焦磷酸測序法和Sanger測序法檢測丙型肝炎病毒基因分型的方法學(xué)比較

渠滕，田文君，劉義慶，劉春梅，張慶，崔朝杰，邱旸

（山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院 臨床檢驗醫(yī)學(xué)部，山東 濟(jì)南 250021）

焦磷酸測序法和Sanger測序法檢測丙型肝炎病毒基因分型的方法學(xué)比較

渠滕，田文君，劉義慶，劉春梅，張慶，崔朝杰，邱旸

（山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院 臨床檢驗醫(yī)學(xué)部，山東 濟(jì)南 250021）

目的探討焦磷酸測序法檢測丙肝分型在臨床應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和敏感性，評價其方法的優(yōu)缺點。方法收集100例丙肝患者的血漿標(biāo)本，分裝相同的2份，通過焦磷酸測序法和Sanger測序法分別進(jìn)行丙型肝炎病毒基因分型的檢測，對兩種測序方法的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果焦磷酸測序法和Sanger測序法檢測HCVRNA基因分型時，100例標(biāo)本中，92例結(jié)果一致，8例結(jié)果不一致，一致率為92%。其中，HCV-RNA病毒載量＞1×104IU/ml有80例，其測序結(jié)果完全一致為100%，HCV-RNA病毒載量＜1×104IU/ml有20例，其中焦磷酸測序共檢測20例，Sanger測序法共檢測14例，12例結(jié)果相同。結(jié)論焦磷酸測序法檢測丙型肝炎病毒基因分型，不僅結(jié)果準(zhǔn)確可靠，而且與Sanger測序法比較，其敏感性更高。此外，焦磷酸測序還可以進(jìn)行定量分析。

丙型肝炎；焦磷酸測序；Sanger測序

Abstract:ObjectiveTo compare the accuracy and sensitivity of Pyrosequencing and Sanger sequencing in detection of hepatitis C virus genotypes.MethodsPyrosequencing and Sanger sequencing were used to detect the hepatitis C virus genotypes using plasma of the same 100 patients,results of the two methods were analyzed.ResultsThe results were consistent in 92 of 100 cases when detecting the HCV-RNA genotyping,of which the concordance rate was 92%.There were 80 samples whose HCV-RNA concentration was above 1×104IU/ml,with completely consistent sequencing results of the two methods.And there were 20 samples whose HCV-RNA concentration wasbelow 1×104IU/ml,allofwhich were detected successfully by Pyrosequencing,while 14 of which were detected successfully by Sanger sequencing,12 of which had identical results.ConclusionsCompared with Sanger sequencing,Pyrosequencing can make results accurate and reliable,and the sensitivity of which is higher.In addition,Pyrosequencing can be used for quantitative analysis.

Keywords:hepatitis C;Pyrosequencing;Sanger sequencing

丙型肝炎（丙肝）是一種由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起、以肝臟受累為主，腎臟、骨髓和甲狀腺等其他器官均可受累的全身性疾病[1]。人體感染HCV后，因急性丙肝常呈亞臨床感染，癥狀輕微，常常不能引起患者的重視而導(dǎo)致50%～80%的丙肝患者發(fā)展成為慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC），而CHC自發(fā)清除病毒的比例很低，如果不能進(jìn)行及時有效的抗病毒治療，絕大多數(shù)將逐漸發(fā)展為肝硬化、肝功能失代償，甚至肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重危害患者的健康和生命[2-3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，全球丙型肝炎流行率平均為3%，每年新發(fā)HCV感染300～400萬例，估計已有1.3～1.7億慢性HCV感染者。每年約35萬人死于與HCV感染相關(guān)的肝臟疾病。據(jù)估計，今后10～15年內(nèi)，丙型肝炎相關(guān)死亡將繼續(xù)上升，到2015年丙型肝炎相關(guān)死亡將增加2倍，2025年增至3倍[4-6]。在我國，根據(jù)2006年全國血清流行病學(xué)調(diào)查推算，我國一般人群HCV感染者約為560萬[7]。目前，PR方案（聚乙二醇化干擾素α聯(lián)合利巴韋林）仍是我國現(xiàn)階段HCV感染者抗病毒治療的主要方案，可應(yīng)用于所有基因型HCV現(xiàn)癥感染，同時無治療禁忌證的患者。在PR治療基因1型、2/3型患者中，不同基因型患者RBV的用量不同，據(jù)應(yīng)答指導(dǎo)治療（responsed guidedtherapy，RGT）的調(diào)整策略也不一樣，同時丙型肝炎防治指南（2015更新版）推薦意見中第6條建議抗病毒治療前應(yīng)根據(jù)病毒載量、基因分型、肝纖維化分期以及有無抗病毒治療禁忌證等綜合評估[8]。

目前，HCV基因分型檢測方法主要有直接測序、限制性片段長度多態(tài)性分析法（RFLP）、特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法、特異性探針熒光PCR法和基因芯片法等[9]。Sanger測序法采用的就是直接測序法，是一代測序法的經(jīng)典代表，發(fā)展較為成熟，測序片斷較長，成本相比較低，但是只能測序，無法準(zhǔn)確定量，同時操作耗時、煩瑣、通量受局限，在臨床應(yīng)用不方便。焦磷酸測序技術(shù)是介于一代測序和二代測序之間的一種測序手段，不僅檢測項目靈活可以同一批次檢測多個項目，而且焦磷酸測序檢測成本較低、耗時短、通量高和靈敏度高，適合臨床常規(guī)檢測的推廣，但其測序的片斷一般較短＜80 bp（大多數(shù)需要檢測的與疾病相關(guān)的已知基因片斷都很短），更適合對特定已知序列的定量分析[10]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月-2016年10月在本院檢測HCV-RNA陽性的血漿標(biāo)本100例，采用COBAS Taq Man 48全自動病毒載量儀儀器及相關(guān)試劑盒（購于瑞士羅氏公司）檢測，檢測下限為15 IU/ml，其中，HCV-RNA病毒載量＞104IU/ml有80例，HCV-RNA濃度＜104IU/ml有20例。

1.2 主要試劑和儀器

病毒核酸純化柱試劑盒（德國Qiagen公司），焦磷酸測序試劑盒（德國Qiagen公司），低溫高速臺式離心機(jī)（德國Eppendorf公司），熒光定量PCR儀（美國ABI公司），焦磷酸測序儀（Pyro Mark Q24 MDx，德國Qiagen公司）。

1.3 方法

1.3.1 焦磷酸測序①設(shè)置Pyro Mark Q24運行文件：點擊新建程序按鈕，輸入運行的參數(shù)，設(shè)置測序板面板，從“Tools”菜單中選擇“Pre Run Information”，打印測序信息表，關(guān)閉運行菜單，拷貝到一個USB盤中。將PCR產(chǎn)物結(jié)合到鏈霉親和素Beads上：按照2 μl磁珠加40 μl結(jié)合緩沖液再加28 μl高純水配置用于DNA親和反應(yīng)的Master mix，加入70 μl的Master mix到8聯(lián)管中，按照設(shè)定的Pyro Mark Q24程序加入10 μl PCR產(chǎn)物到每一個孔中，用PCR8聯(lián)蓋密封8聯(lián)管，1 400 r/min搖動10 min；②測序引物退火緩沖液的配制：按照每孔2.5 μl測序引物加22.5 μl的退火緩沖液進(jìn)行足量配制，按照設(shè)定的Pyro Mark Q24程序加25 μl稀釋的測序引物到PyroMark Q24測序板的孔上；③單鏈DNA模板的制備：在真空工作站中，1號槽加入70%乙醇50ml，2號槽加入變性緩沖液40 ml，3號槽加入洗液50 ml，4號槽加入高純水50 ml，5號槽加入高純水70 ml。打開真空泵，將真空工具在5號位清洗15 s，移動到PCR8聯(lián)管吸附磁珠15 s，依次在1、2和3號位清洗5、5及10 s；④引物雜交：將真空工具真空閥關(guān)閉，放入含有測序引物的Pyro Mark Q24測序板中，充分搖動釋放磁珠，在80℃雜交2 min，室溫冷卻10 min；⑤運行Pyro Mark Q24進(jìn)行測序：按照Pre Run運行報告將核酸，酶、底物分別按照合適的體積加入卡夾，打開測序板模塊，放入卡夾和測序板，插入USB選擇主菜單中的“Run”，按“OK”。

1.3.2 Sanger測序由上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司使用ABI 3730xl測序儀測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2種測序法的敏感性

血 HCV-RNA 為 104、5000、2000 及 1000IU/ml，重復(fù)10次，血HCV-RNA≥2 000 IU/ml的標(biāo)本，焦磷酸測序法和Sanger測序法能穩(wěn)定地檢測出丙型肝炎病毒的基因分型，陽性檢出率均為100%，且兩種方法的序列圖譜清晰，滿足臨床對丙型肝炎病毒基因分型檢測的需求；血HCV-RNA≤2 000 IU/ml的標(biāo)本，焦磷酸測序法無法穩(wěn)定檢出，雖可分出丙型肝炎病毒基因分型，但信號強(qiáng)度低、分辨率差，Sanger測序法陽性檢出率為0；另外，兩種方法檢測10份健康對照者血漿標(biāo)本，兩種方法均低于檢出限。

2.2 2種測序法檢測丙型肝炎病毒基因分型的結(jié)果比較

將100例丙肝患者血漿標(biāo)本分裝相同的兩份，通過焦磷酸測序法和Sanger測序法分別進(jìn)行丙型肝炎病毒基因分型的檢測，100例丙肝患者血漿標(biāo)本檢測結(jié)果顯示：焦磷酸測序法共測出100例，未測出0例，檢出率為100%；Sanger測序法測出94例，6例未測出，檢出率為94%。其中，92例結(jié)果一致，8例結(jié)果不一致，總體一致率為92%。焦磷酸測序法和Sanger測序法檢測丙型肝炎病毒基因1b、2a以及其他型別的檢出例數(shù)的比較，經(jīng)χ2檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。標(biāo)本測序結(jié)果資料。見表1。

表1 2種測序法檢測丙型肝炎病毒基因分型結(jié)果比較例（%）

2.3 2種測序法對不同丙肝病毒載量組的檢測結(jié)果比較

按病毒載量的不同將100例患者分為高載量組（HCV-RNA病毒載量＞104IU/ml）80例和低載量組（HCV-RNA病毒載量＜104IU/ml）20例。2種方法在兩組的丙肝分型檢測結(jié)果比較（見表2）。高通量組的HCV-RNA病毒載量＞104IU/ml，有80例，其測序結(jié)果完全一致為100%，低通量組的HCV-RNA病毒載量＜104IU/ml，有20例，其中焦磷酸測序供測出20例，Sanger測序法測出14例，12例結(jié)果相同，2例不同。檢測高載量丙型肝炎病毒基因時，焦磷酸測序法和Sanger測序法的檢出率無差異，而檢測低載量丙型肝炎病毒基因時，焦磷酸測序法和Sanger測序法檢出例數(shù)的比較，經(jīng)χ2檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 2種方法對不同病毒載量組的檢測結(jié)果比較

HCV-RNA高水平載量、低水平載量和正常人2種測序方法的測序圖（見附圖）。應(yīng)用Sanger測序法對丙型肝炎病毒分型檢測，對于高病毒載量樣本測序結(jié)果直觀，但存在結(jié)果分析較為復(fù)雜，不能對突變株進(jìn)行定量檢測的問題；對于低載量樣本，結(jié)果判讀存在很大偏差，重復(fù)實驗結(jié)果重現(xiàn)性很差，不能很好的判斷型別；陰性標(biāo)本測序結(jié)果呈現(xiàn)混亂的峰形圖，無實際意義。而對于丙型肝炎病毒高載量樣本，焦磷酸法分型測序結(jié)果直觀、峰值高、讀取簡單和定量精確等特點；對于低載量樣本測序結(jié)果存在基線不穩(wěn)、峰值偏低的情況，但重復(fù)實驗結(jié)果具備很好的重現(xiàn)性，不影響結(jié)果的判讀；陰性標(biāo)本無PCR擴(kuò)增曲線，對PCR產(chǎn)物測序亦無峰值出現(xiàn)。

分別比較各組中2種檢測方法的整體一致性較好。但高載量組與低載量組之間兩種方法檢測結(jié)果比較，高載量組的檢測結(jié)果，兩種方法一致率更好，低載量組焦磷酸測序法具有更高的檢測率和更低的漏檢率，其敏感性可能略優(yōu)于Sanger測序法。

2.4 2種測序法對不同低病毒載量組的檢測結(jié)果比較

通過表2對比結(jié)果可知，兩種測序方法在對丙型肝炎病毒基因分型的檢測一致性較高，但在HCV-RNA病毒載量＜104IU/ml中，測序結(jié)果有所差異，現(xiàn)將20例HCV-RNA病毒載量＜104IU/ml的標(biāo)本按病毒載量分成2組，分別用焦磷酸法和Sanger法進(jìn)行測序，其檢測結(jié)果比較。見表3。

標(biāo)本病毒載量在104～5 000 IU/ml范圍中，檢測12個樣本，焦磷酸測序法和Sanger測序法均可檢出，且測序結(jié)果一致性為92%；當(dāng)病毒載量＜5 000 IU/ml時，檢測8個樣本，焦磷酸法檢出8個，檢出率為100%，Sanger測序法檢出2個，檢出率為25%，其中，兩種方法檢測一致的標(biāo)本數(shù)為1，一致率為12.5%。檢測病毒載量為104～5 000 IU/ml組丙型肝炎病毒基因時，焦磷酸測序法和Sanger測序法的檢出例數(shù)無差異，而檢測病毒載量＜5 000 IU/ml組的丙型肝炎病毒基因時，焦磷酸測序法和Sanger測序法檢出例數(shù)經(jīng)χ2檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

附圖 2種測序法在不同丙肝病毒載量組的測序圖

表3 2種測序法在不同低病毒載量組的檢測結(jié)果比較 %

通過2種測序方法對比可以看出在高載量檢測中，2種方法一致性更好，低載量檢測中焦磷酸測序法可能有較高的檢測率，其敏感性可能略優(yōu)于Sanger測序法。故建議進(jìn)行丙肝分型檢測前應(yīng)先進(jìn)行HCV-RNA定量檢測，分型標(biāo)本病毒載量在＞104IU/ml效果最佳，若＜104IU/ml，可優(yōu)先考慮焦磷酸測序法。

3 討論

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒感染引起、以血源性傳播為主的傳染性疾病，大部分患者感染HCV后會發(fā)展成為慢性丙型肝炎，可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥反應(yīng)、壞死和纖維化，更有部分患者發(fā)展為肝硬化，甚至是肝癌，對人類的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。而且近年來我國丙肝報告病例數(shù)及報告發(fā)病率快速上升，2011年報告發(fā)病率就達(dá)到12.97/10萬[11]，但通過科學(xué)的抗病毒治療，可以達(dá)到清除病毒、改善肝組織學(xué)、降低肝硬化發(fā)生率、防止肝臟功能衰竭和肝癌發(fā)生的目標(biāo)[12]。HCV分為6個基因型和多個亞型，不同基因型會導(dǎo)致不同的臨床表現(xiàn)及后果，尤其是對干擾素治療的反應(yīng)性有很大差異，因此，在治療前了解HCV的基因型，不僅有助于預(yù)測患者病情，更重要的是可根據(jù)病毒的基因型采用更合理有效的治療方案，從而既能節(jié)約治療費用又能獲得好的效果[13-15]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，兩種測序方法在對丙型肝炎病毒基因分型檢測的一致性高，無差異。100例標(biāo)本中，有92例結(jié)果一致，一致率為92%。其中，HCV-RNA病毒載量＞104IU/ml有80例，其測序結(jié)果完全一致為100%，HCV-RNA病毒載量＜104IU/ml有20例，其中焦磷酸測序共檢測20例，Sanger測序法共檢測14例，12例結(jié)果相同。初步證明，在檢測丙型肝炎病毒基因分型方面，焦磷酸測序法快速準(zhǔn)確，而且與目前應(yīng)用較為成熟普遍的Sanger測序法比較，其敏感性更高。此外，焦磷酸測序還可進(jìn)行甲基化分析（特定位點定量），且通量靈活（1～24）。因此，建議進(jìn)行丙肝分型檢測前應(yīng)先進(jìn)行HCV-RNA定量檢測，分型標(biāo)本病毒載量＞104IU/ml效果最佳，若＜104IU/ml，可考慮焦磷酸測序法。

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Comparsion of Pyrosequencing and Sanger sequencing in detection of hepatitis C virus genotypes

Teng Qu,Wen-jun Tian,Yi-qing Liu,Chun-mei Liu,Qing Zhang,Chao-jie Cui,Yang Qiu
(Department of Clinical Laboratory Medicine,Shandong Provincial Hospital of Shandong University,Jinan,Shandong 250021,China)

R135.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.012

1005-8982（2017）21-0066-05

2017-02-20

邱旸，E-mail：qpinger@163.com，Tel：15863199632