一株多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa對甘薯黑斑病的生物防治效果及作用機理初探

王 波,周澗楠,黃忠勤,丁震乾,常 勇,蘇在興,周興根

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農業(yè)科學研究所,江蘇 徐州 221131)

一株多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa對甘薯黑斑病的生物防治效果及作用機理初探

王 波,周澗楠,黃忠勤,丁震乾,常 勇,蘇在興,周興根*

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農業(yè)科學研究所,江蘇 徐州 221131)

XZ-2是本課題組分離到的一株大豆內生多粘類芽孢桿菌。探索了該菌株對甘薯黑斑病的生物防治效果及其作用機理。研究結果表明：與清水對照相比，用XZ-2發(fā)酵原液的10～100倍稀釋液處理貯藏期薯塊，可以極顯著地減小黑斑病病斑體積；在所有處理中，以XZ-2發(fā)酵原液的10倍稀釋液對甘薯黑斑病的防治效果最佳,達73.62%；XZ-2發(fā)酵濾液處理對甘薯黑斑病菌的菌絲形態(tài)沒有明顯的影響，但會導致該病菌菌絲產生厚垣孢子，且顯著地抑制其分生孢子的萌發(fā)。

多粘類芽孢桿菌;甘薯；黑斑病;生物防治效果；作用機理

Abstract：PaenibacilluspolymyxaXZ-2 is a biological control strain isolated from the healthy soybean plants. The biocontrol efficacy of XZ-2 against black rot of sweet potato and its action mechanism were explored. The results showed that: in comparison with the control (pure water), treating the stored sweet potatoes with the 10～100-fold diluent of XZ-2 fermentation broth could very significantly reduce the scab volume of black rot; among all treatments, the 10-fold diluent of XZ-2 fermentation broth had the best control efficacy against black rot of sweet potato, reaching 73.62%; the treatment with the diluent of XZ-2 fermentation broth had no obvious influence on the hyphal morphology of sweet potato black rot pathogen (Ceratocystisfimbriata), but it could cause the generation of chlamydospores, and could significantly inhibit the germination of conidia of this pathogen.

Keywords：Paenibacilluspolymyxa; Sweet potato; Black rot; Biocontrol efficacy; Action mechanism

多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa是一種能產生芽孢的革蘭氏陽性菌,該菌對人畜無致病性。多粘類芽孢桿菌可產生多種抗菌蛋白[1-2]、多粘菌素[3]、核苷類[4]、酚類[5]以及吡嗪類化合物[6]等抗菌物質以及IAA等植物生長調節(jié)劑[5]。近年來,有關多粘類芽孢桿菌用于植物抗病和植物促生等方面的研究報道很多,如Hong等(2016)報道了一株植物根圍促生菌多粘類芽孢桿菌菌株AC-1可抑制PseudomonassyringaeDC3000的生長并在擬南芥葉片中成功定殖,還可誘導PR-1、FRK1等抗病相關基因的表達[7];Kim等(2016)將根圍拮抗細菌多粘類芽孢桿菌菌株APEC128用于蘋果炭疽病的防治,其對該病的抑制率高達83.6%[8];Adhikari等(2017)首次將多粘類芽孢桿菌等兩種生防菌用于溫室西瓜生產中毀滅性種傳病害細菌性果斑病的防治,結果表明這兩種菌株可以顯著提高西瓜總葉綠素含量、植株重量、總鮮重以及總干重[9];Hao等(2017)對一株具有固氮能力的可作為潛在生物肥料的多粘類芽孢桿菌WLY78用gfp基因標記后,發(fā)現(xiàn)該菌可在黃瓜和玉米的根、莖、葉等組織中大量定殖[10];Mei等(2014)報道了一株產IAA的多粘類芽孢桿菌菌株可誘導黃瓜的抗病性，提高抗氧化酶活性，并促進黃瓜的生長[11];Zhou等(2016)報道多粘類芽孢桿菌菌株BFKC01可以通過調控根系相關基因的表達來促進擬南芥的鐵吸收能力[12];Shi等(2017)發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌菌株NSY50通過調控黃瓜根圍微生物群落使寄主植物受鐮刀菌侵染而發(fā)病的幾率降低了56.4%[13]。多粘類芽孢桿菌由于其廣泛的用途已經(jīng)被我國農業(yè)部列為免做安全鑒定的一級菌種。

甘薯黑斑病(black rot)是我國北方薯區(qū)三大重要病害之一,每年造成甘薯產量損失5%～10%。近年來,由于高溫高濕天氣增多,江淮薯區(qū)甘薯黑斑病迅速蔓延,造成的經(jīng)濟損失高達50%左右。該病的病原物甘薯長喙殼菌(CeratocystisfimbriataEllis et Halsted)屬子囊菌亞門、長喙殼屬真菌,可為害甘薯幼苗的莖基部，還能侵染甘薯塊根組織[14],且薯塊感染黑斑病后產生的黑皰霉酮等有毒物質可導致人畜食用后中毒[15]。目前,國際上有關甘薯黑斑病防控的相關研究報道極少,Hong等[16]在2016年首次報道了一株紅球菌KB6可提高甘薯對黑斑病的抗性;而我國目前尚未見甘薯黑斑病的生防菌株篩選及其應用的相關報道。因此甘薯黑斑病的綠色防控已成為甘薯植保工作者面臨的重要課題之一。本課題組從健康大豆植株中分離篩選鑒定獲得一株具有廣譜抗真菌活性的多粘類芽孢桿菌菌株XZ-2,已有的研究表明XZ-2對甘薯黑斑病菌的平板拮抗活性很強,平均抑菌直徑高達35.6 mm[17]。本文進一步測定了XZ-2對貯藏期甘薯黑斑病的防治效果,并對該菌株的作用機理進行了初步探索,以期為甘薯黑斑病生防菌劑的開發(fā)應用奠定基礎,為甘薯黑斑病的綠色防控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1供試材料

1.1.1 生防菌株 多粘類芽孢桿菌菌株XZ-2由本課題組分離篩選自江蘇省徐州市銅山區(qū)班井村大豆健康植物,經(jīng)過純化后采用甘油保存于-20 ℃冰箱。

1.1.2 供試病原菌 供試病原菌甘薯黑斑病菌由南京農業(yè)大學殺菌劑組贈送并保存于4 ℃冰箱。

1.1.3 培養(yǎng)基 采用PDA培養(yǎng)基(土豆20 g/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂粉15 g/L,水1000 mL)培養(yǎng)甘薯黑斑病菌;采用LBA培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0 g/L,酵母提取物5.0 g/L,氯化鈉10.0 g/L)活化多粘類芽孢桿菌,采用LB液體培養(yǎng)基制備多粘類芽孢桿菌菌株XZ-2的發(fā)酵液。將配制的各類培養(yǎng)基于121 ℃下高壓滅菌20 min，備用。

1.2多粘類芽孢桿菌XZ-2對薯塊黑斑病的防治

1.2.1 薯塊的準備 收獲徐32的甘薯，將其入庫，經(jīng)高溫愈合后,選取無病蟲害、大小適中的薯塊,將薯塊洗凈晾干后,用75%酒精消毒并自然晾干,待用。

1.2.2 實驗方案設計 共設置5個處理：處理1，清水對照;處理2，XZ-2發(fā)酵原液的10倍稀釋液;處理3，XZ-2發(fā)酵原液的50倍稀釋液;處理4，XZ-2發(fā)酵原液的100倍稀釋液;處理5，多菌靈1600倍稀釋液。每個處理供試3個薯塊，用孢子懸浮液接種準備好的薯塊。

1.2.3 薯塊黑斑病菌的接種 參考趙永強等(2011)[18]的方法制備黑斑病菌的孢子懸浮液,用無菌接種針(針頭長度為0.5 cm)蘸取孢子懸浮液接種；將已接種黑斑病菌的薯塊裝入已消毒的周轉箱中,加蓋消毒紗布保濕；將周轉箱置于約為26 ℃的恒溫室中,每天往保濕紗布上噴水。待培養(yǎng)10 d左右,切開薯塊測量病斑直徑和深度,計算病斑體積和防治效果,相關計算公式如下:病斑體積V=1/2×π×h×(d/2)2;防治效果(%) =(對照薯塊的病斑體積-處理薯塊的病斑體積)/對照薯塊的病斑體積×100%。

1.3多粘類芽孢桿菌XZ-2對黑斑病菌菌絲形態(tài)以及產孢類型的影響

從XZ-2拮抗黑斑病菌的平板菌落邊緣挑取少量菌絲,置于加水的載玻片上,蓋上蓋玻片,在倒置顯微鏡(Leica DMILLED, Germany)下觀察菌絲形態(tài)以及產孢情況,并于40倍物鏡下拍照。從未經(jīng)XZ-2發(fā)酵液處理的黑斑病菌平板中挑取菌落邊緣的菌絲，作為對照。

1.4多粘類芽孢桿菌XZ-2發(fā)酵濾液對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

用22 μm孔徑的無菌濾器過濾XZ-2發(fā)酵濾液，獲得無菌濾液；將黑斑病菌平板中的孢子洗脫并鏡檢以后,取500 μL孢子懸浮液加入盛有20 mL XZ-2發(fā)酵濾液的滅菌平板中,將處理好的平板置于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h左右后取出,采用上述倒置顯微鏡觀察孢子的萌發(fā)情況,并于40倍物鏡下拍照記錄。以經(jīng)滅菌水處理的孢子作為對照。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用DPS v.7.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析,應用Duncan氏新復極差法進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1多粘類芽孢桿菌XZ-2發(fā)酵液對薯塊黑斑病的防治效果

在接種培養(yǎng)10 d后，取出薯塊并拍照，結果如圖1所示：經(jīng)XZ-2 3種不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液處理的薯塊的表面病斑直徑均顯著小于對照薯塊的；經(jīng)對照化學藥劑多菌靈1600倍稀釋液處理的薯塊的表面病斑直徑大于經(jīng)XZ-2不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液處理薯塊的。

從左到右依次為用清水、XZ-2 10倍稀釋液、XZ-2 50倍稀釋液、XZ-2 100倍稀釋液和多菌靈1600倍稀釋液接種處理后的薯塊。

圖1XZ-2發(fā)酵液對薯塊黑斑病的生物防治效果

進一步計算各處理的病斑體積和防治效果并采用軟件進行統(tǒng)計分析,結果(表1)表明：經(jīng)清水處理的薯塊病斑體積高達35.08 mm3,而經(jīng)XZ-2發(fā)酵原液10倍、50倍、100倍稀釋液處理的薯塊的病斑體積分別僅有9.27、23.17、17.27 mm3,與清水對照的差異均達到了極顯著水平；經(jīng)XZ-2發(fā)酵原液10倍稀釋液處理的薯塊的病斑體積顯著小于經(jīng)XZ-2發(fā)酵原液50倍、100倍稀釋液處理薯塊的；經(jīng)多菌靈1600倍液處理的薯塊的病斑體積為26.00 mm3,與對照的病斑體積呈顯著性差異,與100倍XZ-2發(fā)酵稀釋液處理的病斑體積呈顯著性差異,與10倍XZ-2發(fā)酵稀釋液處理的病斑體積呈極顯著性差異；XZ-2發(fā)酵原液10倍稀釋液的防治效果最佳,達73.62%，極顯著高于50倍XZ-2發(fā)酵稀釋液和多菌靈1600倍液處理的防效；對照藥劑多菌靈1600倍液的防效僅為23.99%。

表1 XZ-2發(fā)酵液對甘薯黑斑病的生物防治效果

注:同列數(shù)據(jù)后附不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復極差法檢驗處理間差異顯著(P<0.05);附不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2多粘類芽孢桿菌XZ-2發(fā)酵液對黑斑病菌菌絲形態(tài)的影響

由圖2可見, 菌株XZ-2的發(fā)酵液對甘薯黑斑病菌的菌絲形態(tài)沒有明顯的作用。說明該菌株對黑斑病菌的拮抗機制并不是抑制菌絲生長或者導致菌絲極性改變或者導致菌絲畸形。

2.3多粘類芽孢桿菌XZ-2發(fā)酵液對黑斑病菌菌絲產孢的影響

進一步通過顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)菌絲產孢類型發(fā)生了明顯改變,如圖3所示,左圖中未經(jīng)XZ-2處理的菌絲產生的孢子主要為分生孢子,而右圖中經(jīng)XZ-2處理后的菌絲產生的孢子大約50%為分生孢子,另外50%為厚垣孢子。

左圖為對照;右圖為XZ-2發(fā)酵液處理。

2.4多粘類芽孢桿菌XZ-2發(fā)酵濾液對黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制

培養(yǎng)6 h后，經(jīng)滅菌水處理的黑斑病菌孢子已正常萌發(fā)長出芽管,而經(jīng)過XZ-2發(fā)酵濾液處理的黑斑病菌孢子并未萌發(fā),如圖4所示,表明XZ-2發(fā)酵濾液可顯著抑制黑斑病菌孢子的萌發(fā)。

左圖為滅菌水處理;右圖為XZ-2發(fā)酵液處理。

3 小結與討論

3.1小結

本實驗結果表明：與清水對照相比，用多粘類芽孢桿菌XZ-2發(fā)酵原液的10～100倍稀釋液處理貯藏期薯塊，可以極顯著地減小黑斑病病斑體積；在所有處理中，以XZ-2發(fā)酵原液的10倍稀釋液對甘薯黑斑病的防治效果最佳,達73.62%；XZ-2發(fā)酵濾液處理對甘薯黑斑病菌的菌絲形態(tài)沒有明顯的影響，但會改變該病菌菌絲的產孢類型，顯著抑制其孢子的萌發(fā)。因此,推薦使用10倍XZ-2發(fā)酵稀釋液防治貯藏期甘薯黑斑病。

3.2討論

據(jù)報道[19]，生防菌株對作物病原菌菌絲具有致畸、改變菌絲生長極性以及抑制孢子萌發(fā)等作用。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株XZ-2發(fā)酵液處理并未對黑斑病菌菌絲的形態(tài)產生明顯的影響。這與其他的報道有所不同,可能是由于各生防菌株的來源不同,產生的拮抗活性物質類型不同,其作用機理也有所差異。但是, XZ-2在很大程度上影響了黑斑病菌的產孢類型,經(jīng)XZ-2處理后的黑斑病菌產生的孢子中有一半左右為厚垣孢子,厚垣孢子具有厚壁,需要經(jīng)過一段時間休眠后才可萌發(fā),這在很大程度上影響了該病菌的無性繁殖,降低了該病菌的生長速度；但是厚垣孢子同時也具有抗逆性強的特點,在條件適宜的情況下還可再次萌發(fā)生長。這可能也是黑斑病菌與該多粘類芽孢桿菌相互作用的機制之一。

本文證明了多粘類芽孢桿菌XZ-2對貯藏期甘薯黑斑病具有很好的防治效果。XZ-2是從大豆植株中分離得到的,而該菌株能否在甘薯體內定殖？能否誘導甘薯抗病相關蛋白基因的表達？能否調控甘薯根圍微生物群落？這些問題尚不清楚,有待以后進一步研究。

[1] Kavitha S, Senthikumar S, Gnanamanickam S, et al. Isolation and partial characterization of antifungal protein fromBacilluspolymyxastrain VLB16 [J]. Process Biochemistry, 2005, 40: 3236-3243.

[2] Cho K M, Hong S Y, Lee S M, et al. A cel44C-man26A gene of endophyticPaenibacilluspolymyxaGS01 has multi-glycosyl hydrolases in two catalytic domains [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 73: 618-630.

[3] He Z G, Kisla D, Zhang L W, et al. Isolation and identification of aPaenibacilluspolymyxastrain that coproduces a novel lantibiotic and polymyxin [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73: 168-178.

[4] Piuri M, Sanchez-Rivas C, Ruzal S M. A novel antimicrobial activity of aPaenibacilluspolymyxastrain isolated from regional fermented sausages [J]. Letters in Applied Microbiology, 1998, 27: 9-13.

[5] Lebuhn M, Heulin T, Hartmann A. Production of auxin and other indolic and phenolic compounds byPaenibacilluspolymyxastrains isolated from different proximity to plant roots [J]. FEMS Microbiology Ecology, 1997, 22: 325-334.

[6] Beck H C, Hansen A M, Lauritsen F R. Novel pyrazine metabolites found in polymyxin biosynthesis byPaenibacilluspolymyxa[J]. FEMS Microbiology Letters, 2003, 220: 67-73.

[7] Hong C E, Kwon S Y, Park J M. Biocontrol activity ofPaenibacilluspolymyxaAC-1 againstPseudomonassyringaeand its interaction withArabidopsisthaliana[J]. Microbiological Research, 2016, 185: 13-21.

[8] Kim Y S, Balaraju K, Jeon Y H. Biological control of apple anthracnose byPaenibacilluspolymyxaAPEC128, an antagonistic rhizobacterium [J]. The Plant Pathology Journal, 2016, 32(3): 251-259.

[9] Mahesh A, Dil R Y, Kim S W, et al. Biological control of bacterial fruit blotch of watermelon pathogen (Acidovoraxcitrulli) with rhizosphere associated bacteria [J]. The Plant Pathology Journal, 2017, 33(2): 170-183.

[10] Hao T Y, Chen S F. Colonization of wheat, maize and cucumber byPaenibacilluspolymyxaWLY78 [J]. PLOS ONE, DOI: 10.1371/journal.pone.0169980.

[11] Mei L, Liang Y, Zhang L, et al. Induced systemic resistance and growth promotion in tomato by an indole-3-acetic acid-producing strain ofPaenibacilluspolymyxa[J]. Annals of Applied Biology, 2014, 165: 270-279.

[12] Zhou C, Guo J S, Zhu L, et al.PaenibacilluspolymyxaBFKC01 enhances plant iron absorption via improved root systems and activated iron acquisition mechanisms [J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2016, 105: 162-173.

[13] Shi L, Du N S, Shu S, et al.PaenibacilluspolymyxaNSY50 suppressesFusariumwilt in cucumbers by regulating the rhizospheric microbial community [J]. Scientific Reports, DOI: 10.1038/srep41234.

[14] Halsted B D. Some fungous diseases of the sweet potato: the black rot [J]. New Jersey Agriculture Experiment Station Bulletin, 1890, 76: 7-14.

[15] 孫厚俊,劉美艷,宗瑋瑋,等.黑斑病對甘薯體內幾種保護酶活性的影響[J].廣西農學報,2011,26(3):14-17.

[16] Hong C E, Jeong H Y, Jo S H, et al. A leaf-inhabiting endophytic bacterium,Rhodococcussp. KB6, enhances sweet potato resistance to black rot disease caused byCeratocystisfimbriata[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2016, 26(3): 488-492.

[17] 王波,周澗楠,黃忠勤,等.一株大豆內生拮抗細菌XZ-2的分離和分子鑒定[J].大豆科學,2016,6(35):997-1001.

[18] 趙永強,孫厚俊,陳曉宇,等.可溶性硅對甘薯苗期黑斑病抗性的影響[J].西南農業(yè)學報,2011,24(1):128-131.

[19] Yang D J, Wang B, Wang J X, et al. Activity and efficacy ofBacillussubtilisstrain NJ-18 against rice sheath blight and sclerotinia stem rot of rape [J]. Biological Control, 2009(51): 61-65.

(責任編輯:黃榮華)

BiocontrolEfficacyofAPaenibacilluspolymyxaStrainagainstBlackRotofSweetPotatoandItsActionMechanism

WANG Bo, ZHOU Jian-nan, HUANG Zhong-qin, DING Zhen-qian,CHANG Yong, SU Zai-xing, ZHOU Xing-gen*

(Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area in Jiangsu, Xuzhou 221131, China)

S482.292

A

1001-8581(2017)10-0040-04

2017-06-13

教育部農作物生物災害綜合治理重點實驗室/農業(yè)部華東作物有害生物綜合治理重點實驗室開放基金項目;優(yōu)質多抗超 高產麥稻新品種徐麥31、徐68優(yōu)201產業(yè)化(BA2014074)。

王波(1982─),男,江蘇銅山人,碩士,主要從事植物病理學研究。*通訊作者:周興根。