澤瀉、郁金、熟地黃合煎對熟地黃中毛蕊花糖苷煎出量的影響

袁曉旭，楊明明，王慧娜，李洪波，繆紅，趙桂琴#

（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000；2.河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室，河北承德 067000）

澤瀉、郁金、熟地黃合煎對熟地黃中毛蕊花糖苷煎出量的影響

袁曉旭1＊，楊明明1，王慧娜1，李洪波1，繆紅2，趙桂琴1#

（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000；2.河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室，河北承德 067000）

目的：研究澤瀉、郁金、熟地黃合煎對熟地黃中毛蕊花糖苷煎出量的影響，為三藥合用的藥效物質(zhì)研究提供參考。方法：取藥材分為單煎-1（熟地黃 20 g）、單煎-2（澤瀉20 g）、單煎-3（郁金20 g）、合煎-1（熟地黃、澤瀉各20 g）、合煎-2（熟地黃、郁金各20 g）、合煎-3（澤瀉、郁金各20 g）、合煎-4（熟地黃、澤瀉、郁金各20 g）組，分別制備水煎液干浸膏，回流法提取后采用高效液相色譜法檢測樣品液中毛蕊花糖苷的含量并計算其煎出量。結(jié)果：單煎-1、合煎-1、合煎-2、合煎-4干浸膏中毛蕊花糖苷煎出量分別約為0.035 4、0.022 3、0.022 8、0.011 0 mg/g，后3組與單煎-1組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），以三藥合煎組煎出量最低；陰性對照組（單煎-2、單煎-3及合煎-3）中未檢測到毛蕊花糖苷。結(jié)論：熟地黃與澤瀉、郁金三藥合煎時毛蕊花糖苷煎出量降低，推測毛蕊花糖苷可能不是三藥合煎液中發(fā)揮藥效作用的主要成分。

熟地黃；澤瀉；郁金；毛蕊花糖苷；高效液相色譜法；煎出量

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the effects of combined decoctions of alismatis rhizoma and curcumae radix and rehmanniae radix praeparata on the decoction amount of acteoside in rehmanniae radix praeparata，and provide reference for studying the effective ingredients of three-drug effect.METHODS：Single decoction-1（rehmanniae radix praeparata 20 g），single decoction-2（alismatis rhizoma 20 g），single decoction-3（curcumae radix 20 g），combined decoction-1（rehmanniae radix praeparata 20 g，alismatis rhizoma 20 g），combined decoction-2（rehmanniae radix praeparata 20 g，curcumae radix 20 g），combined decoction-3（alismatis rhizoma 20 g，curcumae radix 20 g）and combined decoction-4（rehmanniae radix praeparata 20 g，alismatis rhizoma 20 g，curcumae radix 20 g）were respectively taken to prepare dry extracts after extracting by refluxing，HPLC was used to detect the acteoside content and calculate its decoction amount in sample.RESULTS：The decoction amounts of acteoside in single decoction-1，combined decoction-1，combined decoction-2 and combined decoction-4 dry extracts were 0.035 4，0.022 3，0.022 8，0.011 0 mg/g，respectively.Compared with single decoction-1 group，the last 3 groups had statistical significances（P＜0.01）；combined decoction-4 showed lowest decoction amount in three-drug combined decoction group.Acteoside was not detected in the negative control groups（single decoction-2，single decoction-3 and combined decoction-3）.CONCLUSIONS：The decoction amount of acteoside is reduced when alismatis rhizoma，curcumae radix and rehmanniae radix praeparata were decocted together，indicating that it may not be the main ingredient of playing effects in three-drug combined decoction liquid.

KEYWORDSRehmanniae radix praeparata；Alismatis rhizoma；Curcumae radix；Acteoside；HPLC；Decoction amount

熟地黃為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosa Libosch.）干燥塊根的炮制品，具有補血滋陰、益精填髓的功效，可用于治療肝腎陰虛、盜汗遺精、血虛萎黃、須發(fā)早白等證[1]。熟地黃化學(xué)成分豐富，主要含毛蕊花糖苷、5-羥甲基糠醛、梓醇[2-3]等；熟地黃湯劑可以抑制海馬神經(jīng)元凋亡，改善中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能，提高大鼠或小鼠學(xué)習(xí)記憶力[4-5]。澤瀉和郁金為臨床常用中藥，澤瀉提取物能夠改善腦缺血再灌注模型大鼠的神經(jīng)功能障礙[6]，郁金中的姜黃素類成分在提高學(xué)習(xí)記憶力方面也有較好的功效[7-8]。

本課題組前期進行的熟地黃、澤瀉、郁金合煎液組與對照組、單煎液組小鼠水迷宮實驗結(jié)果表明，合煎液組小鼠逃避潛伏期均明顯縮短，即該合煎液具有增強小鼠學(xué)習(xí)記憶力的作用。

為探討合煎液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組已對合煎液中來源于澤瀉的23-乙酰澤瀉醇B及來源于熟地黃的5-羥甲基糠醛煎出量進行了測定，結(jié)果表明與單煎比較，合煎后上述2種化合物煎出量均有變化（研究結(jié)果另文發(fā)表）。毛蕊花糖苷為熟地黃中的代表性成分，可通過調(diào)節(jié)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶及乙酰膽堿酯酶活性改善東莨菪堿造成的動物學(xué)習(xí)記憶損傷，也能明顯改善D-半乳糖致亞急性衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力障礙[9]。本文擬在上述基礎(chǔ)上研究合煎液中來源于熟地黃的毛蕊花糖苷煎出量的變化規(guī)律，為進一步闡明三藥合煎液增強學(xué)習(xí)記憶力的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；HHS-12電熱恒溫水浴鍋（上海東星建材試驗設(shè)備有限公司）；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHD-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（保定高新區(qū)陽光科教儀器廠）；AG-245電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥材與試劑

熟地黃（批號：1608001）、澤瀉（批號：1605001）、郁金（批號：1601001）均購自北京同仁堂承德連鎖藥店有限公司，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所生藥學(xué)李彬博士鑒定，分別為玄參科植物地黃（Rehmanniae glutinosa Libosch.）塊根的加工炮制品熟地黃（Rehmanniae radix preparata）、澤瀉科植物澤瀉[Alisma orientate（Sam.）Juzep.]的干燥塊莖、姜科植物溫郁金（Curcuma zvenyujin Y.H Chen et C.Ling）的干燥塊根；毛蕊花糖苷對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：150401，純度：98.92%）；乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組、供試品干浸膏制備及出膏率測定

各組組成：單煎-1（熟地黃20 g），單煎-2（澤瀉20 g），單煎-3（郁金20 g），合煎-1（熟地黃、澤瀉各20 g），合煎-2（熟地黃、郁金各20 g），合煎-3（澤瀉、郁金各20 g），合煎-4（熟地黃、澤瀉、郁金各20 g）。其中不含熟地黃的單煎-2、單煎-3、合煎-3為陰性對照組。

依照上述組成稱取7份藥材，采用前期藥理實驗中水煎液制備方法：用10倍量水浸泡12 h后煎煮40 min，趁熱過濾；收集濾渣加適量水后繼續(xù)煎煮25 min，過濾；合并濾液濃縮，于烘箱中60℃干燥72 h后得到干浸膏。單煎-1、單煎-2、單煎-3、合煎-1、合煎-2、合煎-3、合煎-4 組干浸膏質(zhì)量分別為14.4、3.5、1.9、16.8、15.2、6.0、17.2 g，出膏率分別為72.0%、17.5%、9.5%、42.0%、38.0%、15.0%、28.7%。

2.2 毛蕊花糖苷含量測定

參照2015年版《中國藥典》（一部）熟地黃項下毛蕊花糖苷含量測定方法[1]測定含量。

2.2.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.1%醋酸水溶液（15∶85，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：334 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。取7組樣品液進樣分析，在此色譜條件下毛蕊花糖苷與其他成分分離較好，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷對照品0.94 mg置于25 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，制備成質(zhì)量濃度為37.60μg/mL的對照品溶液，待用。

2.2.3 供試品溶液的制備 以1 g熟地黃原藥材為準，根據(jù)出膏率分別稱取“2.1”項下制備的干浸膏0.720 g（單煎-1）、0.840 g（合煎-1）、0.760 g（合煎-2）、0.861 g（合煎-4）；陰性對照組藥材以1 g澤瀉或郁金原藥材為準，根據(jù)出膏率分別稱取干浸膏0.300 g（合煎-3）、0.175 g（單煎-2）、0.095 g（單煎-3）。將稱取的干浸膏分別置于圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，80℃回流提取30 min[1]，過濾后減壓濃縮至近干，用流動相定容至5 mL，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密移取“2.2.2”項下毛蕊花糖苷對照品溶液0.50、1.00、1.25、2.50、4.00、5.00 mL置于10 mL量瓶中，加流動相定容，搖勻，由低至高依次稀釋成質(zhì)量濃度為1.88、3.76、4.70、9.40、15.04、18.80 μg/mL的溶液及原液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄各質(zhì)量濃度溶液色譜圖及峰面積。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，得毛蕊花糖苷回歸方程為：y＝30.636x－2.167（R2＝0.999 2）。結(jié)果表明，其檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.88～37.60μg/mL。2.2.5 精密度考察 取“2.2.3”項下制備的含熟地黃的供試品（單煎-1、合煎-1、合煎-2、合煎-4）溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件分別重復(fù)進樣6次，測得供試品中毛蕊花糖苷峰面積RSD均小于2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 稱取“2.2.3”項下制備的含熟地黃的供試品溶液（單煎-1、合煎-1、合煎-2、合煎-4）分別于配液后0、2、4、8、12、24 h按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測。結(jié)果上述4種溶液中毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.56%、1.96%、1.83%、1.77%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性考察 稱取“2.1”項制備的含熟地黃的干浸膏（單煎-1、合煎-1、合煎-2、合煎-4）各6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測。結(jié)果上述4種干浸膏溶液中毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為2.73%、2.34%、3.65%、3.82%（n＝6），表明該方法檢測毛蕊花糖苷重復(fù)性良好。

2.2.8 陰性對照試驗 稱取“2.2.3”項下不含熟地黃的供試品溶液（單煎-2、單煎-3、合煎-3），按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，結(jié)果這3種溶液中未檢測到毛蕊花糖苷對應(yīng)的色譜峰，結(jié)果見圖1F、G、H。

2.2.9 加樣回收率試驗 在已知含量的單煎-1、合煎-1、合煎-2、合煎-4樣品中加入一定量的對照品，根據(jù)“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，計算平均加樣回收率及RSD，結(jié)果見表1。

表1 毛蕊花糖苷加樣回收率結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery rate of acteoside（n＝6）

2.2.10 樣品含量測定 精密稱取“2.1”項下單煎-1、合煎-1、合煎-2、合煎-4干浸膏，依照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測。依照標準曲線法測定含量，計算毛蕊花糖苷煎出量[煎出量＝毛蕊花糖苷實測質(zhì)量濃度（μg/mL）×稀釋體積（mL）×10－3/藥材質(zhì)量（g），mg/g]，結(jié)果見表2。

表2 各組樣品中毛蕊花糖苷煎出量測定結(jié)果（x±s，n＝6）Tab 2 Determination results of decoction amount of acteoside in samples of each group（x±s，n＝6）

由表2可知，合煎液與熟地黃單煎液比較，毛蕊花糖苷煎出量降低。對煎出量數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，并進行單因素方差分析比較。結(jié)果顯示，合煎液與單煎液煎出量比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），合煎-1與合煎-2樣品煎出量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。澤瀉、郁金與熟地黃合煎時毛蕊花糖苷煎出量最小，為單煎液煎出量的31.07%；澤瀉、郁金分別與熟地黃合煎時毛蕊花糖苷煎出量差別不大，分別為單煎液的62.99%、64.41%。

3 討論

本試驗研究結(jié)果表明，熟地黃中毛蕊花糖苷含量較少，這與文獻[10]報道的關(guān)于熟地黃相較于生地黃毛蕊花糖苷含量較低的結(jié)果相一致。筆者在試驗過程中還擬對熟地黃單煎液及三藥合煎液中梓醇的煎出量進行檢測，但采用2015年版《中國藥典》頒布的生地黃中梓醇含量測定方法，在單煎液及合煎液中均未檢測到梓醇，這也與文獻[11]報道的梓醇主要存在于生地黃中的觀點一致。同時還可以推測，澤瀉、郁金與熟地黃合煎時并不能提高熟地黃中梓醇的煎出量。

試驗中各組供試品浸膏量相差較大，其原因可能是：在熟地黃中含糖量較高且親水性成分較多，故其煎煮后所得干浸膏較多；澤瀉、郁金相較于熟地黃含糖量較少且親水性成分較少，故所得浸膏量較少且與熟地黃相差較大；熟地黃、澤瀉、郁金單煎液浸膏量相差較大對合煎液中浸膏量有一定的影響，且含有熟地黃的合煎液所得浸膏量較多。因此合煎組中以合煎-3（澤瀉、郁金各20 g）所得干浸膏最少，而合煎-4相較于合煎-1、合煎-2相差不大。

雖然毛蕊花糖苷在提高小鼠學(xué)習(xí)記憶力方面有一定的作用[9]，但本試驗結(jié)果表明，澤瀉、郁金及熟地黃三藥合煎液中毛蕊花糖苷煎出量相較于熟地黃單煎液明顯降低。結(jié)合前期小鼠水迷宮實驗及合煎液中5-羥甲基糠醛、23-乙酰澤瀉醇B煎出量測定結(jié)果，以及文獻報道的熟地黃中的5-羥甲基糠醛[12]，澤瀉提取物、郁金中的姜黃素[13-14]均顯示良好的增強學(xué)習(xí)記憶作用，推測毛蕊花糖苷可能并不是三藥合煎液中發(fā)揮藥效作用的主要成分。三藥合煎液具有較好的藥理活性，可能是合煎液中的有效成分達到合適的水平且共同作用的結(jié)果。

本試驗的研究結(jié)果為課題組后續(xù)開展的三藥合煎液有效成分分離純化及活性評價工作奠定了基礎(chǔ)，為闡明三藥合煎液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：125-126.

[2] 王宏潔，金亞紅，李鵬躍，等.鮮、生、熟地黃藥材中3種活性成分含量的比較[J].中國中藥雜志，2008，33（15）：1923-1925.

[3] 胡律江，胡志方，王小平，等.江西建昌幫炆熟地黃的HPLC指紋圖譜[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（23）：33-36.

[4] 李龍宣，趙斌，許志恩，等.熟地黃抑制阿爾茨海默病樣大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的作用[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2006，5（1）：10-13.

[5] 曹玉凈，崔瑛，侯士良，等.熟地黃對擬癡呆模型小鼠記憶力的影響及機制研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2007，41（4）：67-68.

[6] 吳小慧，段忠心，匡小霞，等.澤瀉提取物對大鼠腦缺血-再灌注損傷氧化應(yīng)激的影響[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2014，33（7）：795-798.

[7] Pant N，Misra H，Jain DC.Phytochemical investigation of ethyl acetate extract from Curcuma aromatica Salisb.rhizomes[J].Arab J Chem，2013，6（3）：279-283.

[8] Pan R，Qiu S，Lu DX，et al.Curcumin improves learning and memory ability and its neuroprotective mechanism in mice[J].Chin Med J，2008，121（9）：823-829.

[9] 高莉，彭曉明，霍仕霞，等.毛蕊花糖苷改善D-半乳糖致亞急性衰老小鼠腦損傷的作用[J].中草藥，2014，45（1）：81-85.

[10] 張波泳，江振作，王躍飛，等.UPLC/ESI-Q-TOF MS法分析鮮地黃、生地黃、熟地黃的化學(xué)成分[J].中成藥，2016，38（5）：1104-1108.

[11] 祝魏，張玉萍.HPLC法測定地黃不同炮制品中梓醇的含量[J].江西中醫(yī)藥，2008，39（31）：71-72.

[12] 趙玲，張?zhí)m，李雅莉，等.5-羥甲基糠醛對腦缺血再灌注模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦部自由基的影響[J].中國藥房，2007，18（13）：974-976.

[13] 高虹，胡應(yīng)和.用毒蕈膽堿M1受體激動劑篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)的澤瀉的新用途：中國，CN 1615981[P].2005-05-18.

[14] 廖濤，王飛，張占軍，等.姜黃素對癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及對細胞凋亡的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2009，25（10）：1359-1363.

Effects of Combined Decoctions of Alismatis Rhizoma and Curcumae Radix and Rehmanniae Radix Praeparata on the Decoction Amount of Acteoside in Rehmanniae Radix Praeparata

YUAN Xiaoxu1，YANG Mingming1，WANG Huina1，LI Hongbo1，MIAO Hong2，ZHAO Guiqin1
（1.Institute of Chinese Mateia Medica of Chengde Medical College/Hebei Key Laboratory of Research and Development for Traditional Chinese Medicine，Hebei Chengde 067000，China；2.Hebei Province Key Research Office of Traditional Chinese Medicine Anti-dementia，Hebei Chengde 067000，China）

R284.2

A

1001-0408（2017）25-3487-04

2016-12-09

2017-01-27）

（編輯：劉 萍）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.09

國家科技支撐項目計劃（No.2011BAI07B04）；河北省教育廳項目（No.ZD2016061）；河北省中醫(yī)藥管理局項目（No.2015034）；河北高校重點學(xué)科建設(shè)項目（No.冀教高〔2013〕4號）

＊碩士研究生。研究方向：中藥有效成分的提取分離及含量測定。E-mail：1815485353@qq.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：天然活性產(chǎn)物。E-mail：zhaoguiqin1971@sina.com