轉(zhuǎn)錄因子SOX7對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及其機(jī)制

鄭斌，吳齊全，周克文，王鋼，任雨，祁洪剛，朱偉智，翁國斌

（寧波市鄞州第二醫(yī)院 泌尿外科，浙江 寧波 315100）

轉(zhuǎn)錄因子SOX7對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及其機(jī)制

鄭斌，吳齊全，周克文，王鋼，任雨，祁洪剛，朱偉智，翁國斌

（寧波市鄞州第二醫(yī)院 泌尿外科，浙江 寧波 315100）

目的：探討轉(zhuǎn)錄因子SOX7對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、遷移和侵襲能力的影響及其機(jī)制。方法：采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染高表達(dá)SOX7重組質(zhì)粒（pCDNA3.1-SOX7），以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（Vector）作為對(duì)照，檢測(cè)SOX7對(duì)PC-3細(xì)胞株增殖、細(xì)胞周期、遷移及侵襲的影響，并用Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：pCDNA3.1-SOX7顯著抑制PC-3細(xì)胞增殖能力，并且誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生G1期阻滯，同時(shí)，使Cylcin D1、E表達(dá)量明顯下調(diào)。此外，pCDNA3.1-SOX7轉(zhuǎn)染后，PC-3細(xì)胞遷移距離顯著減少，穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量也顯著降低，并且伴隨著間質(zhì)表型標(biāo)記物MMP-2、MMP-9和N-cadherin蛋白表達(dá)減少，上皮標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)增加。結(jié)論：SOX7抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖、周期、遷移及侵襲能力，其機(jī)制可能與調(diào)控這些細(xì)胞行為的相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

SOX7；前列腺癌；增殖；遷移；侵襲

Abstract: Objective:To investigate the effects and mechanisms of transcription factor SOX7 on PC-3 cells proliferation, cell cycle, cell migration and invasion.Methods:PC-3 cells were transfected with highexpressed SOX7 recombinant plasmid (pCDNA3.1-SOX7) and further detected the changes of cell proliferation,cell cycle, migration, invasion, and related protein expressions.Results:After transfection with pCDNA3.1-SOX7, significant inhibition effects was shown in the PC-3 cell proliferation and G1/S cell cycle arrest, which were accompanied with decreased expressions of cyclin D1 and E. Furthermore, transfection of pCDNA3.1-SOX7 markedly decreased the cell migration distances and invasion capacity, with a reduction of the mesenchymal markers (MMP-2, MMP-9 and N-cadherin), however, the epithelial marker E-cadherin was increased.Conclusion:SOX7 inhibits PC-3 cell proliferation, cell cycle, migration and invasion through regulation of its related protein expressions.

Key words:SOX7; prostate cancer; proliferation; migration; invasion

前列腺癌為西方男性人群最常見的惡性腫瘤之一，近年來在我國的發(fā)病率與病死率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。臨床上一般采取手術(shù)切除和放射療法為主，然而腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移問題已成為目前治療的難點(diǎn)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在此過程中，上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞的間質(zhì)表型，上皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)增多，抗凋亡能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移與侵襲[3]。SOX7作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SOX家族成員，特異性識(shí)別并結(jié)合靶基因5’-（A/T）（A/T）CAA（A/T）G-3’序列，影響基因轉(zhuǎn)錄水平，在調(diào)控胚胎發(fā)育過程中起重要作用[4]。近年研究表明，SOX7在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色[5-6]。SOX7在不同組織或細(xì)胞中具有表達(dá)差異性，在食管癌、胃癌以及胰腺癌中呈高表達(dá)狀態(tài)，而在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、腎癌和結(jié)直腸癌中呈現(xiàn)低表達(dá)[7-11]，在HeLa、HL60、S3、Raji、SW480、K562、MOLT-4、A549細(xì)胞株中呈不表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常前列腺組織，SOX7在前列腺癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，并且與Gleason評(píng)分密切相關(guān)[12]。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、DU145的SOX7表達(dá)量顯著低于前列腺正常細(xì)胞株RWPE-1。為進(jìn)一步研究SOX7對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及其機(jī)制，本研究用攜帶人過表達(dá)SOX7基因的重組載體（pCDNA3.1-SOX7）轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞，觀察SOX7基因?qū)C-3細(xì)胞體外增殖、周期、侵襲及遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人前列腺癌PC-3細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。RMPI 1640無血清培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gbico公司；細(xì)胞周期蛋白E（Cyclin E）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）、CDK4、CDK6、E-鈣黏附蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏附蛋白（N-cadherin）鼠抗人單克隆抗體以及細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、GAPDH兔抗人單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、SOX7、波形蛋白（vimentin）、纖維連接蛋白（fibronectin）兔抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司；羊抗小鼠IgG二抗與羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 PC-3細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于Control未處理組，空質(zhì)粒pCDNA3.1組（Vector組）對(duì)PC-3細(xì)胞SOX7蛋白表達(dá)量及細(xì)胞生物學(xué)活性均無顯著性影響，因此，本研究僅比較pCDNA3.1-SOX7重組質(zhì)粒組（pCDNA3.1-SOX7組）和空質(zhì)粒pCDNA3.1組（Vector組）相關(guān)指標(biāo)。

1.3 pCDNA3.1-SOX7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 根據(jù)GeneBank中SOX7基因的CDS堿基序列（NM_031439），委托上海吉瑪生物科技有限公司合成pCDNA3.1-SOX7重組質(zhì)粒。待PC-3細(xì)胞生長至50%～60%融合度時(shí)，按1∶3比例將質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合液加入無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待6 h后更換為含10%胎牛血清的普通培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后用于其他實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT增殖實(shí)驗(yàn) 60 mm培養(yǎng)皿中細(xì)胞匯合到80%～90%后，胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度至2×104個(gè)/mL，將稀釋好的細(xì)胞懸液加到5塊96孔板中，每孔100 μL，做5個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清，加入150 μL DMSO溶液，于490 nm測(cè)各孔吸光度值并記錄結(jié)果。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè) 將PC-3細(xì)胞以1×105個(gè)/mL濃度接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)60%左右，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-SOX7質(zhì)粒，24 h后用胰蛋白酶消化分裝，離心，70%的冰乙醇沉淀后-20 ℃保存24 h，置于流式管中，避光加入400 μL PI/RNase染色液并混勻，30 min后置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將PC-3細(xì)胞以2.5×105個(gè)/mL濃度接種于6孔板中，待細(xì)胞長至融合度大于90%后，用200 μL槍頭小心垂直于6孔板劃一直線，37 ℃PBS清洗2次，24 h后倒置顯微鏡觀察拍照，并計(jì)算遷移距離。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn) PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，消化，無血清培養(yǎng)基調(diào)整濃度至4×104個(gè)/mL，取200 μL加入鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室上層，下室內(nèi)加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，待培養(yǎng)24 h后，取出上層小室，用消毒棉簽擦除小室背面的基質(zhì)膠及未穿膜細(xì)胞，置于甲醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS清洗2次。倒置顯微鏡下拍照，并計(jì)算穿膜數(shù)量。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn) 待細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后再培養(yǎng)24 h，37 ℃ PBS清洗2次，RIPA裂解，離心取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度。電泳后濕轉(zhuǎn)印至PVDF膜中，5%脫脂奶粉封閉60 min，4 ℃冰箱中孵育一抗過夜，TBST洗滌5次，二抗孵育60 min，顯影曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用 ±s表示，2組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOX7抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖作用 轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-SOX7高表達(dá)質(zhì)粒于PC-3細(xì)胞，經(jīng)Western blot驗(yàn)證pCDNA3.1-SOX7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后其SOX7蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（見圖1）。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染48 h后pCDNA3.1-SOX7組顯著抑制了PC-3細(xì)胞的增殖能力（見圖2）；流式細(xì)胞術(shù)檢查發(fā)現(xiàn)，pCDNA3.1-SOX7組誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯（見圖3）；Cyclin D1、E表達(dá)量下調(diào)，CDK2、4、6表達(dá)量無顯著性改變（見表1）。

2.2 SOX7抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲作用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-SOX7重組質(zhì)粒24 h后，pCDNA3.1-SOX7組PC-3細(xì)胞的遷移距離顯著性低于Vector組（見圖4、表2）；Transwell試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pCDNA3.1-SOX7組穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量也顯著性低于Vector組（見圖5、表2）；間質(zhì)表型標(biāo)記物MMP-2、MMP-9和N-cadherin蛋白表達(dá)減少，上皮標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)增加（見表1）。

圖1 pCDNA3.1-SOX7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SOX7蛋白表達(dá)水平變化

圖2 pCDNA3.1-SOX7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞增殖能力變化

3 討論

近年來，關(guān)于高遷移率族蛋白結(jié)構(gòu)域SOX家族基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，SOX7是wnt/β-catenin通路的負(fù)性調(diào)控因子，發(fā)揮著抑癌基因的作用。ZHAO等[13]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染SOX7質(zhì)粒后，細(xì)胞增殖受抑制，wnt/β-catenin轉(zhuǎn)錄水平降低，同時(shí)Cyclin D1和c-Myc蛋白表達(dá)下調(diào)，但轉(zhuǎn)染缺失HMG-box結(jié)構(gòu)域SOX7突變質(zhì)粒后，并不能引起上述現(xiàn)象，因此認(rèn)為，SOX7通過其本身的HMG-box結(jié)構(gòu)域結(jié)合β-catenin并抑制其活性，從而下調(diào)β-catenin介導(dǎo)的增殖活性，扮演著抑癌基因的作用。此外，在人子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、肝癌和乳腺癌的研究[8，14-17]中均有類似的報(bào)道。

細(xì)胞周期變化與細(xì)胞周期蛋白改變有關(guān)。其中Cyclin D/CDK4和Cyclin E/CDK2復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換，Cyclin A/CDK2復(fù)合物調(diào)控G1/S和G2/M期的轉(zhuǎn)換，而Cyclin B/CDK2復(fù)合物調(diào)控G2晚期進(jìn)入有絲分裂期。據(jù)報(bào)道[18]，SOX7通過調(diào)控wnt/β-catenin通路活性，從而控制Cyclin D1和c-myc的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖過程。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOX7抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖能力，并且誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，伴隨著Cyclin D1、E的顯著性下調(diào)，而CDK2與CDK4未見明顯改變，由此可見，SOX7抑制的CylcinD1/CDK4、Cyclin E/CDK2復(fù)合物水平下調(diào)與細(xì)胞周期結(jié)果一致。因此，我們認(rèn)為SOX7通過抑制Cyclin D1、E表達(dá)量，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生G1期阻滯，抑制細(xì)胞增殖。

圖3 pCDNA3.1-SOX7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞周期變化

SOX7抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移過程可能與抑制腫瘤血管生成及EMT發(fā)生有關(guān)。有研究報(bào)道，在斑馬魚發(fā)育過程中，敲除SOX7與SOX18表達(dá)導(dǎo)致血管功能缺失[19]。新近研究發(fā)現(xiàn)，SOX7聯(lián)合SOX17反饋調(diào)節(jié)于血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)，從而調(diào)控血管功能[20]。另外，EMT與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲密切相關(guān)[21]。CUI等[22]在胃癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，SOX7水平與細(xì)胞浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均具有相關(guān)性，認(rèn)為SOX7在胃癌轉(zhuǎn)移與浸潤過程中扮演重要角色。ZHONG等[23]在研究SOX7與前列腺癌患者生存率的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，SOX7在血清前列腺特異性抗原水平小于4 ng/mL的前列腺癌患者中有較高的表達(dá)量，并且在發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者中SOX7表達(dá)量顯著性低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，因此認(rèn)為，SOX7蛋白表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。SOX7在前列腺癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，而Gleason＜7的前列腺癌組織表達(dá)量大于Gleason≥7，說明SOX7表達(dá)量與前列腺癌浸潤程度有關(guān)[12]。此外，我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)SOX7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后顯著性抑制了細(xì)胞遷移與侵襲過程，伴隨著間質(zhì)表型標(biāo)記物MMP-2、MMP-9和N-cadherin蛋白的減少和上皮標(biāo)記物E-cadherin蛋白增加，這也說明SOX7轉(zhuǎn)染后對(duì)于前列腺癌EMT過程具有抑制作用。

綜上所述，SOX7抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖、周期、遷移及侵襲能力，其機(jī)制可能與調(diào)控這些細(xì)胞行為的相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

表1 pCDNA3.1-SOX7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和遷移/侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)變化（n=3， ±s）

圖4 pCDNA3.1-SOX7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞遷移能力變化（×40）

圖5 pCDNA3.1-SOX7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞侵襲能力變化（×100）

表2 pCDNA3.1-SOX7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化（n=3， ±s）

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（本文編輯：丁敏嬌）

Mechanisms and effects of transcription factor SOX7 on the biological activity of the prostate cancer PC- 3 cells

ZHENG Bin, WU Qiquan, ZHOU Kewen, WANG Gang, REN Yu, QI Honggang, ZHU Weizhi, WENGGuobin. Department of Urologic Surgery, Ningbo Yinzhou No.2 Hospital, Ningbo, 315100

R73-37；R737.25

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.011

2016-12-27

鄞州區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目；寧波市科技惠民項(xiàng)目（2017C50 058）。

鄭斌（1982-），男，浙江寧波人，主治醫(yī)師，碩士。

翁國斌，主任醫(yī)師，教授，Email：ddwgb@aliyun.com。