| 国产 一区 欧美 日韩| 国产伦精品一区二区三区视频9| 婷婷丁香在线五月| 国产三级在线视频| 免费在线观看成人毛片| 久久欧美精品欧美久久欧美| 热99re8久久精品国产| 亚洲成人久久性| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产老妇女一区| 中亚洲国语对白在线视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日韩欧美免费精品| 免费看光身美女| 超碰av人人做人人爽久久| netflix在线观看网站| 麻豆国产97在线/欧美| 看免费av毛片| 成年女人永久免费观看视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 麻豆国产97在线/欧美| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美bdsm另类| 精品日产1卡2卡| 村上凉子中文字幕在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产av在哪里看| x7x7x7水蜜桃| 国产三级中文精品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲美女黄片视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产男靠女视频免费网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一区二区三区高清视频在线| 热99re8久久精品国产| 又粗又爽又猛毛片免费看| 午夜精品久久久久久毛片777| 1000部很黄的大片| 简卡轻食公司| 久久精品人妻少妇| 色视频www国产| 亚洲自拍偷在线| 国产亚洲欧美98| 午夜福利18| 女人被狂操c到高潮| 日韩成人在线观看一区二区三区| 色av中文字幕| 国产免费av片在线观看野外av| 直男gayav资源| 丰满的人妻完整版| 亚洲在线自拍视频| 久久精品综合一区二区三区| 人人妻人人看人人澡| 综合色av麻豆| 欧美+日韩+精品| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品不卡视频一区二区 | 日本成人三级电影网站| 亚洲成av人片免费观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久久国产成人免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲精品在线观看二区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 一区福利在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品久久久久久精品电影| 中文在线观看免费www的网站| 精品乱码久久久久久99久播| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品人妻久久久久久| or卡值多少钱| 少妇熟女aⅴ在线视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产欧美日韩一区二区精品| 日本免费一区二区三区高清不卡| 熟女人妻精品中文字幕| 精品人妻1区二区| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 香蕉av资源在线| 99热这里只有是精品50| 久久久久久国产a免费观看| 9191精品国产免费久久| 两个人视频免费观看高清| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 美女大奶头视频| 国产私拍福利视频在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 久久精品综合一区二区三区| 欧美激情国产日韩精品一区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲第一区二区三区不卡| av女优亚洲男人天堂| 波多野结衣高清无吗| 亚洲成a人片在线一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜视频国产福利| 亚洲七黄色美女视频| 看十八女毛片水多多多| 久久九九热精品免费| 久久热精品热| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久这里只有精品中国| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产黄a三级三级三级人| 在线观看舔阴道视频| 精品免费久久久久久久清纯| 婷婷精品国产亚洲av| 青草久久国产| 午夜免费成人在线视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 精品国产三级普通话版| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 一个人看视频在线观看www免费| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美三级亚洲精品| 免费在线观看成人毛片| 精品国产三级普通话版| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲自偷自拍三级| 夜夜夜夜夜久久久久| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲美女搞黄在线观看 | 欧美bdsm另类| 国产综合懂色| 淫秽高清视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| a在线观看视频网站| 日韩免费av在线播放| 首页视频小说图片口味搜索| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美一级a爱片免费观看看| a级毛片a级免费在线| 757午夜福利合集在线观看| 十八禁人妻一区二区| 亚洲成人久久性| 色视频www国产| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产在视频线在精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日韩国内少妇激情av| 国产精品久久视频播放| 国产乱人视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲av熟女| 成年女人看的毛片在线观看| 国产视频内射| 黄色女人牲交| 日日夜夜操网爽| 一个人免费在线观看电影| 欧美日韩综合久久久久久 | 色综合欧美亚洲国产小说| 在线免费观看的www视频| 18+在线观看网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精品久久久久久久电影| 一级黄片播放器| 最新中文字幕久久久久| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩欧美免费精品| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 色视频www国产| 国产精品久久久久久精品电影| 99久久精品一区二区三区| 两个人视频免费观看高清| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 成年免费大片在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 91九色精品人成在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 日韩人妻高清精品专区| 欧美高清性xxxxhd video| 高清日韩中文字幕在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 天堂√8在线中文| 成人精品一区二区免费| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 一二三四社区在线视频社区8| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产成年人精品一区二区| 一本精品99久久精品77| 一进一出好大好爽视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久久久久久久久黄片| 天堂网av新在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 99久久精品一区二区三区| 亚洲av电影在线进入| 国产午夜精品论理片| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产午夜精品论理片| 天美传媒精品一区二区| 免费看光身美女| 亚洲黑人精品在线| av天堂中文字幕网| 国模一区二区三区四区视频| 又紧又爽又黄一区二区| 青草久久国产| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 老熟妇仑乱视频hdxx| 美女 人体艺术 gogo| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 亚洲人成网站在线播| 久久这里只有精品中国| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲五月天丁香| 午夜两性在线视频| 久久久色成人| 国产av在哪里看| 亚洲不卡免费看| 欧美黄色片欧美黄色片| 99热精品在线国产| 最近视频中文字幕2019在线8| 一个人看视频在线观看www免费| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美不卡视频在线免费观看| 免费搜索国产男女视频| 午夜两性在线视频| 麻豆成人午夜福利视频| 波多野结衣高清无吗| 欧美3d第一页| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久伊人香网站| 免费电影在线观看免费观看| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av电影在线进入| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 免费搜索国产男女视频| 在线观看免费视频日本深夜| 最近在线观看免费完整版| 日韩精品青青久久久久久| 久久99热6这里只有精品| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲不卡免费看| 深夜精品福利| 看黄色毛片网站| 观看美女的网站| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 毛片女人毛片| 亚洲精品亚洲一区二区| 日本黄色片子视频| 亚洲av免费在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品一区二区三区视频在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| a级一级毛片免费在线观看| 日韩欧美精品免费久久 | 色视频www国产| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 丝袜美腿在线中文| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲av电影不卡..在线观看| 一本综合久久免费| 精品一区二区三区视频在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久9热在线精品视频| 精品一区二区免费观看| 搞女人的毛片| 国产美女午夜福利| 日韩欧美三级三区| 99久久九九国产精品国产免费| 国产中年淑女户外野战色| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 日本 av在线| 国产午夜精品论理片| 精品熟女少妇八av免费久了| 黄色女人牲交| 伊人久久精品亚洲午夜| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 宅男免费午夜| 少妇高潮的动态图| 色视频www国产|