菌種和發(fā)酵條件對菜籽粕中植酸和單寧的影響

孫 林，劉 平，陳金和，卓偉偉，吳海明

（1.江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學院，江西 樟樹 331200；2.江西四特酒業(yè)有限責任公司，江西 樟樹 331200）

營養(yǎng)與飼料

菌種和發(fā)酵條件對菜籽粕中植酸和單寧的影響

孫 林1，劉 平1，陳金和1，卓偉偉1，吳海明2

（1.江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學院，江西 樟樹 331200；2.江西四特酒業(yè)有限責任公司，江西 樟樹 331200）

利用植物乳酸菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌、釀酒酵母菌對菜籽粕進行單菌固態(tài)發(fā)酵，采用3因素3水平的拉丁方設計，觀察接種量、麩皮添加量、發(fā)酵時間對發(fā)酵菜籽粕中植酸和單寧含量的影響。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌是去除植酸的最優(yōu)菌種，以9%接種量、15%麩皮添加量、發(fā)酵48 h效果最好，植酸去除率63.2%；黑曲霉菌為去除單寧的最優(yōu)菌種，以9%接種量、10%麩皮添加量、發(fā)酵48 h效果最好，單寧去除率77.3%。

植酸；單寧；發(fā)酵；菜籽粕

AbstractThe solid-state fermentation of rapeseed meal was carried out by using four kinds of strains of Lactobacillus plantarum,Bacillus subtilis,Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae.Using three factors three levels of Latin square design,the effects of inoculation amount,amount of bran added and fermentation time on phytic acid and tannin content in rapeseed meal were observed.The results showed Bacillus subtilis was the best strain to remove phytate,9%inoculation amount,15%bran addition amount,fermentation 48 h for the appropriate fermentation conditions,that the removal rate of phytic acid are 63.2%;Aspergillus niger was the best strain to remove tannin,9%inoculation amount,10%bran addition amount,fermentation 48 h for the appropriate fermentation conditions,that the removal rate of tannin are 77.3%.

Key wordsphytic acid;tannin;fermentation;rapeseed meal

我國油菜產(chǎn)量居世界之最，每年油菜籽制油可產(chǎn)生600多萬t的菜籽粕[1]，是國內(nèi)主要的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)飼料資源之一，蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸組成較平衡[2]，然而菜籽粕中含有多種抗營養(yǎng)因子，嚴重限制了菜籽粕在動物生產(chǎn)中的應用。去除菜籽粕中多種抗營養(yǎng)因子是利用菜籽粕的重要途徑。

目前對菜籽粕的脫毒方法主要分為物理脫毒、化學脫毒和生物學脫毒等。物理法效果不明顯，營養(yǎng)成分損失大，不能充分利用資源[3]?；瘜W脫毒法具有成本高、污染嚴重的缺點[4]。生物學方法分為酶法和微生物發(fā)酵法。近年來人們采用添加植酸酶和木聚糖酶等方法來提高菜籽粕飼用價值[5-6]，取得一定效果，但酶價格昂貴不利于推廣。微生物發(fā)酵法具有成本小、操作簡單的優(yōu)點，是理想的脫毒方法，備受青睞。國內(nèi)外對菜籽粕的脫毒研究較多，主要集中在脫除硫甙、異硫氰酸酯和噁唑烷硫酮[7]。

隨著雙低油菜的推廣及去除硫甙的研究初見成效，菜籽粕中植酸和單寧的抗營養(yǎng)作用逐漸凸顯出來。本文選用植物乳酸菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌、釀酒酵母菌對菜籽粕進行固態(tài)發(fā)酵試驗，研究菌種和發(fā)酵條件對菜籽粕中植酸和單寧的影響，為更好地開發(fā)利用菜籽粕這一優(yōu)良的蛋白質(zhì)資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2016年3月16日至2017年5月15日在江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學院農(nóng)科實訓樓微生物實驗室進行。

1.2 試驗材料

1.2.1 原料 菜籽粕：由江西金佳谷物股份有限公司提供，水分含量11.2%，粗蛋白質(zhì)含量36.2%，植酸含量為2.26%，單寧含量6.57 mg/g。麩皮：本地市售，含水量12.6%，植酸含量為2.17%。原料粉碎過40目篩備用。

1.2.2 菌種 植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學院微生物實驗室篩選保存菌種。黑曲霉菌（Aspergillus niger）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）由江西四特酒業(yè)有限責任公司提供。

1.2.3 培養(yǎng)基 植物乳酸菌用MRS培養(yǎng)基，黑曲霉菌用察氏培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，釀酒酵母菌用麥芽汁培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子及種子液的制備 植物乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基，38℃，靜置培養(yǎng)48 h；黑曲霉菌接種到察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h；釀酒酵母菌接種到麥芽汁培養(yǎng)基，30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h；枯草芽孢桿菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。從上述培養(yǎng)好的菌液中，以5%的接種量分別接到各菌的發(fā)酵種子培養(yǎng)液中（培養(yǎng)基成分同各菌增殖培養(yǎng)基），培養(yǎng)24 h，制成發(fā)酵種子液。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 將菜籽粕、麩皮（按不同添加量的配比）裝入200 mL錐形瓶中，混合均勻，按水料比1.5∶1加入水分，塞緊棉塞后外裹牛皮紙封口，115℃滅菌20 min，冷卻破塊打散，將各菌的發(fā)酵種子液（按不同的接種量）接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，34℃進行單菌的發(fā)酵試驗，攪拌均勻，靜置發(fā)酵。發(fā)酵過程中定時（24 h、36 h、48 h）取樣，烘干粉碎，測定樣品中植酸和單寧的含量。

1.4 試驗設計

采用2重復的3因素3水平的拉丁方設計，研究接種量、培養(yǎng)基麩皮添加量、發(fā)酵時間對植物乳酸菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌、釀酒酵母菌發(fā)酵菜籽粕效果的影響，測定發(fā)酵菜籽粕中植酸、單寧的含量變化，具體見表1。

表1 多因素拉丁方設計

1.5 菜籽粕中主要抗營養(yǎng)因子的測定方法

植酸的測定方法采用三氯化鐵比色法[8]。單寧的測定方法：按GB/T 15686—1995[9]進行。

1.6 統(tǒng)計分析

結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)處理與分析采用SAS 4.24的GLM程序進行，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種和發(fā)酵條件對菜籽粕中植酸的影響

表2結(jié)果顯示，對同一因素不同水平的植酸含量取平均值進行比較，枯草芽孢桿菌對植酸的降解效果要優(yōu)于其他菌種，發(fā)酵樣品植酸含量低于其他3種試驗菌種。Kerovuo等（1998）研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生植酸酶，可以分解植酸，釋放其中的磷，提高動物對磷的吸收利用[10]。Ashok等（2001）、Kim等（1998）等也有相同的發(fā)現(xiàn)[11-12]。國內(nèi)也做了這方面的研究。范繼英等（2006）發(fā)現(xiàn)了能產(chǎn)生植酸酶的枯草芽孢桿菌菌株[13]。這些研究結(jié)果與本試驗的結(jié)果相符合，枯草芽孢桿菌對植酸的降解效果明顯。同時試驗發(fā)現(xiàn)，接種量、麩皮添加量及發(fā)酵時間對枯草芽孢桿菌降解菜籽粕中植酸的影響顯著。其次，植物乳酸菌和黑曲霉菌對植酸的降解也有一定作用，效果次于枯草芽孢桿菌，國內(nèi)外也有研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉菌、乳酸桿菌也能夠分泌植酸酶[14-15]。釀酒酵母菌對植酸的降解效果最差，植酸含量基本無變化。這可能與釀酒酵母菌的酶系主要為糖酶有關(guān)，其對植酸的利用率較低。因此，枯草芽孢桿菌是去除植酸的最優(yōu)菌種。

表2 菌種和發(fā)酵條件對各菌種去除發(fā)酵菜籽粕中植酸的影響 %

2.1.1 接種量對不同菌種去除植酸的影響 由圖1可知，接種量對植酸的去除效果影響明顯的是枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌，各接種量水平間植酸含量差異顯著（P<0.05）?？莶菅挎邨U菌在接種量為9%時，發(fā)酵菜籽粕中植酸含量下降了62.2%（P<0.05）。接種量對植酸降解率影響較小是黑曲霉菌，黑曲霉菌在接種量為6%時，菜籽粕中植酸含量顯著低于接種量為 3%時（P＜0.05），但與 9%時植酸含量對比不明顯（P＞0.05）。釀酒酵母菌各接種量水平對植酸的去除率均較低，各接種量水平間含量差異不顯著（P＞0.05）。因此高接種量水平對枯草芽孢桿菌和植物乳酸菌去除菜籽粕中植酸是必要的。

圖1 接種量對各菌降解菜籽粕中植酸的影響

2.1.2 麩皮添加量對不同菌種去除植酸的影響固體發(fā)酵基質(zhì)麩皮的作用一是為微生物發(fā)酵提供必要的氮源；二是改變發(fā)酵基質(zhì)致密的結(jié)構(gòu)，改變基質(zhì)張力，并使基質(zhì)疏松多孔，為好氧菌的生長提供適宜的環(huán)境。因此麩皮添加量也是決定固態(tài)發(fā)酵成功與否的關(guān)鍵因素之一。從圖2和表2可見，麩皮添加量對枯草芽孢菌去除植酸的影響顯著（P＜0.05），隨著麩皮添加量增多，植酸去除率明顯提高，這可能與枯草芽孢桿菌的好氧性有關(guān)，麩皮添加量的增多使發(fā)酵基質(zhì)更加疏松多孔，利于好氧菌的生長，在麩皮添加量為15%時植酸的去除率顯著高于其他麩皮添加量水平的結(jié)果（P＜0.05）。但高麩皮添加量卻不利于植物乳酸菌等厭氧菌的生長，植物乳酸菌對植酸的去除率隨著麩皮添加量的增多而下降，麩皮添加量為15%時菜籽粕的植酸含量顯著高于麩皮添加量為5%時菜籽粕中植酸含量（P＜0.05）。黑曲霉菌和釀酒酵母菌對植酸的降解受麩皮添加量的影響較小，這可能與真菌類生物對氧的敏感度程度較低有關(guān)。

圖2 麩皮添加量對各菌降解菜籽粕中植酸的影響

2.1.3 發(fā)酵時間對不同菌種去除植酸的影響 如圖3所示，發(fā)酵時間對植物乳酸菌、枯草芽孢桿菌去除植酸的影響顯著（P＜0.05），各發(fā)酵時間水平菜籽粕中植酸含量差異顯著（P＜0.05），枯草芽孢桿菌在發(fā)酵48 h植酸去除率達到63.1%。黑曲霉菌在發(fā)酵36 h對植酸的去除率與發(fā)酵48 h對植酸的去除率差異不顯著（P＞0.05），表明黑曲霉菌對植酸的降解能力達到飽和，對植酸的降解能力有限。釀酒酵母菌對植酸的去除率較差，且隨著發(fā)酵時間延長菜籽粕中植酸含量無明顯變化，表明釀酒酵母菌對植酸的去除效果并不會隨著發(fā)酵時間延長而改善，其對植酸的去除作用較弱。

圖3 發(fā)酵時間對各菌去除菜籽粕中植酸的影響

2.2 菌種和發(fā)酵條件對菜籽粕中單寧的影響

由表3結(jié)果可知，黑曲霉菌對發(fā)酵菜籽粕中單寧的降解明顯優(yōu)于其他菌種，發(fā)酵48 h單寧降解率達到76.7%。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉菌能產(chǎn)生單寧酶及植酸酶[16-17]，這與試驗結(jié)果相符合，在本試驗中黑曲霉菌對單寧的去除能力優(yōu)于對植酸的去除能力，表明黑曲霉菌分泌單寧酶的能力優(yōu)于其分泌植酸酶的能力。植物乳酸菌和釀酒酵母菌對單寧的降解能力較黑曲霉菌差異明顯，這與植物乳酸菌和釀酒酵母菌的酶系多以淀粉酶等糖酶為主有關(guān)[18]，對單寧這類多酚類抗營養(yǎng)因子的處理能力不足。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，植物乳酸菌對硫甙這種糖類衍生物的抗營養(yǎng)因子處理效果上反而比較突出[19-20]，而釀酒酵母菌對淀粉類多糖的利用率較高。枯草芽孢桿菌對單寧的處理效果最差，單寧含量基本無變化，這與枯草芽孢桿菌的酶系主要為蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶有關(guān)[21]。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌對單寧無法利用，高劑量的單寧反而對枯草芽孢的生長造成抑制[22]。因此，黑曲霉菌對單寧的去除效果最好。

2.2.1 接種量對不同菌種去除單寧的影響 從表3和圖4試驗結(jié)果可以看出，接種量對黑曲霉菌去除菜籽粕中單寧的影響顯著，各接種量水平間單寧的含量差異顯著（P<0.05），接種量達到9%時單寧降解率達到76.4%，比接種量3%時降解率66.1%高出10.3個百分點。而植物乳酸菌在接種量為9%時與接種量為3%和6%時差異顯著（P<0.05）。而枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌的各接種量間單寧的去除率差異不顯著。因此，高接種量水平的黑曲霉菌對去除菜籽粕中的單寧是必不可少的。

表3 菌種和發(fā)酵條件對各菌種去除發(fā)酵菜籽粕中單寧的影響 mg/g

圖4 接種量對各菌降解菜籽粕中單寧的影響

2.2.2 麩皮添加量對不同菌種去除單寧的影響 由表3可知，麩皮添加量對各菌種去除菜籽粕中單寧的影響不顯著，只有當麩皮添加量達到10%時對黑曲霉菌的影響較大，與5%的麩皮添加量時菜籽粕中單寧的含量差異顯著（P<0.05），表明添加適量的麩皮有利于黑曲霉菌的生長和酶系中單寧酶的分泌。

2.2.3 發(fā)酵時間對不同菌種去除單寧的影響 圖5和表3結(jié)果所示，發(fā)酵時間對黑曲霉菌、植物乳酸菌、釀酒酵母菌去除單寧的影響顯著，其中對黑曲霉菌的影響最大，各發(fā)酵時間水平單寧的含量差異顯著（P<0.05），而植物乳酸菌和釀酒酵母菌在發(fā)酵48 h時與發(fā)酵24 h和36 h時差異顯著（P<0.05）。因此要保證各菌對單寧的去除效果，應當適度延長發(fā)酵時間。

圖5 發(fā)酵時間對各菌去除菜籽粕中單寧的影響

3 小結(jié)

本試驗條件下，發(fā)酵菜籽粕中的植酸和單寧均得到不同程度的降解?？莶菅挎邨U菌為去除植酸的最優(yōu)菌種，以9%接種量、15%麩皮添加量、發(fā)酵48 h為較適宜的初步發(fā)酵條件，植酸含量0.83%，去除率達63.2%；而黑曲霉菌為降解菜籽粕中單寧的優(yōu)勢菌種，以9%接種量、10%麩皮添加量、發(fā)酵48 h為較適宜的初步發(fā)酵條件，單寧去除率77.3%。

[1] 蔣新正.中國油脂[J] ，2002（6）：73-74.

[2] 彭健，蔣思文.中國飼料[J] ，2001（14）：7-9.

[3] 郁建平.中國飼料[J] ，1997，19（2）：64-68.

[4] 祁凌云，李紹鈺，安汝義，等.中國飼料[J] ，1998（4）：45-47.

[5] 張妮婭，齊德生.中國糧油學報[J] ，2004，19（5）：69-74.

[6] 卿中全，于炎湖，吳謀成，等.飼料工業(yè)[J] ，2000（4）：18-21.

[7] Shim Y H,Chae B J.Asian Australasian Journal of Animal Sciences[J] ,2003,9(16):1339-1347.

[8] 傅啟高，李慧荃.營養(yǎng)學報[J] ，1997，19（2）：216-221.

[9] 朱曉茵，孫彩云.飼料工業(yè)[J] ，1995，16（5）：40-42.

[10] Kerovuo J,Lauraeus M,Nurminen P,et al.Applied and Environmenta1 Microbiology[J] ,1998,64(6):2079-2085.

[11] Ashok P,George S,Carlos R Soccol,et al.Bioresource Technology[J] ,2001,77:203-214.

[12] Kim Y O,Kim H K,Bae K S,et al.Enzyme and Microbial Technology[J] ,1998,22:2-7.

[13] 范繼英，何月秋.云南農(nóng)業(yè)大學學報[J] ，2006，21（6）：12-16.

[14] Kerovuo J,Tynkkynen S.Letters in Applied Microbiology[J] ,2000,30:325-329.

[15] 王曉東，麥康森，張彥嬌，等.中國海洋大學學報[J] ，2013（2）：78-83.

[16] 李秧針，邱樹毅，保玉心，等.微生物學通報[J] ，2009（8）：1123-1129.

[17] 王曉東，胡海濱，麥康森，等.水產(chǎn)學報[J] ，2016（10）：51-55.

[18] 沈蓮清，蘇光耀，王向陽，等.食品與生物技術(shù)學報[J] ，2006，25（5）：121-127.

[19] 李彩霞，李鵬，劉沐榮，等.甘肅科學學報[J] ，2000，12（3）：92-96.

[20] 劉軍，朱文優(yōu).食品與發(fā)酵工業(yè)[J] ，2007，33（1）：69-72.

[21] 胡德朋，唐家毅，曹昱，等.水產(chǎn)科學[J] ，2008，27（2）：86-88.

[22] 喬家運，陳龍賓，李平.飼料研究[J] ，2010（11）：11-13.

（編輯：富春妮）

Effects of Strains and Fermentation Conditions on Phytic Acid and Tannin in Rapeseed Meal

SUN Lin1,LIU Ping1,CHEN Jinhe1,ZHUO Weiwei1,WU Haiming2
(1.Jiangxi Agricultural Engineering College,Zhangshu 331200,China;2.Jiangxi Sitir Liquor Limited Company,Zhangshu 331200,China)

S816

A

1002-1957(2017)05-0009-04

2017-09-08

孫 林（1982-），男，山東煙臺人，講師，碩士，研究方向為動物營養(yǎng)及飼料科學.E-mail:what198219@163.com