降鈣素基因相關肽對脂多糖誘導血管平滑肌細胞TLR4/NK-κB及炎癥因子表達的影響*

王芳，周祥群，付潔

（1.海南省第三人民醫(yī)院 心血管內科，海南 三亞 572000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院組織胚胎學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003）

降鈣素基因相關肽對脂多糖誘導血管平滑肌細胞TLR4/NK-κB及炎癥因子表達的影響*

王芳1，周祥群1，付潔2

（1.海南省第三人民醫(yī)院 心血管內科，海南 三亞 572000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院組織胚胎學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003）

目的探討降鈣素基因相關肽（CGRP）對脂多糖（LPS）誘導的血管平滑肌細胞（VSMCs）TLR4/NK-κB及炎癥因子表達的影響。方法貼壁法培養(yǎng)VSMCs，根據(jù)不同的處理方案，分為對照組、LPS處理組、CGRP組、（LPS+CGRP）組及（LPS+CGRP+C8-37）組；ELISA 檢測不同組 VSMCs中白介素 1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和CGRP基因表達水平，免疫印跡法（Western blot）檢測不同組VSMCs中Toll樣受體4（TLR4）、IκBa及p65蛋白表達水平。結果①LPS處理VSMCs后，隨著LPS濃度的升高，IL-1β和TNF-α表達水平成梯度增加，并于1 000 ng/ml時分泌水平最高（P＜0.05），在8 h時達到峰值（P＜0.05）；②CGRP劑量依賴性降低LPS誘導IL-1β和TNF-α的表達（P＜0.05），并于100 nmol/L時達到低峰點（P＜0.05）；③CGRP能抑制LPS誘導的細胞TLR4蛋白的積累（P＜0.05），抑制IκBa與p65蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）；④CGRP阻斷劑C8-37可以逆轉CGRP對LPS刺激的VSMCs中IL-1β和TNF-α表達（P＜0.05），拮抗CGRP對TLR4和NK-κB的抑制（P＜0.05）。結論CGRP通過抑制TLR4蛋白的積累，阻斷NF-κB信號蛋白IκBa與p65的磷酸化，進而削弱LPS誘導的細胞炎癥因子IL-1β和TNF-α的激活，抑制LPS誘導的VSMCs炎癥的激活。

降鈣素基因相關肽；血管平滑肌細胞；Toll樣受體4；NF-κB

Abstract:ObjectiveTo investigate the effectofcalcitonin gene-related peptide (CGRP)on lipopolysaccharide(LPS)-induced expressions of Toll-like receptor 4(TRL4)/NK-κB and cytokines in vascular smooth muscle cells (VSMCs).MethodsVSMCs were cultured and divided randomly into five groups:blank control group,LPS-insulted group,CGRP-stimulated group,LPS+CGRP stimulated group and LPS+CGRP+C8-37 group.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)was used to measure concentrations of IL-1β and TNF-α.Western blot was used to detect the expression of TLR4,IκBa and p65.ResultsLPS upregulated the expressions of IL-1β and TNF-α in a both time-and dose-dependent manner (P＜0.05),which reached the peak value when the cells were insulted by LPS at 1,000 ng/ml for 8 hours.CGRP reduced the LPS-induced expressions of IL-1β and TNF-α in a dose-dependent manner,which reached the lowest values when CGRPwas under 100 nmol/L (P＜0.05).Moreover,LPS-treated cells exhibited significant decrease of TLR4 and phosphorylation of IκBa and p65,which was attenuated significantly by CGRP(P＜ 0.05).As a specific CGRP antagonist,C8-37 reversed the expression levels of IL-1β and TNF-α in VSMCs stimulated by LPS.ConclusionsThe present study demonstrates that CGRP can significantly block LPS-induced inflammatory response in VSMCs through inhibition of TLR4-mediated NF-κB signaling pathway.

Keywords: calcitonin gene-related peptide;vascular smooth muscle cell;Toll-like receptor 4;NK-κB

動脈粥樣硬化是由多種因素共同作用的一種慢性炎癥性血管疾病，在其發(fā)展過程中，血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）發(fā)生特異性形態(tài)與功能改變，細胞收縮和合成表型發(fā)生轉換，進而激活炎癥過程，促使VSMCs分泌多種促炎癥介質（如細胞因子、趨化因子及黏附分子），最終促進血管病理生理發(fā)展、疾病進展，導致不良臨床事件發(fā)生[1]。當前研究顯示，慢性炎癥是動脈粥樣硬化心血管疾病的主要致病機制[2]，因此，識別調節(jié)VSMCs的炎癥反應機制對于治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的具有重要意義。降鈣素基因相關肽（calcitonin generelated peptide，CGRP）是由37個氨基酸組成的重要生物活性多肽，具有下降血壓、降低外周阻力、舒張腎動脈及增加腎血流量等作用，參與機體多種生理和病理過程[3]。最近的研究證實，CGRP在免疫應答和抗炎癥方面具有重要調節(jié)作用[4-5]，但對CGRP是否調節(jié)VSMCs炎癥激活及相關機制尚未明確。本實驗通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的 VSMCs炎癥反應，探討CGRP對LPS誘導的VSMCs TLR4/NK-κB表達及其炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

無特殊病原體（SPF）級雄性SD大鼠[許可證號：SCXK（京）2012-0001，北京維通利華實驗動物技術有限公司]，9～11周齡，體重300～350 g。不含鈣鎂磷酸鹽緩沖液（D-PBS）、DMEM細胞培養(yǎng)液及L-谷氨酰胺（購自美國Hyclone公司），α-Sarcomeric actin（α-SM-actin）、Anti-TLR4、Anti-IκBa、Anti-p-IκBa、Anti-p-p65、Anti-p65 及 Anti-α-Tubulin（購自美國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記二抗（HRP）（購自美國 Cell Signaling Technology公司），DMEM、胎牛血清及Trypsin-EDTA胰酶消化液（購自美國Gibco公司）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（購自陜西省西安飛揚生物科技有限公司），RIPA裂解液（中）（購自上海碧云天生物技術有限公司），Calcitonin Gene Related Peptide（購自美國 Abbiotec公司）、Calcitonin Gene Related Peptide Fragment 8-37（購自美國Sigma-Aldrich公司），白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α） 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA） 定量檢測試劑盒（購自美國R&D公司）；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

酶聯(lián)免疫檢測儀、Power PacTM電泳儀、Transblot電轉儀及凝膠成像系統(tǒng)Chemi Doc XRS（購自美國BIO-RAD公司），倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 VSMCs培養(yǎng)與鑒定雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡消毒5 min，用彎鑷剝離主動脈，去除主動脈外膜，用剪刀剪碎為1 mm3大小組織塊，用PBS沖洗2次以去除血細胞，然后將其均勻置于培養(yǎng)皿瓶底，加入10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d，至皿底鋪滿后進行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 VSMCs分組培養(yǎng)與處理第3代的VSMCs在37℃、50 ml/L二氧化碳CO2條件下，置于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，隔天換液。當細胞長至培養(yǎng)皿80%時，用含0.05%胰酶-EDTA溶液進行細胞消化傳代，接種于培養(yǎng)板上，接種細胞密度 2×104～4×106個 /ml，培養(yǎng) 24 h后，進行分組實驗。實驗分為4組：①對照組（control）：不作任何處理；②LPS處理組：使用1 000 ng/ml LPS處理心肌細胞8 h；③CGRP組：給予100 nmol/L CGRP處理8 h；④LPS+CGRP組：給予1 000 ng/ml LPS和100 nmol/L CGRP處理8 h；⑤LPS+CGRP+C8-37組；給予100 nmol/L CGRP和1 μmol/L的CGRP受體拮抗劑C8-37同時處理8 h。

1.3.3 細胞免疫熒光鑒定VSMCs細胞表型將滅菌的細胞爬片放入24孔培養(yǎng)板中，然后以2×104～5×104個/ml細胞密度將VSMCs接種至爬片上，培養(yǎng)48h后用PBS洗滌細胞，之后加入4%多聚甲醛固定10min，用PBS漂洗3次，1%Trixon-100通透細胞10 min，PBS漂洗3次，5%BSA室溫封閉30 min，加入一抗（α-SM-actin），放置4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，加入二抗Cy3，37℃孵育1 h。PBS洗滌3次，DAPI（1∶1 000）孵育10 min，PBS洗滌3次，封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.4 炎癥因子的ELISA檢測細胞培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM/培養(yǎng)基中，按照3×106個/ml的細胞密度種植于96孔板內，培養(yǎng)24 h后，進行分組細胞刺激處理。細胞處理結束后，收集培養(yǎng)基上清進行ELISA檢測。按照IL-1β和TNF-α檢測試劑盒的操作步驟進行ELISA檢測。使用酶標儀于450 nm處測各孔OD值，每個樣本重復3個復孔。然后繪制標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。最后取平均值進行統(tǒng)計學分析。

1.3.5 免疫印跡法（Western blot）檢測提取細胞總蛋白，測定蛋白含量。以50 μg/每孔道的蛋白上樣量進行SDS-PACE電泳，然后半干轉將蛋白轉移到PVDF膜上，于50 g/L的脫脂奶粉TBST溶液中室溫封閉120 min，然后分別加入1∶1 000兔抗TLR4、IκBa、p-IκBa、p-p65、p65 及 α-Tubulin，4℃振搖孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次，加入HRP二抗（1∶5 000）室溫振搖孵育120 min，洗膜。然后加入ECL試劑發(fā)光，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析靶蛋白的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VSMCs的鑒定

原代VSMCs接種48 h后，在顯微鏡下呈梭形或不規(guī)則扁平狀細胞。α-SM-actin免疫熒光染色結果顯示95%以上細胞均為α-SM-actin蛋白（紅色）。見圖1。

圖1 免疫熒光檢測VSMCs標志物α-SM-actin（標尺=50μm）

2.2 LPS誘導下炎癥因子IL-1β和TNF-α表達變化

經 0、10、100 及 1 000 ng/ml LPS 誘導 VSMCs細胞的炎癥反應，各組IL-1β和TNF-α表達比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（見表1）；隨著LPS濃度的增加，IL-1β和TNF-α表達成梯度上升，并于1 000 ng/ml時分泌水平最高（P＜0.05）。使用1 000 ng/ml濃度的LPS在不同時間處理VSMCs，觀察IL-1β和TNF-α表達水平隨作用時間的變化，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（見表2）。LPS在作用4 h后，IL-1β和TNF-α表達逐漸增加，在8 h時達到峰值，隨后逐漸降低（P＜0.05）。

表1 不同LPS濃度誘導下炎癥因子IL-1β和TNF-α表達水平的比較 （pg/ml，±s）

表1 不同LPS濃度誘導下炎癥因子IL-1β和TNF-α表達水平的比較 （pg/ml，±s）

因子 0 ng/ml 10 ng/ml 100 ng/ml 1 000 ng/ml F值 P值IL-1β 35.000±2.887 49.236±2.309 64.667±4.372 97.667±7.623 31.930 0.000 TNF-α 221.333±25.075 389.667±11.141 484.667±10.990 646.667±34.954 60.434 0.000

表2 不同作用時間LPS濃度誘導下炎癥因子IL-1β和TNF-α表達變化 （pg/ml，±s）

表2 不同作用時間LPS濃度誘導下炎癥因子IL-1β和TNF-α表達變化 （pg/ml，±s）

LPS作用時間 IL-1β TNF-α 0 h 32.667±2.901 242.667±4.485 2 h 42.333±2.028 316.333±10.990 4 h 64.334±8.021 457.334±12.991 8 h 99.667±8.762 642.000±20.133 12 h 72.667±4.726 570.000±24.333 24 h 62.000±2728 547.000±14.640 F值 27.719 95.291 P值 0.000 0.000

2.3 外源CGRP劑量依賴性降低LPS誘導IL-1β和TNF-α的表達

與 0 ng/ml組比較，1 000 ng/ml LPS能增加VSMCs釋放炎癥因子IL-1β和TNF-α，但同時給予0、0.1、10、100 及 1 000 nmol/L 的 CGRP 預處理后，各組IL-1β和TNF-α表達比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；隨著CGRP濃度的上升，LPS誘導IL-1β和TNF-α呈濃度依賴性降低，并于100 nmol/L時達到低峰點（P＜0.05）。見表3。

表3 CGRP劑量依賴性降低LPS誘導IL-1β和TNF-α的表達 （pg/ml，±s）

表3 CGRP劑量依賴性降低LPS誘導IL-1β和TNF-α的表達 （pg/ml，±s）

因子 0 nmol/L 0.1 nmol/L 10 nmol/L 100 nmol/L 1 000 nmol/L F值 P值IL-1β 97.667±7.623 96.667±7.535 78.000±1.528 65.124±2.309 79.667±2.646 11.379 0.001 TNF-α 642.032±20.133 622.315±19.053 542.101±11.790 371.667±17.786 515.534±18.818 49.179 0.000

2.4 CGRP拮抗劑對 VSMCs分泌 IL-1β 和TNF-α的影響

給予CGRP拮抗劑后，各組IL-1β和TNF-α表達比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（IL-1β：F=39.339，P=0.000；TNF-α：F=87.166，P=0.000）；與對照組比較，1 000 ng/ml LPS引起VSMCs IL-1β和TNF-α的增加（P＜0.05），而單獨給予CGRP預處理后，并未改變IL-1β和TNF-α的表達（P＞0.05）；但是在LPS基礎上同時給予CGRP預處理后，卻能抑制LPS引起的細胞內IL-1β和TNF-α表達的增加（P＜0.05）；而與 LPS+CGRP組比較，添加 CGRP的抑制劑C8-37能拮抗CGRP的該作用（P＜0.05）。見圖2。

圖2 CGRP抑制LPS誘導VSMCs內IL-1β和TNF-α的表達

2.5 CGRP對VSMCs分泌TLR4的影響

Western blot檢測比較各組TLR4的表達差異，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=170.026，P=0.000）。與對照組比較，LPS增加VSMCs TLR4的積累（P＜0.05），單獨給予CGRP預處理，對TLR4蛋白表達未影響（P＞0.05）；但同時給予（LPS+GRP）預處理后，卻能抑制LPS引起的細胞內TLR4蛋白表達的增加（P＜0.05）；而CGRP的抑制劑C8-37卻又能拮抗CGRP對TLR4的抑制作用（P＜0.05）。見圖3。

圖3 CGRP抑制LPS誘導的VSMCs內TLR4的積累

2.6 CGRP抑制LPS誘導的VSMCs IκBa和 p65的磷酸化

Western blot檢測比較各組IκBa和p65的活化差異，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（IκBa：F=116.188，P=0.000；p65：F=88.403，P=0.000）。與對照組比較，LPS 激活 VSMCs IκBa and NF-κB p65 的磷酸化（P＜0.05），而單獨給予 CGRP 預處理，對 IκBa磷酸化無明顯作用（P＞0.05），但卻抑制p65的磷酸化水平（P＜0.05）；但同時給予（LPS+CGRP）預處理后，更進一步抑制LPS促進的細胞內IκBa和p65蛋白磷酸化（P＜0.05）；而CGRP的抑制劑C8-37卻又能拮抗CGRP對 IκBa和p65的抑制作用（P＜0.05）。見圖4。

圖4 CGRP抑制LPS誘導的VSMCs內IκBa和p65磷酸化

3 討論

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性血管疾病，它由多種因素共同誘導作用形成，在其發(fā)展過程中，VSMCs發(fā)生表型轉換，由收縮靜止型變?yōu)樵鲋尺w移型細胞，分泌細胞外基質，激活炎癥信號，而且釋放炎癥細胞因子和趨化因子，進而與浸潤炎癥細胞相互作用，最終促進炎癥和病變[1，6]。

CGRP是一種廣泛分布于神經和心血管系統(tǒng)的血管活性肽，其分布與血管緊密聯(lián)系，在血管中CGRP的含量高于心臟。生理條件下，CGRP與降鈣素受體樣受體/受體活性修飾蛋白1（receptor activity modifying protein 1，RAMP1）組成的復合受體結合才能發(fā)揮作用[7]。本研究顯示，CGRP涉及神經類疾病，如三叉神經和偏頭痛等[8]，并在心血管的自我穩(wěn)態(tài)調節(jié)和血管結構中具有關鍵調節(jié)作用[9-10]。KROEGER等研究顯示，在肝臟中，CGRP還能通過減少促炎癥介質富集而發(fā)揮抗炎癥作用[11]。但是CGRP對VSMCs炎癥的作用，卻尚不明確。

本研究首先通過LPS刺激建立VSMCs炎癥模型[12]，觀察CGRP對LPS誘導的VSMCs炎癥因子IL-1β和TNF-α表達表達的影響。結果顯示，與對照組比較，隨著LPS濃度的增加，IL-1β和TNF-α表達成梯度上升，并于1 000 ng/ml LPS作用8 h時，炎癥因子IL-1β和TNF-α表達達到峰值（P＜0.05）。單獨給予CGRP預處理后，并未改變IL-1β和TNF-α的表達；但是在LPS基礎上同時給予CGRP預處理后，卻能抑制LPS引起的細胞內IL-1β和TNF-α表達的增加（P＜0.05）；而CGRP的抑制劑C8-37能拮抗CGRP的該作用（P＜0.05），以上結果表明，CGRP能夠抑制LPS誘導的VSMCs炎癥因子IL-1β和TNF-α表達，從而抑制細胞炎癥反應。

大量研究證實，LPS可以與TLR4受體相結合，激活NF-κB，引起炎癥介質和細胞因子的表達，起到抗免疫調節(jié)的作用[13-15]。但CGRP是否能通過TLR4/NF-κB信號通路，抑制細胞因子和炎癥介質的釋放，抵抗LPS介導的VSMCs炎癥反應呢？本實驗結果證實，CGRP通過阻斷LPS誘導的細胞內TLR4的積累，抑制NF-κB信號蛋白IκBa與p65蛋白激活，削弱細胞炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達，從而抑制VSMCs的炎癥激活反應。

本研究顯示，CGRP通過抑制TLR4積累和NF-κB信號蛋白IκBa與p65的活性，進而削弱LPS誘導的細胞炎癥因子IL-1β和TNF-α的上調，抑制LPS誘導的VSMCs炎癥的激活，發(fā)揮抗炎作用，這為以慢性炎癥為主要發(fā)病機制的動脈粥樣硬化的防治提供新的靶點和治療策略。但本研究也存在一定局限性，對CGRP與TLR4和NK-κB上下游信號通路之間的關系，還不深入，仍需進一步研究。

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Effect of CGRP on lipopolysaccharide-induced expressions of TLR4/NK-κB and inflammatory factors of vascular smooth muscle cells*

Fang Wang1,Xiang-qun Zhou1,Jie Fu2
(1.Department of Cardiology,the Third People's Hospital of Hainan Province,Sanya,Hainan 572000,China;2.Department of Histology and Embryology,Xinxiang Medical College,Xinxiang,Henan 453003,China)

R685.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.003

1005-8982（2017）21-0012-06

2017-02-28

海南省衛(wèi)生廳課題（No：1421320.24A1004）