不同誘導(dǎo)條件下的VBNC狀態(tài)副溶血弧菌的PMA-qPCR定量檢測(cè)及其呼吸活性分析

劉羽霏，方 祥，廖振林，王 麗，鐘青萍*

不同誘導(dǎo)條件下的VBNC狀態(tài)副溶血弧菌的PMA-qPCR定量檢測(cè)及其呼吸活性分析

劉羽霏，方 祥，廖振林，王 麗，鐘青萍*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

定量檢測(cè)不同誘導(dǎo)條件下的活的非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC） 狀態(tài)副溶血弧菌的變化情況，并對(duì)VBNC菌的呼吸活性進(jìn)行分析。采用疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）與熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（fl uorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）結(jié)合的技術(shù)（PMA-qPCR）定量檢測(cè)副溶血弧菌活菌數(shù)。結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀優(yōu)化傳統(tǒng)CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）呼吸檢測(cè)法對(duì)VBNC狀態(tài)的副溶血弧菌進(jìn)行分析。結(jié) 果表明PMA-qPCR檢測(cè)技術(shù)結(jié)合平板計(jì)數(shù)的方法，可用于定量檢測(cè)副溶血弧菌誘導(dǎo)過(guò)程中活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù)的變化情況，并利用差值測(cè)定出VBNC細(xì)胞的濃度。在不同的溫度、NaCl含量和氯霉素含量的誘導(dǎo)條件下，副溶血弧菌在其中的7 種條件下在60 d內(nèi)進(jìn)入了VBNC狀態(tài)。VBNC細(xì)胞終濃度最低為5.75×102CFU/mL，最高為1.70×105CFU/mL。在細(xì)胞呼吸實(shí)驗(yàn)中，采用CTC與4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）雙染法能在激光掃描共聚焦顯微鏡下清晰地觀(guān)察到VBNC細(xì)胞表面的紅色熒光，有效區(qū)分死活細(xì)胞。同時(shí)利用流式細(xì)胞儀能夠根據(jù)熒光強(qiáng)度快速區(qū)分呼吸活性呈陰性和陽(yáng)性的細(xì)胞。本研究為VBNC細(xì)菌的檢測(cè)和生理特性的研究提供了新的思路和依據(jù)。

副溶血弧菌；活的非可培養(yǎng)（VBNC）狀態(tài)；PMA-qPCR；流式細(xì)胞儀；激光掃描共聚焦顯微鏡

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種革蘭氏陰性兼性厭氧菌，主要存在于海產(chǎn)品和鹽漬食品中。人食用了受該菌污染且未煮熟的海產(chǎn)品后，會(huì)出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐等癥狀，重癥患者還會(huì)脫水、休克昏迷，甚至死亡。該菌引起的食物中毒在我國(guó)境內(nèi)[1-2]乃至全球多地均有報(bào)道[3-4]。

活的非可培養(yǎng)（vi able but non-culturable，VBNC）狀態(tài)是由Xu Huaishu等[5]通過(guò)對(duì)水環(huán)境中大腸桿菌（Escherichia coli）和霍亂弧菌（Vibrio cholera）的研究首次提出的概念。VBNC狀態(tài)是指細(xì)菌于常規(guī)條件下培養(yǎng)時(shí)，不生長(zhǎng)繁殖，但仍具有代謝活性的活菌的一種“休眠狀態(tài)”[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在處于極端溫度、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓沖擊、甚至是強(qiáng)烈的白光照射等環(huán)境壓力下，會(huì)進(jìn)入VBNC狀態(tài)[8-10]。VBNC狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)很快引起了微生物學(xué)界的重視，不斷有新的病原菌被發(fā)現(xiàn)能夠進(jìn)入VBNC狀態(tài)[11]，這無(wú)疑對(duì)食品安全和人類(lèi)健康構(gòu)成了潛在威脅。

VBNC狀態(tài)細(xì)胞的檢測(cè)與鑒定一直受到研究者的廣泛關(guān)注。疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）與熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）結(jié)合的技術(shù)（PMA-qPCR）是近幾年興起的一種能有效區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)[12-13]。利用PMA不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，能選擇性地與細(xì)胞膜破損的死細(xì)胞DNA分子結(jié)合從而阻斷DNA分子的PCR擴(kuò)增的特點(diǎn)[14]，克服了傳統(tǒng)PCR不能區(qū)分死活細(xì)胞的缺點(diǎn)[15]。這種方法被證實(shí)可用于VBNC狀態(tài)細(xì)菌的檢測(cè)[16-17]，并且該技術(shù)具有準(zhǔn)確定量的能力。呼吸檢測(cè)法是根據(jù)細(xì)胞新陳代謝過(guò)程中的氧化還原能力采取的檢測(cè)手段。CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是一種常用的細(xì)胞呼吸指示劑[18]，可用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌的呼吸活性。但傳統(tǒng)的使用單一CTC染料的呼吸檢測(cè)法因結(jié)果不易被觀(guān)察易造成誤檢而受到應(yīng)用上的限制[19]。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）是一種核酸染劑，能透過(guò)細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，發(fā)出藍(lán)色熒光，多應(yīng)用于細(xì)胞定位[20]和計(jì)數(shù)[21]。采用CTC/DAPI雙染的方法能在顯微鏡下清晰地觀(guān)察到細(xì)胞位置及其呼吸活性。多種染料配合作用及結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀等新技術(shù)的應(yīng)用，提高了呼吸檢測(cè)法的準(zhǔn)確性，為VBNC檢測(cè)提供了新思路[22-23]。

本研究采用實(shí)驗(yàn)室建立的PMA-qPCR方法對(duì)VBNC狀態(tài)的副溶血弧菌進(jìn)行定量檢測(cè)，并采用與激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀結(jié)合的細(xì)胞呼吸檢測(cè)法對(duì)其生理特性進(jìn)行分析。為VBNC狀態(tài)副溶血弧菌的檢測(cè)和生理特性的研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株副溶血弧菌ATCC17802，購(gòu)自廣東省菌種保藏中心，貯存于-80 ℃。

1.1.2 培養(yǎng)基

含質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基（TSB）：胰蛋白胨15 g/L，大豆蛋白胨5 g/L，氯化鈉30 g/L，最終pH值為7.3±0.2。在TSB中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.8%的瓊脂粉后即為質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%胰蛋白胨大豆肉湯固體培養(yǎng)基（TSA），用于平板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌可培養(yǎng)數(shù)。

1.1.3 試劑

PMA 美國(guó)Biotium公司；qPCR反應(yīng)試劑盒（SGExcel FastSYBR Mixture（Plus）） 上海生工生物工程股份有限公司；LIVE/DEAD細(xì)胞試劑盒 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京索萊 寶生物技術(shù)股份有限公司；CTC日本同仁化學(xué)研究所；DAPI 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo Scientifi c公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppe ndorf公司；CFX96 Touch? qPCR儀美國(guó)Bio-Rad公司；鹵鎢燈（650 W） 德國(guó)Osram公司；熒光顯微鏡 德國(guó)Leica公司；LSM 780激光共聚焦掃描顯微鏡 德國(guó)Zeiss公司；Fortessa X-20流式細(xì)胞儀美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 副溶血弧菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)

將細(xì)菌接種到含質(zhì) 量分?jǐn)?shù)3% NaCl的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)14 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 的菌懸液，8 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用滅菌的3% NaCl溶液清洗菌體2 次，將菌體分成3 組，第1組用3% NaCl溶液稀釋菌體，誘導(dǎo)溫度分別為-20、4、28 ℃和56 ℃；第2組分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1%、10%和15%NaCl溶液稀釋菌體，誘導(dǎo)溫度為4 ℃；第3組用3%NaCl溶液稀釋菌體，加入一定量的氯霉素溶液使誘導(dǎo)液中氯霉素含量分別達(dá)到1/2 MIC、1 MIC、2 MIC和4 MIC（氯霉素MIC為0.625 μg/mL），誘導(dǎo)溫度為4 ℃。各誘導(dǎo)液中細(xì)菌初始濃度約為1×107CFU/mL。

1.3.2 PMA-qPCR定量檢測(cè)

1.3.2.1 PMA處理

用ddH2O配制20 mmol/L的PMA貯存液，-20 ℃避光保存。在1.5 mL離心管中加入0.5 mL菌液，加入終濃度為20 μmol/L的P MA，充分混勻，避光處理5 min。然后將離心管開(kāi)蓋置于冰上，在650 W鹵鎢燈下曝光15 min，樣品距離燈管20 cm[24]。處理后的樣品12 000 r/min離心5 min并用0.01 mol/L 磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌除凈殘留的PMA。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取DNA，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

1.3.2.2 qPCR方法的建立

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的副溶血弧菌ATCC 17802菌株的tlh基因序列（基因序列號(hào)JX262976.1），利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物。上游引 物：5’-TCGTGCGAAAGTGCTTGAGATG-3’，下游引物：5’-CGGTGAGTTGCTGTTGTTGGAT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為288 bp。優(yōu)化后的qPCR反應(yīng)體系為25 μL，含DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL（終濃度0.2 μmol/L），預(yù)混體系12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min， 95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)，同時(shí)收集熒光，循環(huán)結(jié)束后72 ℃保持5 min。溶解曲線(xiàn)分析：65～95 ℃，每5 s升高0.5 ℃。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取副溶血弧菌的DNA，對(duì)其進(jìn)行10～107倍梯度稀釋作為qPCR的模板。以循環(huán)數(shù)Ct值和細(xì)菌濃度（平板計(jì)數(shù)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.3 VBNC狀態(tài)副溶血弧菌的確認(rèn)

可培養(yǎng)菌數(shù)用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定，活菌數(shù)用PMA-qPCR定量檢測(cè)。每隔一定時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)樣品中的可培養(yǎng)菌數(shù)和活菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)?；罹鷶?shù)與可培養(yǎng)菌數(shù)的差值即為VBNC狀態(tài)菌數(shù)。當(dāng)誘導(dǎo)至可培養(yǎng)菌數(shù)為0，而活菌數(shù)不為0時(shí)，即可認(rèn)為細(xì)菌全部進(jìn)入了VBNC狀態(tài)。最后用LIVE/DEAD細(xì)胞試劑盒染色后在熒光顯微鏡下觀(guān)察以確認(rèn)細(xì)胞的死活狀態(tài)。

1.3.4 細(xì)胞 呼吸法分析副溶血弧菌的VBNC狀態(tài)

將樣品分成2 組，一組用于流式細(xì)胞儀分析，一組用于激光掃描共聚焦顯微鏡觀(guān)察。

根據(jù)產(chǎn)品使用說(shuō)明，在1 mL樣品中加入CTC染料37 ℃孵育60 min。然后用500 μL PBS沖洗，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，去除上重懸液，用于流式細(xì)胞儀的分析。第2組在樣品染色離心后加入100 μL PBS重懸細(xì)胞，將10 μL細(xì)胞放至玻片上。在冰上靜置30 min，使細(xì)胞黏附于玻片上，然后用10 μL 4%多聚甲醛溶液在冰上固定30 min。用5 μL 5 μg/mL的DAPI給細(xì)胞DNA染色10 min，之后用PBS沖洗2 次，蓋上蓋玻片，用固封劑密封，用于激光掃描共聚焦顯微鏡的觀(guān)察。CTC和DAPI的激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為488/650 nm和364/385～470 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

在1.2×102～1.2×109CFU/mL的細(xì)菌濃度范圍內(nèi)，熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷 的循環(huán)數(shù)Ct（y）與細(xì)菌濃度（lg（CFU/mL））（x）呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，y=3.236 4x+45.189，R2=0.999 6，在此范圍內(nèi)可用Ct值對(duì)樣品中的活菌數(shù)進(jìn)行定量分析。

2.2 不同溫度誘導(dǎo)條件下副溶血弧菌的定量檢測(cè)

結(jié)合平板計(jì)數(shù)和PMA-qPCR的方法，對(duì)在不同溫度誘導(dǎo)條件下的副溶血弧菌的可培養(yǎng)菌數(shù)和活菌數(shù)的變化進(jìn)行測(cè)定。樣品分別在4 種溫度（-20、4、28 ℃和56 ℃）條件下進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)60 d的情況如圖1所示。-20、4 ℃和56 ℃的樣品在60 d內(nèi)進(jìn)入VBN C狀態(tài)，可培養(yǎng)菌數(shù)為0時(shí)活菌數(shù)不為0，此時(shí)的所有活菌均進(jìn)入VBNC狀態(tài)。誘導(dǎo)時(shí)間從短到長(zhǎng)依次為56、-20、4 ℃，VBNC狀態(tài)細(xì)胞終濃度從多到少依次為4、56、-20 ℃。3 種誘導(dǎo)條件下VBNC狀態(tài)細(xì)胞終濃度均在5.75×102CFU/mL以上，其中4 ℃達(dá)到約1×105CFU/mL。在28 ℃誘導(dǎo)條件下，副溶血弧菌并未在60 d內(nèi)進(jìn)入VBNC狀態(tài)。其可培養(yǎng)菌數(shù)與活菌數(shù)的變化曲線(xiàn)幾乎一致，無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

圖1 不同溫度誘導(dǎo)條件下副溶血弧菌可培養(yǎng)菌數(shù)和活菌數(shù)的變化Fig. 1 Quantitative detection of V. parahaemolyticus induced at different temperatures

2.3 不同NaCl含量誘導(dǎo)條件下副溶血弧菌的定量檢測(cè)

圖2 不同鹽濃度誘導(dǎo)條件下副溶血弧菌可培養(yǎng)菌數(shù)和活菌數(shù)的變化Fig. 2 Quantitative detection of V. parahaemolyticus induced by different salinities

如圖2所示，60 d內(nèi)細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)條件為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、10%、15% NaCl。在0.5% NaCl的誘導(dǎo)條件下副溶血弧菌在第40天完全進(jìn)入VBNC狀態(tài)，在10% NaCl和15% NaCl的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)時(shí)間則縮短至5 d。3 種誘導(dǎo)條件下VBNC狀態(tài)細(xì)胞終濃度均達(dá)到約104CFU/mL，其中在15% NaCl條件下最高，為1.7×105CFU/mL。在1% NaCl誘導(dǎo)條件下，副溶血弧菌并未在60 d內(nèi)全部進(jìn)入VBNC狀態(tài)。但活菌數(shù)與可培養(yǎng)菌數(shù)間差異明顯（P＜0.05）。

2.4 不同氯霉素含量誘導(dǎo)條件下副溶血弧菌的定量檢測(cè)

圖3 不同氯霉素含量誘導(dǎo)條件下副溶血弧菌可培養(yǎng)菌數(shù)和活菌數(shù)的變化Fig. 3 Quantitative detection of V. parahaemolyticus induced by different concentrations of chloramphenicol

如圖3所示，60 d內(nèi)細(xì)胞全部進(jìn)入VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)條件只有4 MIC，誘導(dǎo)時(shí)間為50 d，VBNC狀態(tài)細(xì)胞終濃度為2.5×103CFU/mL。在1/2 MIC、1 MIC和2 MIC誘導(dǎo)條件下，副溶血弧菌均未在60 d內(nèi)全部進(jìn)入VBNC狀態(tài)。可培養(yǎng)菌數(shù)與活菌數(shù)的變化曲線(xiàn)幾乎一致，差異不明顯（P＞0.05）。

2.5 熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果

利用LIVE/DEAD細(xì)胞試劑盒能在熒光顯微鏡下觀(guān)察染色后的細(xì)胞，確認(rèn)細(xì)胞的死活狀態(tài)。在熒光顯微鏡中，不同波長(zhǎng)激發(fā)光下，活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。對(duì)副溶血弧菌的正常狀態(tài)、VBNC狀態(tài)和死亡狀態(tài)的觀(guān)察結(jié)果如圖4。正常狀態(tài)下的副溶血弧菌主要呈現(xiàn)綠色；死亡狀態(tài)下的副溶血弧菌呈現(xiàn)紅色。而處于VBNC狀態(tài)下的副溶血弧菌仍有大部分呈現(xiàn)綠色。可見(jiàn)完全處于VBNC狀態(tài)下的副溶血弧菌中仍存在相當(dāng)多的活細(xì)胞，從而可以確認(rèn)這些VBNC狀態(tài)的細(xì)胞具有活性。

圖4 熒光顯微鏡下不同狀態(tài)的副溶血弧菌Fig. 4 Morphological features of V. parahaemolyticus in different states under fl uorescence microscope

2.6 細(xì)胞呼吸活性檢測(cè)結(jié)果

CTC實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛲ㄟ^(guò)分析細(xì)胞的呼吸活性確定細(xì)胞的活力。本研究利用激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀共同分析了正常狀態(tài)、VBNC狀態(tài)和死亡狀態(tài)的副溶血弧菌的呼吸活性。

圖5 CTC/DAPI細(xì)胞雙染的激光掃描共聚焦顯微鏡觀(guān)察結(jié)果Fig. 5 Confocal laser-scanning micrographs of the cells stained with CTC/DAPI

如圖5所示，通過(guò)呼吸活動(dòng)中電子遞質(zhì)的作用，CTC被還原成CTC甲臜，在細(xì)胞表面發(fā)出紅色熒光；DAPI能與DNA結(jié)合發(fā)出藍(lán)色熒光，確定細(xì)胞位置用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。正常狀態(tài)下，細(xì)胞的電子傳遞活躍，細(xì)胞表面呈現(xiàn)較多紅色熒光，紅色熒光強(qiáng)度大；死亡狀態(tài)下，細(xì)胞電子傳遞停止，沒(méi)有紅色熒光生成。而處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞表面能夠觀(guān)察到明顯的紅色熒光，且紅色熒光強(qiáng)度較大，說(shuō)明此時(shí)的細(xì)胞仍具有良好的呼吸活性。

流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果與之相似（圖6）。正常狀態(tài)下，大部分細(xì)胞位于P2；死亡狀態(tài)下，細(xì)胞則集中在P1。而處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞中有9.27%分布于陽(yáng)性區(qū)域，具有呼吸活性。

圖6 CTC細(xì)胞染色的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果Fig. 6 Cytograms of the cells stained with CTC

3 討 論

VBNC狀態(tài)是一種細(xì)菌處于環(huán)境壓力下采取的生存機(jī)制。因具有不可培養(yǎng)的特點(diǎn)，對(duì)其檢測(cè)和鑒定方法的研究受到廣泛的關(guān)注。本研究采用PMA-qPCR的檢測(cè)技術(shù)結(jié)合平板計(jì)數(shù)的方法，定量監(jiān)控副溶血弧菌 誘導(dǎo)過(guò)程中活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù)的變化情況，同時(shí)測(cè)定出VBNC狀態(tài)細(xì)胞的濃度。研究設(shè)置了3 組共12 種條件誘導(dǎo)副溶血弧菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，其中7 種條件下副溶血弧菌在60 d內(nèi)進(jìn)入了VBNC狀態(tài)。通過(guò)活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù)的差值得出VBNC狀態(tài)細(xì)胞的濃度，7 種誘導(dǎo)條件中VBNC狀態(tài)細(xì)胞終濃度最低為5.75×102CFU/mL，最高為1.70×105CFU/mL。從活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù)的差值也可看出，VBNC狀態(tài)的細(xì)胞在誘導(dǎo)過(guò)程中已經(jīng)出現(xiàn)，而非等到全部細(xì)胞進(jìn)入不可培養(yǎng)狀態(tài)時(shí)才出現(xiàn)[25]。另外有5 種條件在小于60 d內(nèi)誘導(dǎo)副溶血弧菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。其中，部分條件下可培養(yǎng)菌數(shù)與活菌數(shù)的曲線(xiàn)變化差異不明顯（P＞0.05），這些條件可能不足以使副溶血弧菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)；另一部分條件下可培養(yǎng)菌數(shù)與活菌數(shù)的曲線(xiàn)變化差異明顯（P＜0.05），說(shuō)明在大于60 d的足夠誘導(dǎo)時(shí)間下這些條件可能使副溶血弧菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)[26]。

LIVE/DEAD細(xì)胞試劑盒能將死細(xì)胞和活細(xì)胞染上不同的顏色，在熒光顯微鏡下觀(guān)察染色后的細(xì)胞，可以確認(rèn)細(xì)胞的死活狀態(tài)。這種方法常被用于確認(rèn)VBNC狀態(tài)細(xì)胞的存在。在熒光 顯微鏡下可以看出大量VBNC狀態(tài)細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，從而證實(shí)它們的活性。

根據(jù)細(xì)菌處于VBNC狀態(tài)下仍然具有代謝活性這一特點(diǎn)，本研究采用CTC染色結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡觀(guān)察和流式細(xì)胞儀的方法，證實(shí)并分析了VBNC狀態(tài)副溶血弧菌的呼吸活性。在CTC/DAPI的雙染實(shí)驗(yàn)中，在激光掃描共 聚焦顯微鏡下可以清晰地看出VBNC狀態(tài)細(xì)胞與死亡 細(xì)胞的差異。VBNC狀態(tài)細(xì)胞表面呈現(xiàn)明顯的紅色熒光，說(shuō)明它們?nèi)匀痪哂休^強(qiáng)呼吸活性。與傳統(tǒng)的CTC呼吸法相比，DAPI能幫助確定細(xì)胞的位置，更直觀(guān)和清晰地觀(guān)察具有呼吸活性的細(xì)胞[27]。在流式細(xì)胞儀的分析中，代表VBNC狀態(tài)的樣品中有9.27%的細(xì)胞處于陽(yáng)性區(qū)域，而死細(xì)胞中處于陽(yáng)性區(qū)域的細(xì)胞幾乎為零。這進(jìn)一步證實(shí)處于VBNC狀態(tài)的副溶血弧菌仍然具有呼吸活 性。然而，實(shí)驗(yàn)中所用的樣品是誘導(dǎo)后的菌液，故樣品中可能混有一定量的死細(xì)胞。若能采取進(jìn)一步的措施將樣品中的死細(xì)胞與VBNC狀態(tài)細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，例如結(jié)合能區(qū)分死活細(xì)胞的染料的使用[28]，便可在利用流式細(xì)胞分析技術(shù)快速定量檢測(cè)VBNC細(xì)胞同時(shí)對(duì)其代謝活性進(jìn)行測(cè)定[29-30]。

4 結(jié) 論

本研究應(yīng)用PMA-qPCR技術(shù)定量檢測(cè)了副溶血弧菌在誘導(dǎo)過(guò)程中活菌數(shù)的變化情況，結(jié)合平板計(jì)數(shù)法定量檢測(cè)出處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞的濃度，證明該方法能夠快速準(zhǔn)確地測(cè)定處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌。其次將CTC呼吸實(shí)驗(yàn)結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì) 胞分析技術(shù)證實(shí)了處于VBNC狀態(tài)的副溶血弧菌仍然具有呼吸活性，為VBNC狀態(tài)細(xì)菌的檢測(cè)和生理特性分析提供了新的思路和依據(jù)。

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Quantitative Detection of Viable but Non-Culturable (VBNC) Vibrio pa rahaemolyticus Cells Ind uced by Different Conditions Using PMA-q PCR and Respiratory Activity Analysis

LIU Yufei, FANG Xiang, LIAO Zhenlin, WANG Li, ZHONG Qingping*
(Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, College of Food Science,South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

The aims of the study were to quantitatively monitor viable but non-culturable (VBNC) cells of Vibrio parahae molyticus induced by different conditions and to analyze th eir respiratory activity. Fluo rescence quantitative PCR(qPCR) coupled with prop idium monoazide (PMA-qPCR) was used to quantify viable cells of V. parahaemolyticus. A new method combining confocal laser-scanning microscopy (CLSM) and fl ow cytometry with 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC) reduction was applied to detect the respiratory activity of VBNC cells. Results s howed that PMA-qPCR with culture-based method allo wed successful monitoring of the number of VBNC cells of V. parahaemolyticus and then the density of VBNC cells could be calculated. Seven of the tested conditions could entirely induce cells into VBNC state within 60 day. The minimum and maximum density of VBNC cells were 5.75 × 102and 1.70 × 105CFU/mL,respectively. In the respiration test, 5-cyano-2,3-ditol yl tetrazolium chloride/ 4’,6-diamidino-2-phenylindole (CTC/DAPI) staining allowed to clearly distinguish viable cells from dead cells under CLSM by fl uorescent formazan. Flow cytometry enabled rapid discrimination between respiratory active and non-active cells based on fl uorescence intensity.In summary, this study provided new methods for the detection of V. parahaemolyticus in VBNC state and for better understanding of their metabolism.

Vibrio parahaemolyticus; viable but non-culturable(VBNC); fluorescence quantitative PCR combined with propidium monoazide (PMA-qPCR); fl ow cytometry; confocal laser-scanning microscopy (CLSM)

TS201.3

A

1002-6630（2017）20-0215-07

2017-04-12

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271956）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2017A030313146）

劉羽霏（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：230742195@qq.com

*通信作者：鐘青萍（1967—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?、食品微生物。E-mail：zhongqp@scau.edu.cn

劉羽霏 , 方祥, 廖振林, 等. 不同誘導(dǎo)條件下的VBNC狀態(tài)副溶血弧菌的PMA-qPCR定量檢測(cè)及其 呼吸活性分析[J].食品科學(xué), 2017, 38(20): 215-221. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720031. http://www.spkx.net.cn

LIU Yufei, FANG Xiang, LIAO Zhenlin, et al. Quantitative detection of viable but non-culturable (VBNC) Vibrio parahaemolyticus cells induced by different conditions using PMA-qPCR and respiratory a ctivity analysis[J]. Food Science, 2017,38(20)∶ 215-221. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720031. http∶//www.spkx.net.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720031