丹酚酸A對(duì)大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制

彭瀟，方世記，鄭麗云，邱偉文

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 麗水 323000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 介入科，浙江 麗水 323000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 麗水 323000）

丹酚酸A對(duì)大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制

彭瀟1，方世記2，鄭麗云1，邱偉文3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 麗水 323000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 介入科，浙江 麗水 323000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 麗水 323000）

目的：探討丹酚酸A（Sal A）對(duì)大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：采用線拴法構(gòu)建大腦中動(dòng)脈缺血再灌注（MCA-IR）模型。將正常SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（對(duì)照組）、MCA-IR模型組（MCA-IR組)、Sal A+MCA-IR組（Sal A組）；Sal A組于建模前1周每日腹腔注射1.0、2.5、5.0 mg/kg Sal A。于再灌注后24 h取梗死腦組織用TUNEL法檢測(cè)腦細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)磷酸化Akt（p-Akt）和Akt的表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)海馬區(qū)胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）的表達(dá)。結(jié)果：Sal A組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡率和MDA含量較MCA-IR組降低，而SOD量較MCA-IR組顯著增加（P＜0.05），MCA-IR組海馬區(qū)p-Akt表達(dá)較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05），而cPLA2較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05），1.0、2.5、5.0 mg/kg Sal A預(yù)處理后，MCA-IR模型大鼠海馬區(qū)cPLA2表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而p-Akt表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。結(jié)論：Sal A降低缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡，起到損傷保護(hù)作用，其機(jī)制與其降低cPLA2表達(dá)，激活A(yù)kt信號(hào)通路有關(guān)。

丹酚酸A；細(xì)胞凋亡；蛋白激酶B；腦缺血再灌注；大鼠

Abstract: Objective:To investigate the protective effect of salvianolic acid A (Sal A) against apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion model and its mechanism.Methods:SD rats were randomly divided into sham operation group (sham group), middle cerebral artery ischemia reperfusion model (MCA-IR) group (MCA-IR group), Sal A pretreatment and MCA-IR group (Sal A+MCA-IR group). MCA-IR was established in MCA-IR group and Sal A+MCA-IR group in which rats were pre-treated with 1.0, 2.5, 5.0 mg/kg Sal A via intraperitoneal injection daily for 1 week. The artery were reperfused for 24 h and rats were sacrificed. TUNEL was used to assayed the cell apoptosis, immunohistochemistry was implied to test the expression of cPLA2 and Western blot was undergone to analyzed p-Akt and total Akt. Immunohistochemistry was used to analyze the expression of cPLA2.Results:The apoptosis rate and MDA level in Sal A+MCA-IR group was lower, but SOD was higher than that in MCA-IR group (P＜0.05). The expression of p-Akt in Hippocampus of MCA-IR model decreased, while the expression of cPLA2 increased significantly compared with control group. 1.0, 2.5, 5.0 mg/kg Sal A pretreatment reversed the decrease of p-Akt and increase of cPLA2.Conclusion:Sal A inhibits the apoptosis through decreasing the expression of cPLA2 and activating Akt pathway signaling in MCA-IR model.

Key words:salvianolic acid A; apoptosis; protein kinase B; ischemia-reperfusion; rats

腦缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡和氧自由基的釋放是腦缺血嚴(yán)重臨床癥狀的主要原因[1-2]。研究證實(shí)胞漿型磷脂酶A2（cytosolic phospholipase A2，cPLA2）通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分子的代謝，參與腦缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[3-4]。丹酚酸A（sal-vianolic acid A，Sal A）是丹參藥物重要提取成分之一，是一種氧自由基清除劑，對(duì)氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[5-6]。但Sal A對(duì)腦缺血再灌注過(guò)程細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制仍未明確。因此，本研究采用大腦中動(dòng)脈缺血再灌注（middle cerebral artery ischemia reperfusion，MCA-IR）模型，研究Sal A對(duì)MCA-IR模型海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：Sal A購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司，TUNEL凋亡試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，p-Akt、Akt、β-Actin單克隆抗體購(gòu)買于美國(guó)CST公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：雄性SD大鼠25只，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2015-0009，體質(zhì)量（200±20）g。隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（對(duì)照組）5只，MCA-IR模型組（模型組）5只，Sal A+MCA-IR組（Sal A組）各15只。Sal A組又隨機(jī)分為3組，每組5只，于建模前1周分別每日腹腔注射1.0、2.5、5.0 mg/kg Sal A，模型組和對(duì)照組于建模前給予等量的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。

1.2 方法

1.2.1 MCA-IR模型建立：按照文獻(xiàn)[7]方法，采用線栓法制作MCA-IR模型，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后仰臥位固定，取正中切口，分離左頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，插入涂有肝素的尼龍線栓（直徑為0.25 mm），沿頸內(nèi)動(dòng)脈入顱至大腦前動(dòng)脈起始處、阻斷大腦中動(dòng)脈。術(shù)后大鼠蘇醒時(shí)出現(xiàn)右前肢屈曲和前進(jìn)時(shí)（右側(cè)劃圈狀），證明左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞成功。線栓插入深度為（20.0±0.5）mm，扎緊備線，縫合皮膚。缺血2 h后輕提預(yù)留線頭，使線栓頭端退至切口。大腦中動(dòng)脈繼續(xù)從Willis環(huán)獲得血供即為再灌注。對(duì)照組僅插入栓子15 mm，其余步驟同上。

1.2.2 大腦標(biāo)本收集：模型組、Sal A組中大鼠于再灌注24 h用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，立即置于無(wú)菌冰臺(tái)上斷頭處死；對(duì)照組假處理后，迅速開顱取腦組織，將一半腦組織置于PBS溶液中，再用液氮迅速冷凍保存用于Western blot方法檢測(cè)p-Akt/Akt表達(dá)及生化指標(biāo)檢測(cè)；另一半腦組織則置于4%中性甲醛溶液中固定，24 h后石蠟包埋、切片、備用。

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：腦片常規(guī)脫蠟處理后，滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，37 ℃下作用15 min，PBS洗滌3次；再用0.3%甲醇-過(guò)氧化氫溶液室溫孵育20 min，以滅活切片內(nèi)源的過(guò)氧化物酶。隨后用PBS洗滌3次，按照說(shuō)明書方法配制TUNEL檢測(cè)液，在樣品上加50 μL TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min，用PBS洗滌1次，滴加0.1～0.3 mL標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次；用50 μL Streptavidin-HRP工作液和0.2～0.5 mL DAB顯色液進(jìn)行樣品顯色。蘇木精復(fù)染，脫水、透明和封固，光鏡下觀察細(xì)胞凋亡，并統(tǒng)計(jì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腦組織cPLA2：腦片常規(guī)脫蠟處理后，置于0.3%甲醇-過(guò)氧化氫溶液中滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶，用0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。10%山羊血清37 ℃濕盒內(nèi)孵育30 min。加cPLA2一抗抗體（1∶500），4 ℃過(guò)夜。PBS漂洗2次，加入二抗抗體（抗鼠l∶500），濕盒內(nèi)37 ℃孵育1 h。PBS漂洗2次，加入DAB顯色液避光顯色15 min，流水沖洗終止反應(yīng)；蘇木精對(duì)比染色、脫水、透明、封固、光鏡觀察，陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本單個(gè)視野下TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取3個(gè)或3個(gè)以上視野，求平均值。

1.2.5 生化指標(biāo)檢測(cè)：按照文獻(xiàn)[8]方法，將腦組織用0.9%氯化鈉溶液制成質(zhì)量體積比為1∶9勻漿，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定腦組織中SOD、MDA，計(jì)算出MDA和SOD的含量。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)p-Akt/Akt表達(dá)：將腦組織均勻勻漿后，隨后加入組織裂解液冰上裂解15 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清。采用BAC法進(jìn)行蛋白定量。取20 μg總蛋白用4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，3%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，隨后PBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次8 min，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1～2 h，再用PBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次8 min，ECL試劑發(fā)光、顯影和定影，以對(duì)照組為參照，計(jì)算p-Akt/Akt相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以 ±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sal A抑制大鼠缺血再灌注模型中腦組織細(xì)胞凋亡 模型組海馬CA l區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比和MDA含量較對(duì)照組明顯增高（P＜0.05），而SOD較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）；Sal A組海馬CA l區(qū)凋亡細(xì)胞百分比和MDA含量較模型組明顯降低（P＜0.05），而SOD含量較模型組明顯增高（P＜0.05）。見表1。

2.2 Sal A抑制大鼠缺血再灌注腦組織中cPLA2表達(dá) 對(duì)照組大腦切片可見少許cPLA2表達(dá)，模型組與對(duì)照組比，腦切片中海馬CA 1區(qū)cPLA2表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）；1.0、2.5、 5.0 mg/kg Sal A組大腦切片中海馬CA 1區(qū)cPLA2表達(dá)量均較模型組明顯降低（P＜0.05），但仍高于對(duì)照組。見表2。

表1 各組腦組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、MDA和SOD含量比較（n=5， ±s）

表2 各組海馬CA 1區(qū)cPLA2表達(dá)量的比較（n=5， ±s）

2.3 p-Akt在Sal A治療缺血再灌注腦組織中的表達(dá) 對(duì)照組海馬CA 1區(qū)中p-Akt有表達(dá)，模型組海馬CA 1區(qū)p-Akt相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），1.0、2.5、5.0 mg/kg Sal A組海馬CA 1區(qū)p-Akt相對(duì)表達(dá)量較模型組明顯增高（P＜0.05）。見圖1。

3 討論

丹酚酸為唇型科植物丹參的干燥根及根莖的提取物，在臨床上應(yīng)用廣泛，可用于治療心腦血管疾病等缺血缺氧性疾病，其主要活性成分包括丹酚酸和丹參酮兩大類[5-6，9]。研究證實(shí)總丹酚酸和丹參酮類活性物質(zhì)可顯著降低心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中的細(xì)胞凋亡[9]，也有研究證實(shí)丹酚酸B抑制了缺血再灌注導(dǎo)致的海馬區(qū)組織損傷，減少細(xì)胞凋亡，而減少海馬區(qū)神經(jīng)元丟失[10]。但是Sal A對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用仍鮮有相關(guān)報(bào)道，因此，本研究重點(diǎn)分析Sal A對(duì)腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響，闡明其可能的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用Sal A治療缺血性再灌注損傷性疾病提供循證醫(yī)學(xué)根據(jù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sal A預(yù)處理1周，可顯著減少M(fèi)CA-IR模型SD大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，降低MDA含量，增加SOD含量，對(duì)腦組織細(xì)胞具有保護(hù)作用。

圖1 各組p-Akt/Akt的相對(duì)表達(dá)量比較

cPLA2能將膜甘油水解成花生四烯酸和溶血磷脂酶，具有廣泛的生物活性，在缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注時(shí)，cPLA2增加，促使血腦屏障功能紊亂[11]。有研究認(rèn)為，缺血再灌注損傷過(guò)程中，增高的cPLA2參與細(xì)胞凋亡，阻斷或敲低cPLA2表達(dá)，可顯著降低細(xì)胞的凋亡[12]。本研究亦證實(shí)大鼠MCA-IR模型海馬區(qū)cPLA2表達(dá)增加，而Sal A可顯著降低cPLA2的表達(dá)水平，提示Sal A降低海馬區(qū)細(xì)胞凋亡可能與抑制cPLA2表達(dá)有關(guān)。

Akt是細(xì)胞內(nèi)重要蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等功能[13-14]。已有研究證實(shí)Sal A通過(guò)激活A(yù)kt信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡[5-6，14]。本研究結(jié)果亦證實(shí)，MCA-IR模型腦組織Akt活化水平較對(duì)照組顯著降低，而Sal A預(yù)處理后，MCA-IR模型海馬區(qū)Akt活化水平顯著提高，提示Akt作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)分子，在Sal A保護(hù)海馬區(qū)缺血再灌注損傷中扮演重要角色。

本研究相關(guān)結(jié)果作為初步研究結(jié)果證實(shí)了Sal A作為丹酚酸的重要活性成分，抑制缺血再灌注損傷過(guò)程中海馬區(qū)細(xì)胞凋亡作用，具有保護(hù)作用，其具體分子機(jī)制可能與抑制cPLA2表達(dá)，激活A(yù)kt信號(hào)通路有關(guān)；但其分子機(jī)制仍需進(jìn)一步證實(shí)。我們將通過(guò)藥物阻斷或者基因敲除的方法，進(jìn)一步分析cPLA2和Akt信號(hào)通路在Sal A抑制缺血再灌注損傷過(guò)程中細(xì)胞凋亡的作用，并明確Akt和cPLA2兩者之間的相互關(guān)系，最終明確Sal A抑制缺血再灌注損傷腦細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

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（本文編輯：趙翠翠）

The protective effect of salvianolic acid A against apoptosis in middle cerebral artery ischemia reperfusion model and its mechanism

PENG Xiao1, FANG Shiji2, ZHENG Liyun1, QIU Weiwen3. 1.Department of Neu-rology, the Fifth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Lishui, 323000; 2.Department of Intervention, the Fifth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Lishui, 323000; 3.Department of Neurology, the Sixth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Lishui, 323000

R285；R743.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.010

2017-01-15

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017KY170）；麗水市公益性技術(shù)應(yīng)用項(xiàng)目（2016GYX39、2016GYX25）。

彭瀟（1983-），男，浙江麗水人，主治醫(yī)師。

邱偉文，主任醫(yī)師，Email：weiwenq@hotmail.com。