高原低氧對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MDR1、 MRP1和BCRP蛋白及mRNA表達(dá)的影響 ※

周雪姣，年永瓊，楊 夢，辛元堯，喬一杰，朱 琳，楊建鑫，李向陽*

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

高原低氧對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MDR1、 MRP1和BCRP蛋白及mRNA表達(dá)的影響※

周雪姣1，年永瓊1，楊 夢1，辛元堯1，喬一杰2，朱 琳1，楊建鑫2，李向陽2*

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

目的探討高原低氧對大鼠肝臟中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MDR1、MRP1、BCRP蛋白及mRNA表達(dá)的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為七組：平原對照組和中度海拔急性缺氧組、中度海拔慢性缺氧組、高度海拔急性缺氧組、高度海拔慢性缺氧組、中海拔慢性缺氧返回西寧組、高海拔慢性缺氧返回西寧組。采用ELISA和實(shí)時(shí)定量PCR法分別測定MDR1、MRP1、BCRP蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果與平原組相比，MDR1的蛋白表達(dá)在其他六組的大鼠肝臟顯著降低了16.3%、27.3%、27.3%、33.1%、39.0%、41.3%；MDR1的mRNA表達(dá)在其他六組的大鼠肝臟顯著降低了33.0%、34.0%、48.1%、47.2%、48.1%、52.8%；MRP1在肝臟中的蛋白表達(dá)顯著降低了19.4%、31.7%、34.0%、50.9%、52.0%、56.0%；MRP1在肝臟中的mRNA表達(dá)顯著降低了18.9%、23.4%、36.9%、30.6%、27.0%、29.7%；BCRP在大鼠肝臟中的蛋白表達(dá)顯著降低了25.9%、38.6%、37.0%、54.1%、53.1%、66.8%；BCRP在大鼠肝臟中的mRNA表達(dá)顯著降低了14.8%、34.8%、44.3%、40.9%、51.3%、43.5%。結(jié)論高原低氧環(huán)境下，肝臟中MDR1、MRP1、BCRP蛋白及mRNA表達(dá)均減少。此發(fā)現(xiàn)為高原地區(qū)合理設(shè)計(jì)臨床用藥方案提供理論依據(jù)。

高原低氧 轉(zhuǎn)運(yùn)體 蛋白 mRNA 表達(dá)

高原低氧顯著影響藥物在機(jī)體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，在缺氧條件下，肝臟的代謝能力受限，大多數(shù)藥物生物轉(zhuǎn)化率降低，清除率會受到影響。D Souich等[1]發(fā)現(xiàn)低氧血癥改變了家兔苯妥英鈉藥代動力學(xué)的特征，使其CL降低。張娟紅等[2]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)普萘洛爾在急進(jìn)高原組大鼠體內(nèi)藥代參數(shù)發(fā)生顯著變化，達(dá)峰濃度、藥-時(shí)曲線下面積增大，平均滯留時(shí)間、半衰期延長，清除率減小。本課題組發(fā)現(xiàn)在急進(jìn)平原志愿者和久居3 800 m的高原志愿者體內(nèi)磺胺甲噁唑的吸收和代謝發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為t1/2延長、CL降低[3]。通過以上研究，在高原低氧環(huán)境中大部分的藥物在體內(nèi)的代謝會減慢。細(xì)胞色素CYP450是體內(nèi)最重要的藥物代謝酶，其中CYP1、CYP2和CYP3對藥物代謝都有非常重要的影響。Fradette等[4，5]發(fā)現(xiàn)，在急性低氧條件下大鼠和家兔體內(nèi)CYP2B4、CYP2B6、CYP2C5、CYP2C9、CYP2C16和CYP2C19的活性降低、表達(dá)減少。李向陽等[6]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高原急、慢性缺氧條件下，CYP2C9和CYP2C19的蛋白表達(dá)沒有變化，但是在高海拔急性缺氧時(shí)CYP2C19活性顯著升高。目前關(guān)于高原低氧對藥物的動力學(xué)特征和藥物代謝酶的影響已有較多報(bào)道，但是高原低氧對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響報(bào)道甚少且結(jié)論不一。

已有的研究均為經(jīng)過化學(xué)方法誘導(dǎo)缺氧[7]，或者是通過低壓氧艙[8，9]模擬低氧環(huán)境對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白和mRNA變化的影響進(jìn)行研究。尚未有自然高原環(huán)境對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響研究。本實(shí)驗(yàn)將大鼠置于不同海拔地區(qū)，研究高原自然低氧對大鼠肝臟MDR1、MRP1和BCRP蛋白及mRNA表達(dá)的影響，為高原地區(qū)合理設(shè)計(jì)臨床用藥方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

TGL-16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，680型酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)，BT25S電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器公司)，CFX96實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(美國伯樂公司)，MAX-XP超速離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.1.2 試劑

大鼠MDR1酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢生工生物工程股份有限公司，批號：L150928296)，大鼠MRP1酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢生工生物工程股份有限公司，批號：L150928278)，大鼠BCRP酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢生工生物工程股份有限公司，批號：L150928277)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20151028)，Premix EX Taq TMⅡ(TakaRa，Japan，批號：AK6803)，RNAiso Plus(TakaRa，Japan，批號：04022)，F(xiàn)ast Quant RT kit(with gDNase)(北京天根生物科技有限公司，批號：03326)，Buffer RZ(北京天根生物科技有限公司，批號：03715)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純水為純凈水。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級健康Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半，體重200±20 g(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證編號：2012-003)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組

SD大鼠隨機(jī)分成七組：平原對照組(P，西安，海拔400 m，大氣氧分壓為20 kPa)，中度海拔急性缺氧組(AMH，平原大鼠急進(jìn)青海共和后生活1 d，海拔2900 m，大氣氧分壓為15.1 kPa)，中度海拔慢性缺氧組(CMH，平原大鼠急進(jìn)青海共和后生活40 d，海拔和大氣氧分壓同上一組)，高度海拔急性缺氧組(AHH，平原大鼠急進(jìn)果洛花石峽后生活1 d，海拔4600 m，大氣氧分壓為12.4 kPa)，高度海拔慢性缺氧組(CHH，平原大鼠急進(jìn)果洛花石峽后生活40 d，海拔和大氣氧分壓同上一組)，中海拔慢性缺氧返回西寧組(CMH-XN，平原大鼠急進(jìn)青海共和后生活40 d回到西寧適應(yīng)7 d)，高海拔慢性缺氧返回西寧組(CHH-XN，平原大鼠急進(jìn)果洛花石峽后生活40 d回到西寧適應(yīng)7 d)。

1.2.2 樣品采集

用20%烏拉坦(1 mL/200 g)麻醉大鼠。待大鼠昏迷后固定其四肢，分離出腹主動脈并取血于無抗凝劑的真空采血管。采用兩步灌注法，對肝臟進(jìn)行灌注，將分離肝臟組織分三份，用錫紙包裹，于液氮冷凍保存待測。

中線輸水總干渠北京段因采用管道輸水需增加加壓泵站，由此發(fā)生提水泵站的耗電量費(fèi)用，建議根據(jù)北京段加壓泵站實(shí)際耗電量和電價(jià)計(jì)算動力費(fèi)。

1.2.3 肝微粒的制備

從液氮中取出肝臟標(biāo)本，冰上解凍，剪碎后精密稱量肝組織0.5 g，加入1.5 mL的1 moL·L-1Tris-HCl(pH=7.4)，用勻漿器在冰上勻漿，制成25%肝組織勻漿液，離心(4 ℃，11 000 r/min)30 min后轉(zhuǎn)移上清液1 mL于超速離心管中，置超高速離心機(jī)，裝入轉(zhuǎn)子空轉(zhuǎn)使超高速離心機(jī)冷卻，將配平后的上清液離心(4℃，100 000 r/min)80 min后棄上清液，沉淀為肝微粒體，加入600 μL Hepes-HCl溶液，用移液槍反復(fù)吹打，混懸均勻后分裝三份，放置-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 MDR1、MRP1和BCRP蛋白的表達(dá)檢測

用ELISA法檢測MDR1、MRP1和BCRP蛋白的表達(dá)：將試劑盒放在冰上解凍，按照說明書對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔，在酶標(biāo)包被板上的標(biāo)準(zhǔn)孔準(zhǔn)確加樣50 μL，于37 ℃溫育2 h后棄去孔內(nèi)液體，甩干，不用洗滌，后每孔加入檢測液A 50 μL，覆上薄膜，于37 ℃溫育1 h后棄去孔內(nèi)液體，每孔加入175 μL的洗滌液，浸泡1～2 min后棄去孔內(nèi)液體，拍干，重復(fù)洗板三次。每孔加入檢測液B 50 μL，覆上薄膜，于37 ℃溫育30 min后棄去孔內(nèi)液體，加洗滌液洗滌5次，拍干。每孔先后加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻后于37 ℃避光顯色10 min后加終止液50 μL，終止反應(yīng)，此時(shí)由藍(lán)色變成黃色，置酶標(biāo)儀450 nm波長處測各孔的光密度，將樣品的OD值分別代入MDR1回歸方程y=22.131OD-2.5708，r=0.9988；MRP1回歸方程y=3.9517OD-0.2546，r=0.9963；BCRP回歸方程y=20.828OD-2.9306，r=0.9977，計(jì)算對應(yīng)的蛋白濃度。

1.2.5 MDR1、MRP1和BCRP mRNA的表達(dá)測定

用Real-Time PCR法測定MDR1、MRP1和BCRP mRNA的表達(dá)：取出之前保存在液氮中的肝臟，冰上解凍后稱取50 mg，加入裂解液1 mL后勻漿，勻漿后在常溫下放置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離，后面的操作按照總RNA提取試劑盒說明提取RNA，利用蛋白核酸定量儀測定RNA吸光度比值(A260/A280)和濃度。根據(jù)gDNA去除體系加入樣本RNA、Buffer和ddH2O，再根據(jù)反轉(zhuǎn)錄體系加入試劑，之后將10 μL的反轉(zhuǎn)錄體系加入到gDNA去除體系中，于42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min后放在冰上，得到cDNA。再按照PCR混合體系配比先加入引物、ddH2O和酶進(jìn)行預(yù)混后加入cDNA 1 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃，30 s；95 ℃，5 s，40個(gè)循環(huán)；56 ℃，30 s；95 ℃，10 s；65 ℃，5 s；95 ℃，15 s。引物(由上海生工生物工程股份有限公司合成)序列見表1。

表1引物序列表

Table 1 The sequence of the primers

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 高原低氧對MDR1、MRP1、BCRP蛋白表達(dá)的影響結(jié)果

與平原組相比，MDR1在中度海拔急性缺氧、中度海拔慢性缺氧、高度海拔急性缺氧、高度海拔慢性缺氧、中海拔慢性缺氧返回西寧組和高海拔慢性缺氧返回西寧組的大鼠肝臟的蛋白表達(dá)分別顯著降低了16.3%、27.3%、27.3%、33.1%、39.0%、41.3%；同時(shí)，MRP1在肝臟中的蛋白表達(dá)分別顯著降低了19.4%、31.7%、34.0%、50.9%、52.0%、56.0%；BCRP在大鼠肝臟中的蛋白表達(dá)分別顯著降低了25.9%、38.6%、37.0%、54.1%、53.1%、66.8%。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2。

Table 2 Effects of Plateau hypoxia on the protein expression of MDR1，MRP1 and BCRP(ng/g，±s，n=10)

*：與平原對照組相比較，P<0.05.

2.2 高原低氧對MDR1、MRP1、BCRP mRNA表達(dá)的影響結(jié)果

與平原組相比，MDR1在中度海拔急性缺氧、中度海拔慢性缺氧、高度海拔急性缺氧、高度海拔慢性缺氧、中海拔慢性缺氧返回西寧組和高海拔慢性缺氧返回西寧組大鼠肝臟的mRNA表達(dá)分別顯著降低了33.0%、34.0%、48.1%、47.2%、48.1%、52.8%；MRP1在肝臟中的mRNA表達(dá)分別顯著降低了18.9%、23.4%、36.9%、30.6%、27.0%、29.7%；BCRP在大鼠肝臟中的mRNA表達(dá)分別顯著降低了14.8%、34.8%、44.3%、40.9%、51.3%、43.5%。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表3。

Table 3 Effects of Plateau hypoxia on the mRNA expression of MDR1， MRP1 and BCRP(±s，n=10)

*：與平原對照組相比，P<0.05.

3 討論

當(dāng)機(jī)體不管是以急性還是慢性的形式暴露在高原中，由于環(huán)境中氧分壓降低，致組織中氧的供應(yīng)減少，使其代謝功能紊亂。低氧會使血液中多種代謝物含量發(fā)生不同程度的變化，導(dǎo)致機(jī)體本身酸堿失衡及肝損傷、肺水腫、腦水腫[10，11]，還有對小腸黏膜的破壞[12]等，可能會對相應(yīng)組織器官上的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)及活性產(chǎn)生一定的影響，最終引起藥物的藥代動力學(xué)相關(guān)參數(shù)的變化[13，14]。

目前利用高原自然環(huán)境對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MDR1、MRP1和BCRP表達(dá)的調(diào)節(jié)尚未報(bào)道。本研究在高原自然環(huán)境下發(fā)現(xiàn)，高原急、慢性缺氧均導(dǎo)致藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MDR1、MRP1和BCRP蛋白及mRNA表達(dá)降低。Fouassier等[15]通過建立大鼠肝動脈缺血模型發(fā)現(xiàn)，MRP2的蛋白及mRNA水平都下降。Fujino等[16]研究表明，缺氧使HepG2細(xì)胞中MRP2的蛋白及mRNA水平的表達(dá)下調(diào)。Lo等[17]發(fā)現(xiàn)，人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞缺氧處理后抑制MRP2的表達(dá)。李文斌等人[8]發(fā)現(xiàn)，在缺氧72 h后P-gp的mRNA水平及蛋白的表達(dá)下調(diào)，使左氧氟沙星的外排減少，增加其在腸道的吸收。這些文獻(xiàn)報(bào)道都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。羅冰峰等[9]通過模擬急進(jìn)高原缺氧發(fā)現(xiàn)，肝臟中MDR1、MRP2的蛋白及mRNA水平隨著缺氧時(shí)間延長均有升高的趨勢，缺氧24 h后表達(dá)水平達(dá)到最高，72 h后MDR1、MRP2的表達(dá)減少。推測可能是急性缺氧條件下肝細(xì)胞在代償范圍內(nèi)產(chǎn)生的適應(yīng)性變化。Min等[7]通過培養(yǎng)人肺腺癌A549/CDDP細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下MRP的蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高。這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，可能是因?yàn)槟M急性缺氧或使用低壓氧艙僅針對低氧，但高原環(huán)境的特點(diǎn)不止是低氧，低溫、強(qiáng)輻射、干燥等條件在模擬時(shí)被忽視，無法真實(shí)反映高原環(huán)境。從平原進(jìn)入高原不管是通過什么交通工具都需要一定的時(shí)間，可以讓機(jī)體有個(gè)適應(yīng)周邊環(huán)境的過程。但缺氧模型缺少了這個(gè)適應(yīng)過程，在進(jìn)入高原較長時(shí)間后機(jī)體才會形成慢性缺氧，而模擬環(huán)境一般都是急性缺氧，所以通過高原的實(shí)際環(huán)境才能更真實(shí)地反應(yīng)出高原低氧環(huán)境下藥物代謝的變化。

缺氧是如何引起MDR1、MRP1和BCRP的表達(dá)變化，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程較為復(fù)雜，其途徑尚不清楚。

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TheproteinandmRNAExpressionofDrugTransportsMDR1，MRP1andBCRPafterExposuretoHigh-AltitudeHypoxia※

ZHOU Xue-jiao1，NIAN Yong-qiong1，YANG Meng1，XIN Yuan-yao1， QIAO Yi-jie2，ZHU Lin1，YANG Jian-xin2，LI Xiang-yang2*(

1.College of Ecological and Environmental Engineering，Qinghai University，Xining，Qinghai，810016，China； 2.Medical College of Qinghai University，Xining，Qinghai，810001，China)

ObjectiveThe present study was designed to investigate the regulation of Drug Transports by acute and chronic hypoxia in high altitude environments.MethodsThe rats were randomly divided into control group，plain group，acute middle altitude hypoxia group，chronic middle altitude hypoxia group，acute high altitude hypoxia group，chronic high altitude hypoxia group，chronic middle altitude hypoxia group returned to Xining and chronic high altitude hypoxia group returned to Xining.ELISA and real-time quantitative PCR were used to analyze the protein and mRNA expression of MDR1，MRP1 and BCRP，respectively.ResultsCompared with the control group，The protein expression of MDR1 was significantly decreased by 16.3%，27.3%，27.3%，33.1%，39.0%，41.3% in the rest of the groups，respectively，and the mRNA expression of MDR1 was significantly decreased by 33.0%，34.0%，48.1%，47.2%，48.1%，52.8%，respectively.The protein expression of MRP1 was significantly decreased by 19.4%，31.7%，34.0%，50.9%，52.0%，56.0%，respectively，and the mRNA expression of MRP1 was significantly decreased by 18.9%，23.4%，36.9%，30.6%，27.0%，29.7%，respectively. The protein expression of BCRP was significantly decreased by 25.9%，38.6%，37.0%，54.1%，53.1%，66.8%，respectively，and the mRNA expression of BCRP was significantly decreased by 14.8%，34.8%，44.3%，40.9%，51.3%，43.5%，respectively.ConclusionThe present study demonstrates that the protein and mRNA expression of MDR1，MRP1 and BCRP are significantly less in rats exposed to AMH，AHH，CHH，CMH，R-CMH and R-CHH.This study may play an important role in the rational design of clinical drugs at a high altitude.

High Altitude Hypoxia Drug Transports Protein mRNA Expression

R969.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.03.007

2017-5-8

※：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81460568，81760673)，青海省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2016-ZJ-902)；*：通信作者，博士生導(dǎo)師，E-mail：qhmclxy@163.com 周雪姣(1994～)，女，漢族，陜西籍，青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院2015級碩士研究生