花臉香蘑菌絲體多糖提取條件優(yōu)化及其體外免疫活性

胡欣蕾，田雪梅，李文香,*，孫亞男，張 欣，于 戈，李 銘

花臉香蘑菌絲體多糖提取條件優(yōu)化及其體外免疫活性

胡欣蕾1，田雪梅2，李文香1,*，孫亞男1，張 欣1，于 戈1，李 銘1

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食 品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省應(yīng)用真菌重點實驗室，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109）

為探討花臉香蘑 菌絲體多糖提取工藝及其免疫活性，以花臉香蘑菌絲體為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用正交試驗優(yōu)化多糖提取條件；將不同質(zhì)量濃度的花臉香蘑菌絲體多糖溶液作用于小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1，通過對其細(xì)胞存活率、細(xì)胞因子TNF-α和IL-6分泌量、中性紅吞噬能力以及膜表面蛋白Toll樣受 體（Toll-like receptor，TLR）TLR2和TLR4表達(dá)量能力的測定，研究花臉香蘑菌絲體多糖的免疫活性。結(jié)果表明，花臉香蘑菌絲體多糖最佳提取條件為浸提溫度65 ℃、浸提時間2.5 h、液料比40∶1（mL/g），提取率最高為15.88%；在0.05～1.6 mg/mL的有效劑量范圍內(nèi)，花臉香蘑菌絲體多糖能夠不同程度地促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1的增殖，提高細(xì)胞因子TNF-α和IL-6分泌量，增強中性紅吞噬能力、膜表面蛋白TLR2和TLR4表達(dá)量能力，其中以1.6 mg/mL效果最佳。表明花臉香蘑菌絲體多糖具有優(yōu)良的免疫活性。

花臉香蘑菌絲體；多糖；提取工藝；正交試驗；免疫活性

花臉香蘑（Lepista sordida（Schum. Fr.）Sing）又名紫晶蘑，隸屬于傘菌目，白蘑科，香蘑屬，因其菌蓋周圍具有半透明或水浸狀花紋而得名[1]，是一種珍稀野生食藥用菌，具有很高的開發(fā)價值。我國民間認(rèn)為花臉香蘑具有養(yǎng)血、益神、補肝等功效[2]。秦丹等[3]從花臉香蘑子實體中提取粗多糖，通過實驗證明花臉香蘑粗多糖對雛雞免疫具有一定的調(diào)節(jié)作用，但是花臉香蘑尚未實現(xiàn)規(guī)?；斯ぴ耘啵乙吧Y源稀少，鮮菇價格高。通過發(fā)酵獲得的花臉香蘑多糖同樣具有抗氧化、抗腫瘤、 調(diào)節(jié)免疫的作用。宋曉琳等[4]通過實驗證明發(fā)酵獲得的花臉香蘑多糖對小鼠急性肝損傷具有一定保護(hù)作用；陳湘蓮等[5]通過實驗證明花臉香蘑菌絲提取物具有抗氧化活性和抗腫瘤活性。因此，利用發(fā)酵技術(shù)獲得花臉香蘑菌絲體及其活性物質(zhì)是一種有效的替代手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。本實驗以花臉香蘑菌絲體為實驗材料，通過正交試驗對多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化；通過花臉香蘑菌絲體多糖對小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1存活率、細(xì)胞因子TNF-α和IL-6分泌量、中性紅吞噬能力以及膜表面蛋白Toll樣受體（Tolllike receptor，TLR）TLR2和TLR4表達(dá)量能力的影響來研究其免疫活性，以期為花臉香蘑多糖獲得途徑以及功能性食品或藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花臉香蘑菌種由山東省應(yīng)用真菌重點實驗室提供，小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

四甲基噻唑藍(lán)（methyl thiazoltetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；胎牛血清 美國Gibco公司；胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液美國Thermo Scientific公司；鼠源TNF-α、IL-6 Elisa試劑盒、鼠源TLR2、TLR4試劑盒 江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；中性紅染色劑 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙醇、氯仿、正丁醇、二甲基亞砜（dimethylsulphoxide，DMSO）、苯酚、硫酸（均為分析純） 萊陽康德化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱 德國賓德公司；TFA型通風(fēng)柜 北京太極傲飛機房裝備開發(fā)中心；XW-80A微型旋渦混合儀上海滬西分析儀器廠有限公司；TGL-16C離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋 龍口市先科儀器公司；SP-754紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；AR1530/C電子分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；CKX-41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Elx808自動酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 花臉香蘑菌絲體多糖提取

1.3.1.1 工藝流程

花臉香蘑菌絲體→冷凍干燥→粉碎→浸提→離心→濾渣復(fù)提→濃縮→醇沉→離心→加水復(fù)溶→冷凍干燥→粗多糖

經(jīng)冷凍干燥的花臉香蘑菌絲體用粉碎機粉碎后，采用熱水浸提法對多糖進(jìn)行提取，將提取液在4 000 r/min的條件下離心15 min，采用同樣的方法再次浸提，以提高多糖的提取率，將離心后的上清液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/10，加3 倍體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液，4 ℃靜置24 h，4 000 r/min離心15 min，將離心后的沉淀加水復(fù)溶，冷凍干燥后即得花臉香蘑菌絲體粗多糖。

1.3.1.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，然后采用水楊酸法測定同一樣品的還原糖含量，計算見公式（1）和（2）：

苯酚-硫酸法：將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置于105 ℃的烘箱中干燥2 h，放入干燥器中進(jìn)行冷卻。準(zhǔn)確稱取0.01 g冷卻后的葡萄糖，溶解，用蒸餾水定容至100 mL，用移液槍準(zhǔn)確移取葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于試管中，加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，靜置5 min后搖勻，100 ℃水浴鍋中加熱15 min，冷卻至室溫，在490 nm波長處測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

水楊酸法：精密量取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分別置于25 mL具塞試管中，用蒸餾水定容至2 mL，分別加入3,5-二硝基水楊酸試劑（將6.3 g 3,5-二硝基水楊酸和262 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液加到500 mL含有182 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，加5 g重蒸苯酚和5 g無水亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后移入1 000 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，混勻，貯于棕色瓶中，于暗處放置7 d后使用）2 mL，混合均勻后，沸水浴加熱5 min，迅速冷卻，于540 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 單因素試驗

采用熱水浸提的方法，分別就浸提溫度、浸提時間、液料比進(jìn)行單因素試驗。

最佳浸提溫度的確定：在浸提時間3 h、液料比40∶1（mL/g）條件下，分別測定浸提溫度為45、55、65、75、85 ℃時多糖的提取率；最佳浸提時間的確定：在浸提溫度65 ℃、液料比40∶1（mL/g）條件下，分別測定浸提時間為2、2.5、3、3.5、4 h時多糖的提取率；最佳液料比的確定：在浸提溫度65 ℃、浸提時間2.5 h條件下，分別測定液料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）時多糖的提取率。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平，按L9（33）正交試驗設(shè)計對花臉香蘑菌絲體多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化，各因素及水平設(shè)計如表1所示，每個組合設(shè)置3次重復(fù)實驗，多糖提取率取平均值。

表1 L9（3）正交試驗因素與水平Table 1 Coded levels of independent variables used for L9(3))orthogonal array design

1.3.4 驗證實驗

采用熱水浸提法，以1.3.3節(jié)正交試驗所得多糖提取最佳實驗條件組合為提取條件，重復(fù)提取3 次，分別測定多糖提取率。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 IU青霉素和l00 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到1.0×107個/mL時，對細(xì)胞進(jìn)行傳代。

1.3.6 多糖對細(xì)胞存活率的影響

參考谷鴻喜等[6]的方法，并稍作修改，取對數(shù)生長期的Ana-1細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 IU青霉素和l00 μg/mL鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，以1.0×105個/mL細(xì)胞濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2），培養(yǎng)24 h后，實驗組每孔添加含有不同質(zhì)量濃度花臉香蘑菌絲體多糖的完全培養(yǎng)基100 μL，使每孔的多糖終質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL，空白對照組每孔添加等體積的完全培養(yǎng)基，每組處理設(shè)置6 個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于CO2恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2），培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT染色液20 μL，反應(yīng)4 h，小心吸取孔內(nèi)上清液，每孔分別加入150 μL DMSO，振蕩溶解后用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處實驗組吸光度A實驗組和對照組吸光度A對照組，并按照公式（3）計算細(xì)胞存活率：

1.3.7 多糖對細(xì)胞因子分泌量的影響

以1.0×105個/mL細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2），培養(yǎng)24 h后，實驗組加入待測的多糖樣品（100 μL/孔），使每孔多糖終質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL，空白對照組每孔添加等體積的完全培養(yǎng)基，每組處理設(shè)置6 個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于CO2恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2），培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 000 r/min離心10 min，細(xì)胞因子TNF-α和IL-6含量的測定嚴(yán)格按照Elisa試劑盒上說明進(jìn)行。

1.3.8 多糖對中性紅吞噬能力的影響

參考張祺等[7]的方法，并稍做修改，以1.0×105個/mL細(xì)胞濃度接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2），培養(yǎng)24 h后，實驗組加入待測的多糖樣品（100 μL/孔），使每孔終質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL，空白對照組每孔添加等體積的完全培養(yǎng)基，每組處理設(shè)置6 個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于CO2恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2），培養(yǎng)24 h后，小心吸取孔內(nèi)上清液，再向孔中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%中性紅溶液（200 μL/孔），置于CO2恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2）培養(yǎng)1 h后，吸取細(xì)胞上清液，用磷酸緩沖液清洗培養(yǎng)板，加入200 μL細(xì)胞裂解液（V（乙酸）∶V（乙醇）=1∶1），裂解2 h后，用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處各孔吸光度。

1.3.9 多糖對膜蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞布板情況及培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)結(jié)束，分別收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，反復(fù)凍融，高速離心10 min，得到細(xì)胞裂解液，膜表面蛋白TLR2、TLR4含量的測定嚴(yán)格按照Elisa試劑盒上說明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Excel繪圖、線性回歸和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，每組實驗設(shè)置3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

總糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線所建立的回歸方程為y=0.012 4x+0.010 3，R2=0.999 1。還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線所建立的回歸方程為y=0.028 3x-0.016 4，R2=0.999 8。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 浸提溫度對多糖提取率的影響

圖1 浸提溫度對提取率的影響Fig. 1 Effects of extraction temperature on extraction yield

由圖1可知，液料比為40∶1（mL/g），浸提3 h，浸提溫度在45～85 ℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高花臉香蘑菌絲體多糖提取率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)溫度為65 ℃時提取率最大，當(dāng)溫度高于65 ℃時提取率逐漸下降。這可能是因為當(dāng)溫度低于65 ℃時，隨著溫度的升高多糖的溶解度隨之增加，當(dāng)溫度高于65 ℃部分糖會被高溫破壞，從而導(dǎo)致多糖提取率下降[8]。所以提取的最佳溫度應(yīng)該在65 ℃左右。

2.2.2 浸提時間對多糖提取率的影響

圖2 浸提時間對提取率的影響Fig. 2 Effects of extraction time on polysaccharide yield

由圖2可知，在液料比40∶1（mL/g）、浸提溫度65 ℃條件下，隨浸提時間的延長提取率增加，這可能是因為隨著浸提時間的延長多糖溶出量逐漸增大，當(dāng)浸提時間為2.5 h時，提取率最大；當(dāng)浸提時間大于2.5 h，提取率幾乎保持不變，這可能是因為隨著浸提時間的延長其他溶質(zhì)的溶出量增大對多糖的溶出產(chǎn)生了一定的抑制作用[8]，但多糖的結(jié)構(gòu)不會因此發(fā)生改變。

2.2.3 液料比對多糖提取率的影響

圖3 液料比對提取率的影響Fig. 3 Effects of solvent-to-solid ratio on polysaccharide yield

由圖3可知，在65 ℃溫度條件下浸提3 h，隨著液料比的增大，多糖提取率逐漸呈現(xiàn)先增后降的變化趨勢。在液料比小于40∶1時，多糖提取率隨著液料比的增加而呈上升趨勢，這可能是因為隨著固相和液相之間多糖質(zhì)量濃度差的增大，加快了多糖的浸提速度[9]；當(dāng)液料比為40∶1時，提取率達(dá)到最大；當(dāng)液料比大于40∶1以后，多糖提取率隨液料比的增大而下降，這可能是因為其他溶質(zhì)的溶出抑制了多糖的溶出[10]，但多糖的結(jié)構(gòu)不會因此發(fā)生改變，所以提取的最佳液料比為40∶1（mL/g）。

2.3 正交試驗結(jié)果

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表2可知，在試驗范圍內(nèi)各因素對花臉香蘑菌絲體多糖提取率的影響程度依次為浸提溫度＞液料比＞浸提時間，由k值大小可知，優(yōu)化工藝最佳組合為浸提溫度65 ℃、浸提時間2.5 h、液料比40∶1（mL/g），多糖提取率最高可達(dá)15.79%。由表3方差結(jié)果分析可知，浸提溫度、浸提時間、液料比對提取率的影響極顯著。

2.4 驗證實驗

在最佳提取條件下進(jìn)行3 次驗證實驗，多糖提取率分別為15.88%、15.90%、15.86%，平均提取率為15.88%。

2.5 花臉香蘑菌絲體多糖對Ana-1存活率的影響

圖4 花臉香蘑菌絲體多糖對Ana-1存活率的影響Fig. 4 Effect of the polysaccharides on survival rate of Ana-1 cells

如圖4所示，當(dāng)花臉香蘑菌絲體多糖質(zhì)量濃度小于0.8 mg/mL時，對Ana-1細(xì)胞存活率影響不顯著（P＞0.05），當(dāng)多糖質(zhì)量濃度大于等于0.8 mg/mL時，對Ana-1細(xì)胞存活率影響顯著（P＜0.05），細(xì)胞存活率隨多糖質(zhì)量濃度的增大而增加。當(dāng)花臉香蘑菌絲體多糖質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時，Ana-1細(xì)胞的存活率為145.14%。

2.6 花臉香蘑菌絲體多糖對Ana-1分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的影響

圖5 花臉香蘑菌絲體多糖對細(xì)胞因子TNF-α（a）和IL-6（b）的影響Fig. 5 Effect of the polysaccharides on TNF-α (a) and IL-6 (b)secretion

由圖5a可以看出，Ana-1細(xì)胞加入花臉香蘑菌絲體多糖溶液后細(xì)胞因子TNF-α分泌量隨多糖質(zhì)量濃度的增大而增加。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時，細(xì)胞上清液中TNF-α的質(zhì)量濃度達(dá)到了885.25 ng/mL，與未添加組相比提高了192.40%（P＜0.05）。由圖5b可以看出，花臉香蘑菌絲體多糖質(zhì)量濃度在0.05～0.8 mg/mL有效劑量范圍內(nèi)細(xì)胞因子IL-6分泌量呈明顯的上升趨勢，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度大于0.8 mg/mL時，IL-6分泌量上升速度緩慢。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，細(xì)胞上清液中IL-6的質(zhì)量濃度達(dá)到133.87 ng/mL，與未添加組相比提高了214.99%（P＜0.05）。結(jié)果表明，花臉香蘑菌絲體多糖對Ana-1分泌細(xì)胞因子TNF-α和IL-6有良好的促進(jìn)作用。

2.7 花臉香蘑菌絲體多糖對Ana-1細(xì)胞中性紅吞噬能力的影響

圖6 花臉香蘑菌絲體多糖對Ana-1吞噬活性的影響Fig. 6 Effect of the polysaccharides on the phagocytosis of neutral red by Ana-1 cells

從圖6可以看出，當(dāng)花臉香蘑多糖質(zhì)量濃度高于0.2 mg/mL時，小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1吞噬中性紅能力顯著提高（P＜0.05），呈明顯的量效關(guān)系。當(dāng)花臉香蘑多糖質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時， Ana-1吞噬中性紅能力提高了38.1%。結(jié)果表明，花臉香蘑多糖對Ana-1吞噬中性紅能力有一定的促進(jìn)作用。

2.8 花臉香蘑多糖對Ana-1細(xì)胞膜蛋白表達(dá)的影響

圖7 花臉香蘑菌絲體多糖對TLR2（a）和TLR4（b）表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of the polysaccharides on TLR2 (a) and TLR4 (b)expression

由圖7a可知，隨花臉香蘑菌絲體多糖質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞膜蛋白TLR2表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時，TLR2表達(dá)量最高為21.79 ng/mL。由圖7b可知，隨花臉香蘑菌絲體多糖質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞膜蛋白TLR4表達(dá)量也顯著增加（P＜0.05），升高趨勢與TLR2的變化相同。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時，TLR4表達(dá)量最高為16.245 ng/mL。表明花臉香蘑菌絲體多糖對Ana-1細(xì)胞膜蛋白Toll樣受體TLR2和TLR4表達(dá)有良好的促進(jìn)作用。

3 討 論

已有研究表明，多種真菌水溶性多糖能夠通過誘導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖、提高機體免疫應(yīng)答能力來達(dá)到抗癌效果[11-15]，而對于花臉香蘑多糖的免疫活性研究則相對較少。眾所周知，巨噬細(xì)胞在機體固有免疫與適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著復(fù)雜的功能，尤其在對抗感染和損傷的宿主防御中起到重要作用[16]。增殖是免疫細(xì)胞分化成多種功能形態(tài)、并在免疫應(yīng)答中發(fā)揮相應(yīng)作用的前提和基礎(chǔ)，巨噬細(xì)胞的增殖對于其各種免疫應(yīng)答功能的實現(xiàn)是必需的[17]。本研究以花臉香蘑菌絲體為原料，利用正交試驗對熱水浸提法提取多糖條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取條件為浸提溫度65 ℃、浸提時間2.5 h、液料比40∶1（mL/g），在該條件下多糖的提取率為15.88%，其準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性良好；并將提取物作用于小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1，通過比較不同質(zhì)量濃度花臉香蘑菌絲體多糖對Ana-1細(xì)胞存活率的影響后發(fā)現(xiàn)：花臉香蘑菌絲體多糖質(zhì)量濃度小于0.8 mg/mL時，對Ana-1細(xì)胞存活率影響不顯著（P＞0.05），在多糖質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時，細(xì)胞存活率有所下降，這可能是與多糖沒有達(dá)到能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖的有效質(zhì)量濃度有關(guān)，在其質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時，對Ana-1細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最強，Ana-1細(xì)胞的存活率達(dá)到145.14%。

巨噬細(xì)胞是一種位于組織內(nèi)的白血球，源自單核細(xì)胞[18]，它是生物體抵抗微生物的第一道防線之一。激活的巨噬細(xì)胞可以直接殺傷病原微生物[19]，在對病原體的免疫反應(yīng)[20]和組織修復(fù)[21]中發(fā)揮重要的作用。巨噬細(xì)胞的吞噬作用是通過將各類病原微生物、機體衰老死亡的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等大顆粒抗原攝入胞內(nèi)，形成吞噬溶酶體，在多種酶的作用下，殺滅和消化抗原性異物[22]；巨噬細(xì)胞的毒性作用是通過分泌各種免疫活性分子[23]，如TNF-α、IL-6、IL-10等，發(fā)揮抗腫瘤和病原菌的作用[24]。本研究中，Ana-1細(xì)胞在多糖質(zhì)量濃度1.6 mg/mL和0.8 mg/mL的刺激作用下，TNF-α和IL-6這2種細(xì)胞因子分別出現(xiàn)了分泌高峰；中性紅吞噬活性實驗結(jié)果顯示，1.6 mg/mL花臉香蘑菌絲體多糖能極顯著增強Ana-1的吞噬活性。表明適量花臉香蘑菌絲體多糖能起到激活巨噬細(xì)胞，提高其免疫活性的作用。

TLR是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子[25]，TLR可以通過各自不同的配基識別相應(yīng)的病原相關(guān)分子模式[26]，激活一系列的信號通路啟動宿主抵抗病原微生物的天然免疫，并對特異性免疫應(yīng)答進(jìn)行調(diào)控[27]。巨噬細(xì)胞在接受外界刺激后，通過TLR產(chǎn)生激活信號，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，進(jìn)而激活一系列免疫反應(yīng)[28]，如增強吞噬活性[29]、分泌細(xì)胞因子[30]等。本研究通過觀察不同質(zhì)量濃度花臉香蘑菌絲體多糖作用于巨噬細(xì)胞后對TLR2、TLR4兩種膜蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示：花臉香蘑菌絲體多糖能夠顯著上調(diào)TLR2、TLR4的表達(dá)量，表明巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答中的NF-κB通路能夠被花臉香蘑菌絲體多糖激活，而在本研究中觀察到的Ana-1細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌量升高、吞噬活性增加等現(xiàn)象可能與NF-κB通路的激活有關(guān)。

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Extraction and Immune Modulatory Activities in Vitro of Polysaccharides from Lepista sordida Mycelia

HU Xinlei1, TIAN Xuemei2, LI Wenxiang1,*, SUN Yanan1, ZHANG Xin1, YU Ge1, LI Ming1
(1. Shandong Provincial Laboratory of Applied Mycology, College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109, China; 2. College of Life Science, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

This study aimed to improve the extraction yield and evaluate the immune modulatory activity of polysaccharides of Lepista sordida mycelia. Optimization of the extraction conditions was carried out using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The immune modulatory effect of the polysaccharides extracted was evaluated by measuring cell survival, TNF-α and IL-6 secretion, the percentage of neutral red phagocytosis and the expression levels of Toll-like receptor (TLR) TLR2 and TLR4 when mouse Ana-1 macrophages were exposed to different concentrations of the polysaccharides. The optimal extraction cond itions were determined as follows∶ extraction temperature, 65 ℃; extraction time, 2.5 h; solvent-to-solid ratio, 40∶1 (mL/g), leading to an extraction yield of 15.88%. In the concentration range of 0.05–1.6 mg/mL, the polysaccharides could promote the proliferation of macrophages, TLR2 and TLR4 expression, the phagocytosis of neutral red and TNF-α and IL-6 production; the most effective concentration was 1.6 mg/mL. These data illustrated that the polysaccharides possessed good immune modulatory activity.

Lepista sordida mycelium; polysac charides; extraction; orthogonal array design; immune modulatory activities DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720026

S567.3

A

1002-6630（2017）20-0185-06

胡欣蕾, 田雪梅, 李文香, 等. 花臉香蘑菌絲體多糖提取條件優(yōu)化及其體外免疫活性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20)∶185-190. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720026. http∶//www.spkx.net.cn

HU Xinlei, TIAN Xuemei, LI Wenxiang, et al. Extraction and immune modulatory activities in vitro of polysac charides from Lepista sordida mycelia[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 185-190. (in Chine se with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720026. http∶//www.spkx.net.cn

2016-12-12

山東省科技發(fā)展計劃項目（2014GNC113007）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)經(jīng)費資助項目（SDAIT-07-07）

胡欣蕾（1992—），女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品深加工。E-mail：15964266296@163.com

*通信作者：李文香（1963—），女，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：xiang7332@126.com