凝溶膠蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞中活性氧水平的影響研究*

倪猛，殷濤，鄭喜勝，劉馳，王博，樊宏偉

[1.鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院（南陽市中心醫(yī)院）消化內(nèi)科一病區(qū)，河南 南陽 473000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 胰腺外科，湖北 武漢 430022；3.鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院（南陽市中心醫(yī)院）重癥醫(yī)學(xué)科，河南 南陽 473000；4.鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院（南陽市中心醫(yī)院）肝臟普外科，河南 南陽 473000；5.鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院（南陽市中心醫(yī)院）腫瘤內(nèi)科三病區(qū)，河南 南陽 473000]

凝溶膠蛋白對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞中活性氧水平的影響研究*

倪猛1，殷濤2，鄭喜勝3，劉馳4，王博5，樊宏偉1

[1.鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院（南陽市中心醫(yī)院）消化內(nèi)科一病區(qū)，河南 南陽 473000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 胰腺外科，湖北 武漢 430022；3.鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院（南陽市中心醫(yī)院）重癥醫(yī)學(xué)科，河南 南陽 473000；4.鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院（南陽市中心醫(yī)院）肝臟普外科，河南 南陽 473000；5.鄭州大學(xué)附屬南陽醫(yī)院（南陽市中心醫(yī)院）腫瘤內(nèi)科三病區(qū)，河南 南陽 473000]

目的探討凝溶膠蛋白（GSN）對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞中活性氧（ROS）水平的影響。方法免疫印跡法（Western blot）檢測胃癌細(xì)胞SGC7901、AGS、BGC823及胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中GSN的表達(dá)水平。細(xì)胞轉(zhuǎn)染GSN siRNA（GSN siRNA組）和siRNA對(duì)照（siRNA control組），同時(shí)以只加入轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞為對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后，噻唑藍(lán)（MTT）檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，激光掃描共聚焦顯微鏡法檢測ROS水平，Western blot檢測細(xì)胞中GSN、Notch1胞內(nèi)段受體（NICD1）、Notch2胞內(nèi)段受體（NICD2）、DNA結(jié)合蛋白1（HES1）多克隆抗體及活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）水平。結(jié)果GSN在胃癌細(xì)胞SGC7901、AGS及BGC823中的表達(dá)水平高于胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1（P＜0.05），且在AGS細(xì)胞中的表達(dá)水平最高，后期選用胃癌細(xì)胞AGS為研究對(duì)象。siRNA control組細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞中ROS水平、GSN、NICD1、NICD2、HES1及Cleaved Caspase-3水平與對(duì)照組相比均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。GSN siRNA組細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞中GSN、NICD1、NICD2及HES1水平低于對(duì)照組（P＜0.05），而細(xì)胞凋亡能力及細(xì)胞中ROS水平、Cleaved Caspase-3水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論干擾GSN表達(dá)后，胃癌細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡增加，作用機(jī)制可能與細(xì)胞中ROS水平及NOTCH信號(hào)通路有關(guān)。

胃癌細(xì)胞；凋亡；NOTCH信號(hào)通路；活性氧

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of GSN on the apoptosis and the level of ROS in gastric cancer cells.MethodsThe expression of GSN in gastric cancer cell lines SGC7901,AGS,BGC823 and gastric epithelial cells GES-1 were detected by Western blot.Cells were transfected with GSN siRNA(the GSN siRNA group),siRNA control(the siRNA control group)and transfection vehicle (the vehicle control group),respectively.Cell proliferation was determined by MTT assay.Cell apoptosis was determined by flowcytometry.ROS level was measured by laser scanning confocal microscopy.The levels of GSN,NICD1,NICD2,HES1,and cleaved Caspase-3 were detected by Western blot.Results Expression level of GSN in gastric cancer cell lines including SGC7901,AGS and BGC823 was significantly higher than that in gastric epithelial cells GES-1 (P＜0.05).Given that AGS witnessed the highest expression of GSN,following experiments were performed on it.There was no significant difference in cell proliferation,apoptosis,ROS,GSN,NICD1,NICD2,HES1 or cleaved Caspase-3 level between the siRNA control group and the vehicle control group (P＞0.05).Cell proliferation and the levels of GSN,NICD1,NICD2,and HES1 in the GSN siRNA group were dramatically lower than those in the control group (P＜0.05),while cell apoptosis and the levels of ROS and cleaved Caspase-3 were notably higher than those in the vehicle control group (P＜0.05).ConclusionsGSN decreases proliferation ability while increases apoptosis of gastric cancer cells through manipulation on ROS level and NOTCH signaling pathway.

Keywords: gastric cancer cell;apoptosis;NOTCH signaling pathway;reactive oxygen specie

目前，全球胃癌發(fā)病率在全部惡性腫瘤中位居第4位，死亡率位居第2位[1]。每年大約有70萬人死于胃癌，占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的10%左右[2]。＞50歲的中老年人是胃癌高發(fā)人群，遺傳因素、飲食習(xí)慣及環(huán)境等均能夠引起胃癌的發(fā)生。尋找有效的靶基因治療胃癌是目前研究的熱點(diǎn)。凝溶膠蛋白（gelsolin，GSN）參與肌動(dòng)蛋白合成及生物學(xué)功能的發(fā)揮，在肌動(dòng)蛋白絲的切斷、聚集等過程中均發(fā)揮重要作用[3]。凝溶膠蛋白是細(xì)胞骨架蛋白的重要組成成分，在癌癥的發(fā)生過程中也具有重要作用[4]。GSN參與調(diào)控肝癌、食管癌等多種癌細(xì)胞的生長過程，而NOTCH信號(hào)通路是目前公認(rèn)的與腫瘤細(xì)胞生長有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[5-6]。本研究中，首先檢測GSN在不同胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，并通過小核糖核酸（RNA）干擾技術(shù)干擾胃癌細(xì)胞中GSN的表達(dá)，探討GSN對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制，以期為治療胃癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

GSN siRNA、siRNA Control（購自上海吉瑪生物科技有限公司），GSN多克隆抗體、Notch1胞內(nèi)段受體（NICD1） 多克隆抗體、Notch2胞內(nèi)段受體（NICD2）多克隆抗體、DNA結(jié)合蛋白1（hairy and enhancer of split 1，HES1）多克隆抗體及活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3）單克隆抗體（購自美國Santa Cruz公司），DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基（購自美國Sigma公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒（購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司），胎牛血清（購自美國Gibco公司），活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平檢測試劑盒（購自上海研拓生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌細(xì)胞SGC7901、AGS、BGC823及胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1（購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫）。取出凍存在液氮罐中的人胃癌細(xì)胞SGC7901、AGS及BGC823，放置于37℃的環(huán)境下融化。在細(xì)胞中加入細(xì)胞培養(yǎng)液（胃癌細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1用含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液），混勻后，1 000 r/min離心10 min。棄上清液，加入5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置于37℃，5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察細(xì)胞密度＞90%時(shí)，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，用適量細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求按照不同比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 Western blot檢測細(xì)胞中GSN表達(dá)水平

取胃癌細(xì)胞SGC7901、AGS、BGC823及胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，加入裂解液，放置于冰上裂解30 min。轉(zhuǎn)移裂解液至離心管中，12 000 r/min，4℃離心20 min，轉(zhuǎn)移蛋白上清至EP管中。BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取蛋白樣品與Loading buffer混合后放置于100℃煮沸5 min。取變性蛋白樣品加入到上樣孔中，每孔中加入蛋白樣品50 μl，80 V電壓電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 V至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠，4℃轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，依次與一抗（200倍稀釋）、二抗（1000倍稀釋）反應(yīng)，在暗室中顯影，曝光后以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化后，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀，調(diào)整每毫升細(xì)胞懸浮液中含有細(xì)胞2×104個(gè)，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入100μl細(xì)胞懸浮液，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞融合度為60%時(shí)，轉(zhuǎn)染GSN siRNA（GSN siRNA組）和siRNA對(duì)照（siRNA Control組）。用不含胎牛血清的不完全培養(yǎng)液稀釋siRNA，混合后，加入轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000，混合后，放在室溫下靜置15 min形成轉(zhuǎn)染的復(fù)合體。將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸出，加入轉(zhuǎn)染復(fù)合體，培養(yǎng)6 h后，更換為含有胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 MTT檢測細(xì)胞增殖

取轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞，加入0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升2×104個(gè)。接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μl的細(xì)胞懸浮液，放置于37℃培養(yǎng)細(xì)胞48 h。在細(xì)胞中加入噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液孵育4 h，加入DMSO溶液在室溫下孵育反應(yīng)10 min。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，同時(shí)設(shè)置空白組，空白組中不加細(xì)胞。觀察結(jié)晶物完全融化后，酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（轉(zhuǎn)染組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，棄掉上清液，胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升含有1×106個(gè)細(xì)胞。收集1 ml的細(xì)胞，加入500μl結(jié)合緩沖液混合均勻，加入體積為10 μl的膜聯(lián)蛋白V-FITC（Annexin V-FITC），放在避光條件下室溫反應(yīng)30min，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）5 μl，避光反應(yīng)5 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，分析細(xì)胞凋亡率。

1.7 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測ROS水平

取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入4×103個(gè)細(xì)胞。放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，吸除上清液，每孔中加入100 μl的H2DCFDA染液（5 μmol/L），放置于避光條件下反應(yīng)30 min后，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長和吸收波長分別為488和490 nm。熒光強(qiáng)度越強(qiáng)ROS水平越高。

1.8 Western blot檢測細(xì)胞中 NICD1、NICD2、HES1及Cleaved Caspase-3水平

收集轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞，參照1.4中Western blot方法檢測細(xì)胞中 NICD1、NICD2、HES1及 Cleaved Caspase-3水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞中GSN表達(dá)水平比較

Western blot檢測人胃癌細(xì)胞 SGC7901、AGS、BGC823及胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中GSN表達(dá)水平依次為（0.52±0.06）、（0.86±0.06）、（0.73±0.09）及（0.19±0.02）。細(xì)胞 SGC7901、AGS、BGC823 中 GSN水平均高于細(xì)胞GES-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=65.350，P=0.000）。細(xì)胞AGS中GSN水平最高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇胃癌細(xì)胞AGS繼續(xù)研究。見圖1。

圖1 細(xì)胞中GSN表達(dá)水平比較

2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中GSN表達(dá)水平比較

對(duì)照組、siRNA Control組及GSN siRNA組GSN表達(dá)水平依次為（0.67±0.07）、（0.68±0.08）和（0.20±0.05），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.065，P=0.000）。AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA Control后細(xì)胞中GSN表達(dá)水平與對(duì)照組比較無差異（t=0.163，P=0.879）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染GSN siRNA后細(xì)胞中GSN表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.463，P=0.001）。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中GSN表達(dá)水平比較

2.3 細(xì)胞增殖凋亡檢測結(jié)果

轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞，經(jīng)MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的存活率和細(xì)胞凋亡情況。對(duì)照組、siRNA C ontrol組、GSN siRNA組細(xì)胞存活率依次為（100.01±9.99）%、（100.5±9.33）%和（44.67±7.33）%，凋亡率依次為（9.70±2.61）%、（10.47±3.07）%和（34.55±4.34）%。細(xì)胞轉(zhuǎn)染GSN siRNA后細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞轉(zhuǎn)染GSN siRNA后細(xì)胞凋亡率升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F細(xì)胞存活率=38.531，P細(xì)胞存活率=0.000）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siRNA control后細(xì)胞存活率和凋亡率與對(duì)照組比較均無差異（F細(xì)胞凋亡率=51.236，P細(xì)胞凋亡率=0.000）。見圖3。

圖3 細(xì)胞增殖凋亡檢測結(jié)果

2.4 細(xì)胞中ROS水平比較

檢測各組AGS細(xì)胞中ROS水平，熒光強(qiáng)度越高，ROS水平也就越高。對(duì)照組、siRNA Control組及GSN siRNA 組 ROS水平依次為（42.33±3.66）、（42.92±3.87）和（65.67±6.31），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.376，P=0.002）。轉(zhuǎn)染 GSN siRNA 后的細(xì)胞ROS水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.542，P=0.005）。轉(zhuǎn)染siRNA Control后的細(xì)胞ROS水平與對(duì)照組比較無差異（t=0.192，P=0.857）。見圖4。

圖4 細(xì)胞中ROS水平比較

2.5 細(xì) 胞 中 NICD1、NICD2、HES1 及 Cleaved Caspase-3水平比較

檢測各組AGS細(xì)胞中 NICD1、NICD2、HES1水平，對(duì)照組、siRNA Control組、GSN siRNA組CleavedCaspase-3 水平依次為（0.21±0.05）、（0.21±0.06）及（0.48±0.06），NICD1 水平依次為 （0.56±0.06）、（0.55±0.07） 及（0.28±0.06），NICD2水平依次為（0.84±0.05）、（0.84±0.06） 及（0.20±0.05），HES1水平依次為（0.30±0.05）、（0.30±0.06）及（0.18±0.02），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FCleavedCaspase-3=22.546，PCleavedCaspase-3=0.002；FNICD1=18.769，PNICD1=0.003，F(xiàn)NICD2=142.884；PNICD2=0.000，F(xiàn)HES1=6.646，PHES1=0.030）。GSN siRNA組細(xì)胞中NICD1、NICD2及HES1水平均低于對(duì)照組，而Cleaved Caspase-3水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1=5.716，P1=0.005；t2=15.677，P2=0.000；t3=3.860，P3=0.018；t4=5.988，P4=0.004）。siRNA Control組細(xì)胞中 NICD1、NICD2、HES1 及 Cleaved Caspase-3水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 細(xì)胞中NICD1、NICD2及HES1水平比較

3 討論

胃癌的發(fā)病率在20世紀(jì)以前呈逐年上升趨勢(shì)，隨著生活條件的改善，胃癌發(fā)病率的上升趨勢(shì)有所減緩。世界范圍內(nèi)每年新增的胃癌患者中有50%左右的患者在中國，而胃癌也是我國癌癥中死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤[7-8]。胃癌發(fā)生早期癥狀不明顯，大部分患者在確診時(shí)基本已經(jīng)處于胃癌的晚期，這為治療帶來很多的困難。胃癌嚴(yán)重危害著人類的生命健康。

GSN是一種近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)基因，在細(xì)胞的生長、死亡過程中均發(fā)揮作用[9]。既往的研究表明，GSN在肝癌患者血清及癌癥組織中均表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)肝癌細(xì)胞中GSN的水平，能夠抑制肝癌細(xì)胞的凋亡[6,10-11]。本研究結(jié)果與之前的報(bào)道相一致，胃癌細(xì)胞株中GSN的水平均高于胃黏膜細(xì)胞，這提示GSN可能是一種癌基因，能夠促進(jìn)癌癥的發(fā)展。

細(xì)胞凋亡是一種正常情況下的細(xì)胞死亡，受多種基因蛋白和細(xì)胞內(nèi)ROS水平的調(diào)控[12]。有研究表明，GSN能夠通過作用于Caspase-3的活化水平，進(jìn)而影響癌細(xì)胞的凋亡[13-14]。Caspase-3的活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[15]。本研究結(jié)果顯示，干擾GSN表達(dá)后的胃癌細(xì)胞增殖能力下降，而流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，干擾GSN后胃癌細(xì)胞的凋亡數(shù)目增多，細(xì)胞中Caspase-3活化增多，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，這進(jìn)一步提示，GSN是一種癌基因，干擾其表達(dá)后能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

NOTCH能夠調(diào)控海膽、人等多種生物體內(nèi)細(xì)胞的生長和死亡[16]。多項(xiàng)研究已顯示，NOTCH在多種腫瘤中異常活化，能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)功能的發(fā)揮[17-18]。NICD1、NICD2是NOTCH信號(hào)通路的胞內(nèi)段基因，DNA結(jié)合蛋白1（HES1）含有α螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，能夠調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，是NOTCH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要傳遞因子[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾GSN后胃癌細(xì)胞中NICD1、NICD2及HES1蛋白表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)。這說明GSN對(duì)胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制可能與NOTCH信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，GSN在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平高于人正常的胃黏膜細(xì)胞，干擾胃癌細(xì)胞中GSN表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的增殖受到抑制，凋亡增多，作用機(jī)制可能與NOTCH信號(hào)通路及細(xì)胞內(nèi)的ROS水平有關(guān)。這為后期進(jìn)一步在體內(nèi)研究GSN對(duì)胃癌的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為治療胃癌提供新思路。

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Effect of GSN on apoptosis and ROS level in gastric cancer cells*

Meng Ni1,Tao Yin2,Xi-sheng Zheng3,Chi Liu4,Bo Wang5,Hong-wei Fan1
(1.Department of Gastroenterology,Nanyang Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Nanyang,Henan 473000,China;2.Department of Pancreatic Surgery,Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430022,China;3.Department of Critical Care Medicine,4.Department of Liver Surgery,5.Department of Oncology,Nanyang Hospital Affiliated to Zhengzhou University,Nanyang,Henan 473000,China)

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.005

1005-8982（2017）21-0025-06

2017-03-13

國家自然科學(xué)基金（No：81372665）

樊宏偉，E-mail：xhnkfhrr@sohu.com；Tel：13507638051