福州地區(qū)HBsAg—/HBVDNA+獻(xiàn)血者乙肝病毒S區(qū) MHR變異特征分析

趙亮++周曉真++涂東晉++呂蓉

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.23.010

[摘要] 目的 分析福州地區(qū)HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者HBV的基因型及主要親水區(qū)（MHR），尤其是其中 “a”決定簇區(qū)氨基酸的變異情況，為進(jìn)一步研究隱匿性乙肝病毒感染的發(fā)生機(jī)制提供參考。方法 對(duì)收集的2013年7月—2014年10月福州地區(qū)獻(xiàn)血者的90 874名獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行HBsAg ELISA與單人份核酸檢測(cè)，對(duì)篩查出的HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本，進(jìn)行HBV DNA的提取和S區(qū)基因的擴(kuò)增和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行進(jìn)化分型，分析 MHR中氨基酸序列的變異情況。選取15例前期研究所得的HBsAg+/HBV DNA+標(biāo)本的測(cè)序結(jié)果作為對(duì)照，比較兩類標(biāo)本在“a”決定簇區(qū)蛋白序列變異上的差異。結(jié)果 16份測(cè)序結(jié)果中B基因型15份，C基因型1份。15例標(biāo)本中13例在MHR內(nèi)共發(fā)生了33次氨基酸的變異，其中25次集中在“a”決定簇區(qū)，HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)該組“a”決定簇區(qū)的變異率要高于HBsAg+/HBV DNA+標(biāo)該組。變異的形式主要為單個(gè)的氨基酸的點(diǎn)替換，另有7例標(biāo)本在124位與125位氨基酸間發(fā)生了9個(gè)堿基的非移碼插入，造成該位點(diǎn)間“TNR”3個(gè)氨基酸的插入。結(jié)論 福州地區(qū)獻(xiàn)血者HBsAg-/HBV DNA+血液標(biāo)本中HBV的基因型以B型為主， MHR的氨基酸變異主要集中在 “a”決定簇區(qū)，有本地區(qū)的地域特點(diǎn)。研究中新發(fā)現(xiàn)的3個(gè)氨基酸“TNR”的插入變異，可能影響HBsAg的檢出。

[關(guān)鍵詞] 乙型肝炎病毒；獻(xiàn)血者；基因突變；乙型肝炎表面抗原

[中圖分類號(hào)] R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）08（b）-0010-05

Analysis of Variation Characteristics of MHR in Region S of HBSAG-/HBVDNA+ among Blood Donors in Fuzhou

ZHAO Liang1， ZHOU Xiao-zhen1， TU Dong-jin1， LYU Rong2

1.Fujian Blood Center， Fuzhou， Fujian Province， 350004 China； 2.Anhui Blood Center， Hefei， Anhui Province， 230071 China

[Abstracts] Objective This paper tries to analyze the HBV genotypes and amino acids variability in major hydrophilic region （MHR）， especially in “a” determinants region， among HBsAg-/HBV DNA+ blood donors in Fuzhou and to provide the reference for the further study of occult hepatitis B virus infection mechanism. Methods Plasma samples of 90 874 cases of blood donors from July 2013 to October 2014 in Fuzhou were screened and tested by HBsAg ELISA and nucleic acid. HBV DNA was extracted and gene of S region was amplified for HBsAg-/HBV DNA+ samples. Evolutionary typing was conducted for sequencing results， and variations of amino acid sequence in MHR were analyzed. 15 cases of HBsAg+/HBV DNA in previous study were selected as the control group， the sequence variations of proteins in “a” determinants region was compared among sub-specimens. Results Among the 16 cases of sequencing results， 15 cases were genotype B and 1 case was genotype C. Among the 15 specimens， a total of 33 variations of amino acids occurred in MHR in 13 specimens， 25 of which concentrated in “a” determinants region. Variation rate in the “a” determinants region of specimens in the group of HBsAg-/HBV DNA+ specimens was higher than that in the group of HBsAg+/HBV DNA+ specimens. The main variation was the point substitution of a single amino acid. In addition， in another 7 specimens， non-frameshift insertions of 9 bases occurred between 124 and 125 amino acids， causing the insertion of three amino acids TNR at this site. Conclusion The genotypes of HBV in specimens of blood donors in Fuzhou were mainly type B， and the variation of MHR mainly concentrated in “a” determinants region， showing regional characteristics of this region. The insertion variation of newly discovered three amino acids TNR may affect the detection of HBsAg.endprint

[Key words] Hepatitis B virus； Blood donors； Gene mutation； Hepatitis B surface antigen

該研究曾對(duì)2011年11月—2013年3月福州地區(qū)的獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行過(guò)HBsAg和HBV DNA的篩查，發(fā)現(xiàn)HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本檢出率為0.073%[1]。獻(xiàn)血人群主體是健康人群，造成獻(xiàn)血者標(biāo)本HBsAg-/HBV DNA+的主要原因?yàn)榇翱谄诤碗[匿型乙型肝炎病毒感染（Occult Hepatitis B virtus Infection，OBI），OBI所占的比例甚至高達(dá)90%～95%[2]，對(duì)臨床輸血安全造成了威脅。該研究有幸和安徽省血液中心合作，對(duì)該地區(qū)2013年7月—2014年10月福州地區(qū)獻(xiàn)血者的90 874名獻(xiàn)血者血液標(biāo)本篩查所得的的HBsAg-/HBV DNA+的無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本，進(jìn)行HBV的DNA的提取和S區(qū)擴(kuò)增測(cè)序，分析乙型肝炎病毒的基因型和S區(qū)的MHR的變異特征，為研究OBI的發(fā)生機(jī)制提供一個(gè)參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

福建省血液中心所采集的該地區(qū)獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本，獻(xiàn)血者征詢均符合GB18467-20111《獻(xiàn)血者健康檢查要求》，標(biāo)本均經(jīng)過(guò)ALT快速法和HBsAg金標(biāo)試紙初篩合格。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：HBsAg ELISA試劑，單人份核酸聯(lián)合檢測(cè)及鑒別試劑Procleix Ultrio Assay，所有試劑均批批檢合格，并在效期內(nèi)使用。主要儀器：Microlab STAR全自動(dòng)加樣儀，全自動(dòng)酶免分析儀，Procleix TIGRIS核酸檢測(cè)系統(tǒng)。

1.3 檢測(cè)方法及判定規(guī)則

1.3.1 血清學(xué)ELISA檢測(cè)HBsAg 標(biāo)本的HBsAg檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫的兩步法，步驟按試劑說(shuō)明書(shū)要求，結(jié)果S/CO值≥0.9判為反應(yīng)性，<0.9判為非反應(yīng)性（該中心灰區(qū)設(shè)為0.9≤S/CO值<1.0）。HBsAg反應(yīng)性標(biāo)該次日作雙孔復(fù)檢，雙孔中只要有一孔結(jié)果為反應(yīng)性，判為HBsAg（+），否則判為HBsAg（-）。

1.3.2 單人份核酸檢測(cè) 該中心采用TMA法單人份核酸檢測(cè)（ID-NAT）的模式，核酸檢測(cè)與ELISA檢測(cè)同步進(jìn)行，先進(jìn)行HBV/HCV/HIV核酸的聯(lián)檢，檢測(cè)反應(yīng)性的標(biāo)本再進(jìn)行HBV/HCV/HIV單項(xiàng)的鑒別試驗(yàn)，篩出HBV DNA反應(yīng)性的標(biāo)本，判為HBV DNA（+）。

1.4 HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本HBV DNA的提取和S區(qū)基因的擴(kuò)增測(cè)序

留取HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本的血袋血漿進(jìn)行分裝，-80℃保存，寄送至安徽省血液中心完成HBV DNA的提取和S區(qū)基因的擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件參照發(fā)表的文獻(xiàn)[3]。PCR產(chǎn)物由安徽省血液中心寄送上海生工生物工程公司雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果反饋于該中心做進(jìn)一步分析。

1.5 HBsAg+/HBV DNA+標(biāo)本基因序列的獲得

15例HBsAg+/HBV DNA+標(biāo)本來(lái)源于前期研究所收集的無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本，標(biāo)本的HCV抗體、HIV抗體、梅毒螺旋體抗體和ALT均為陰性。HBV DNA的提取、擴(kuò)增和測(cè)序相關(guān)試劑和反應(yīng)條件見(jiàn)參照文獻(xiàn)[1]，所得的DNA序列為全基因組中465～680 bp位置，氨基酸的序列為第108～170位，標(biāo)本均為B基因型。

1.6 HBV的基因分型

使用 MEGA7.0.18軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，將HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本的測(cè)序結(jié)果與網(wǎng)站https：//hbvdb.ibcp.fr/HBVdb/HBVdbIndex 數(shù)據(jù)庫(kù)中各種基因型HBV的標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比對(duì)及進(jìn)化分析。

1.7 MHR氨基酸序列的變異分析

下載相應(yīng)的基因型的標(biāo)準(zhǔn)株的序列作為參照，用MEGA7.0.18軟件將核苷酸序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，將HBsAg-/HBV DNA+組標(biāo)本和HBsAg+/HBV DNA+組標(biāo)本的氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比對(duì)，對(duì)HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本“a”決定簇區(qū)和“a”決定簇區(qū)以外的MHR的氨基酸變異率作一比較，分析氨基酸變異在MHR的分布情況。將兩組標(biāo)本“a”決定簇區(qū)的氨基酸序列的變異情況作一比較，分析可能存在的影響獻(xiàn)血者HBsAg檢出的氨基酸變異位點(diǎn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分類計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本的檢出情況

90 874名最終檢測(cè)出HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本共68份，檢出率為0.075%。HBsAg（-）/HBV DNA（+）標(biāo)本的檢出率與該小組2011年11月—2013年3月研究的所得的檢出率（0.073%）相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.025， P﹥0.05）。

2.2 S區(qū)基因的測(cè)序情況

68份HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本送寄送至安徽省血液中心進(jìn)行HBV DNA的提取和S區(qū)基因的擴(kuò)增，最終有15份標(biāo)本成功完成了測(cè)序，其中3份結(jié)果采用1#引物用巢式PCR方式擴(kuò)增得到，產(chǎn)物覆蓋整個(gè)S基因區(qū)（標(biāo)本的編號(hào)為FJ47-S1、FJ184-S1和 FJ197-S1）；另外13份結(jié)果為2#引物采用普通PCR方式擴(kuò)增得到，產(chǎn)物為部分S基因（標(biāo)本的編號(hào)為FJ66-S4、FJ204-S4、FJ34-S4、FJ39-S4、FJ46-S4、FJ47-S4、FJ71-S4、FJ115-S4、FJ117-S4、FJ199-S4、FJ11-S4、FJ31-S4 和FJ194-S4）。編號(hào)為FJ47標(biāo)本，在2種PCR方法中分別得到了兩個(gè)不同的序列，合計(jì)得到16個(gè)測(cè)序結(jié)果。endprint

2.3 HBV的序列分析與基因分型

將16份標(biāo)本的測(cè)序結(jié)果用MEGA7.0.18軟件與HBV的A-H 基因型各型的標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化分析，16份標(biāo)本中除1份為C基因型（FJ194），其余均為B基因型。

2.4 MHR氨基酸變異情況分析

通過(guò)與已發(fā)表的數(shù)據(jù)庫(kù)中的近源的B型標(biāo)準(zhǔn)株（AB219428與D00331）和C型標(biāo)準(zhǔn)株（GQ358158與GQ924620）的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，16個(gè)HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本的測(cè)序結(jié)果中除了1份（C型FJ194-S1）在MHR無(wú)氨基酸的變異外，其余15份在該區(qū)合計(jì)發(fā)生33次的氨基酸的變異。這33次的變異除了8次發(fā)生在“a”決定簇區(qū)以外的MHR范圍內(nèi)（第99～123位和第148～169位氨基酸區(qū)），其余的25次變異都集中于“a”決定簇區(qū)（第124～147位氨基酸區(qū)）。HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本在“a”決定簇區(qū)的氨基酸變異率（6.51%）要明顯高于MHR的其他區(qū)域（2.08%）（χ2=25.972，P<0.05）。HBsAg+/HBV DNA+組的標(biāo)本在第108～170位氨基酸合計(jì)發(fā)生了12次氨基酸的變異，均為單個(gè)氨基酸的替換，變異也集中于“a”決定簇區(qū)（9/12），其 “a”決定簇區(qū)的氨基酸的變異率（2.50%）要低于HBsAg-/HBV DNA+組的標(biāo)本（χ2=11.985，P<0.05）。HBsAg-/HBV DNA+ 組標(biāo)本“a”決定簇區(qū)氨基酸的變異類型主要有兩類，一類為堿基的點(diǎn)突變引起的單個(gè)氨基酸的替代（18/26），另一類為由9個(gè)堿基（ACAAACCGC）的非移碼插入所引起的3個(gè)氨基酸TNR插入（8/26），共有7例標(biāo)本發(fā)生此類變異。而HBsAg+/HBV DNA+組標(biāo)本的氨基酸的變異均為堿基的點(diǎn)突變引起的單個(gè)氨基酸的替代，根據(jù)氨基酸親水性和疏水性的分類標(biāo)準(zhǔn)，從電荷的改變對(duì)“a”決定簇區(qū)氨基酸的變異情況作進(jìn)一步的分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

該研究通過(guò)與既往研究的縱向比較，發(fā)現(xiàn)福州地區(qū)獻(xiàn)血者HBV窗口期感染與OBI的情況比較穩(wěn)定。68份HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本S區(qū)基因擴(kuò)增的成功率僅為23.5%，推測(cè)與窗口期感染和OBI的病毒載量低有關(guān)[4-5]相關(guān)學(xué)者[7]研究發(fā)現(xiàn)OBI的病毒株可通過(guò)輸血傳播[6]，胡莉萍等學(xué)者也發(fā)現(xiàn)隱匿性乙型肝炎可通過(guò)家庭成員間的密切接觸傳播。 該研究檢出的HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本除1例為C基因型，其余均為B型，與我國(guó)HBV流行南方多B型，北方多C型的地域特點(diǎn)一致，提示引起OBI的病毒株與野毒株可能有相同的傳播途徑。

HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本血清學(xué)檢測(cè)陰性的可能原因中，S基因區(qū)突變所引起的HBsAg合成分泌障礙以及MHR，特別是“a”決定簇的抗原表位改變是目前OBI發(fā)生機(jī)制研究最多的方面。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于“a”決定簇的研究所報(bào)道的以單個(gè)氨基酸點(diǎn)替換多見(jiàn)，連續(xù)多個(gè)氨基酸的插入變異較少見(jiàn)。早期侯金林等[8]學(xué)者曾發(fā)現(xiàn)3例HBsAg陰性的感染者S區(qū)第123～124位氨基酸間出現(xiàn)2～3個(gè)氨基酸的插入。后來(lái)陳建宏等學(xué)者也在1例HBsAg陰性的感染者的標(biāo)本中檢出了S區(qū)第126～126位氨基酸間“RPCMNCTI”插入變異[9]。該研究在HBsAg-/HBV DNA+的獻(xiàn)血者標(biāo)本新發(fā)現(xiàn)了第124～125位氨基酸間3個(gè)氨基酸“TNR”的插入變異，該變異出現(xiàn)在8例獻(xiàn)血者的標(biāo)本中，其中1例（FJ47-S4）同時(shí)還發(fā)生了C124R的氨基酸替換。“a”決定簇區(qū)富含半胱氨酸，并借助124與137、139與147位半胱氨酸間的二硫鍵形成雙袢結(jié)構(gòu)，維持HBsAg的抗原性。第124位半胱氨酸的替換及其相鄰位點(diǎn)的插入變異，極大可能會(huì)影響二硫鍵的形成，造成HBsAg關(guān)鍵表位的構(gòu)形改變，引起OBI。

該研究中HBsAg-/HBV DNA+的獻(xiàn)血者標(biāo)本乙肝病毒MHR的氨基酸變異主要集中在“a”決定簇，考慮到發(fā)生變異標(biāo)本均為B基因型，故選取該小組前期研究所得的15份B基因型HBsAg+/HBV DNA+獻(xiàn)血者標(biāo)本所測(cè)得的“a”決定簇氨基酸序列作為野毒株對(duì)照。HBV復(fù)制有逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程，故錯(cuò)配率高，易發(fā)生基因的突變，該研究中二組的標(biāo)本在相對(duì)保守的“a”決定簇都發(fā)現(xiàn)有氨基酸的變異，顯示出病毒在“a”決定簇在人群中的多態(tài)性。HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本在“a”決定簇的氨基酸變異要高于HBsAg+/HBV DNA+標(biāo)本。有學(xué)者通過(guò)對(duì)HBV單克隆載體的構(gòu)建與表型的分析發(fā)現(xiàn)，S區(qū)T131N和M133T的變異可能造成HBsAg無(wú)法抗體識(shí)別[9]。王淏等[10]在對(duì)廣州地區(qū)的獻(xiàn)血者HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本MHR的研究中發(fā)現(xiàn)T126和Q129出現(xiàn)氨基酸的高頻點(diǎn)置換，推測(cè)可能是引起OBI的高突變位點(diǎn)。但該研究發(fā)現(xiàn)T126A、Q129R、T131N和M133T在HBsAg+/HBV DNA+組的標(biāo)本均有出現(xiàn)，其中，T126A、T131N和M133T同時(shí)出現(xiàn)HBsAg-/HBV DNA+組和HBsAg+/HBV DNA+組的標(biāo)本中，提示此類變異有可能對(duì)HBsAg+的檢出的影響有限。研究中其他的氨基酸的變異與國(guó)內(nèi)同類研究所發(fā)現(xiàn)的變異鮮少有重合[4-5，8-11]。該小組曾對(duì)2011年11月—2013年3月福州地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者的HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本的“a”決定簇的氨基酸變異作過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)P127T、T131N、M133T出現(xiàn)次數(shù)較多，該次研究也發(fā)現(xiàn)同樣的情況，加上出現(xiàn)高頻次的第124～125位氨基酸間出相同的插入變異，提示本地區(qū)的HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者中MHR氨基酸的變異情況有自身的地域特點(diǎn)。

為了更好的了解氨基酸的點(diǎn)替換對(duì)“a”決定簇表位的影響，該研究分析了替換前后氨基酸的類型，發(fā)現(xiàn)HBsAg+/HBV DNA+標(biāo)該組大部分的點(diǎn)替換氨基酸的極性未發(fā)生變化（5/9），包括前面提到的T131N和M133T。HBsAg-/HBV DNA+組與HBsAg+/HBV DNA+組標(biāo)本未對(duì)上的10處點(diǎn)替換中，大部分則發(fā)生了氨基酸極性的變化（6/10），這其中很可能包含有引起HBsAg檢出陰性的關(guān)鍵變異點(diǎn)，對(duì)進(jìn)一步研究OBI的發(fā)生機(jī)制提供參考。endprint

現(xiàn)階段隱匿性乙型肝炎病毒感染發(fā)生機(jī)制的研究中，涉及到OBI標(biāo)本的判定方面有幾點(diǎn)值的關(guān)注。①OBI的定義源自2008年歐洲肝病協(xié)會(huì)，指感染者肝臟中檢出HBV DNA，血清血漿中檢出或者不能檢出HBV DNA，且HBsAg檢測(cè)陰性。因肝組織標(biāo)本的在臨床上的獲得不易，研究者更多的采用血清及血漿的標(biāo)本，研究標(biāo)本的選取上偏向于血漿或血清能檢出HBV DNA標(biāo)本；②在標(biāo)本HBsAg的血清學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目上，隨著新的檢測(cè)技術(shù)和靈敏度更高的試劑出現(xiàn)，早期研究中HBsAg陰性的標(biāo)本有可能在現(xiàn)階段是判為HBsAg陽(yáng)性的標(biāo)本；③同一時(shí)期不同品牌的HBsAg檢測(cè)試劑盒由于生產(chǎn)工藝的差異以及所選用的包被抗體類型的不同，有的為單克隆抗體，有的為多克隆抗體，對(duì)不同變異的HBsAg的檢出能力也存在差異。國(guó)外已有學(xué)者同時(shí)對(duì)多個(gè)不同廠家的HBsAg檢測(cè)能力作了比較證實(shí)了該點(diǎn)[12]。④HBV復(fù)制擴(kuò)增的過(guò)程中存在逆轉(zhuǎn)錄，堿基的錯(cuò)配率高，易變異，因此感染的個(gè)體上看，OBI宿主體內(nèi)的乙肝病毒是以準(zhǔn)種的狀態(tài)感染，同時(shí)期有可能體內(nèi)共存有不同的HBV變異株，不同的變異株在選擇壓力下，在宿主的整個(gè)病毒群體中所占的比例處于一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)。陳建宏等[9]對(duì)1例OBI患者不同時(shí)期留取的4份血液標(biāo)本所得到的乙肝病毒構(gòu)建載體進(jìn)行基因表型的分析，發(fā)現(xiàn)患者的病情變化是由多種S基因突變的病毒株引起的。因此，研究中所得到的HBV DNA的基因序列有可能并不能完全的代表OBI患者體內(nèi)HBV的基因變異情況。這也就能解釋該研中FJ47這例標(biāo)本為何在二種PCR方法中分別測(cè)得了氨基酸變異情況完全不同的二個(gè)基因序列。

綜上所述，OBI的發(fā)生機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，研究中針對(duì)MHR的氨基酸的變異就有諸多的報(bào)道，該研究對(duì)福州地區(qū)獻(xiàn)血者的HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本MHR中，特別“a”決定簇區(qū)氨基酸變異研究，所發(fā)現(xiàn)的一些新的變異點(diǎn)，對(duì)研究該地區(qū)的OBI的流行情況和發(fā)生機(jī)制具有一定的參考意義。

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（收稿日期：2017-05-13）endprint