肝內(nèi)膽管癌組織中GRP78和IL-6的表達(dá)*

唐文超，翟文龍，葉健文，王 剛，李志遠(yuǎn)，陳向東

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科 鄭州 450052

肝內(nèi)膽管癌組織中GRP78和IL-6的表達(dá)*

唐文超，翟文龍#，葉健文，王 剛，李志遠(yuǎn)，陳向東

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科 鄭州 450052

GRP78；IL-6；肝內(nèi)膽管結(jié)石；肝內(nèi)膽管癌

目的：探討葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)。方法采用免疫組化法檢測GRP78和IL-6在48例肝內(nèi)膽管癌，48例肝內(nèi)膽管結(jié)石及30例正常肝內(nèi)膽管組織中的表達(dá)。結(jié)果GRP78和IL-6在肝內(nèi)膽管癌組織中的陽性表達(dá)率分別為64.6%和60.4%，在肝內(nèi)膽管結(jié)石膽管組織中的陽性表達(dá)率分別為75.0%和68.8%，均高于正常肝內(nèi)膽管組織(6.7%和13.3%)(P<0.05)。肝內(nèi)膽管癌組織中GRP78和IL-6的表達(dá)呈正關(guān)聯(lián)(rP=0.280，P=0.044)。GRP78陽性表達(dá)與癌組織的分化程度(P=0.035)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.015)、TNM分期(P<0.01)有關(guān)；GRP78陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者相比，生存曲線左移(P<0.05)，中位生存時間較短。IL-6陽性表達(dá)與癌組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.008)及TNM分期(P=0.015)有關(guān)；IL-6陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者比較，生存曲線差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.331)。結(jié)論GRP78和IL-6可能參與了肝內(nèi)膽管組織的惡變過程，并與膽管癌的生長、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是一種源于二級及以上肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，而肝內(nèi)膽管結(jié)石能夠誘發(fā)ICC，其具體機(jī)制尚不清楚，多數(shù)認(rèn)為結(jié)石的機(jī)械性刺激和膽汁淤積引起的膽管慢性炎癥導(dǎo)致了ICC的發(fā)生[1]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵蛋白，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)同炎癥和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[2]。白細(xì)胞介素-6(IL-6)作為一種重要的炎癥反應(yīng)因子，參與了腫瘤的發(fā)生，并同腫瘤的生物學(xué)行為存在密切聯(lián)系[3]。該研究采用免疫組化法檢測ICC和肝內(nèi)膽管結(jié)石膽管組織中GRP78和IL-6的表達(dá)，探討它們與ICC患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象回顧性收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科2012年1月至2014年12月行肝部分切除手術(shù)且臨床病歷資料完整患者的組織蠟塊。① ICC組織48例，患者男26例，女22例，年齡28～74歲；均經(jīng)影像學(xué)及術(shù)后病理確診，術(shù)前均未接受放療、化療及生物治療；剔除向肝內(nèi)生長的肝門部膽管癌患者、具有5 a內(nèi)其他腫瘤病史者、混合型肝癌者、重癥化膿性膽管炎合并肝功能衰竭者。②肝內(nèi)膽管結(jié)石膽管組織48例，患者男13例，女35例，年齡30～75歲；均經(jīng)影像學(xué)及術(shù)中確診，術(shù)后病理證實未合并癌變；排除其他腫瘤病史。③正常膽管組織30例，取自單純肝血管瘤切除組織，患者男3例，女27例，年齡28～69歲；均經(jīng)影像學(xué)及術(shù)中確診，術(shù)后病理證實未合并其他肝臟疾病。

1.2膽管組織中GRP78和IL-6的檢測標(biāo)本以甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化法檢測GRP78和IL-6。PV-9000二步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人GRP78抗體(稀釋度1400)、兔抗人IL-6抗體(稀釋度1400)購自美國CST公司，按試劑盒說明書操作。組織切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇和蒸餾水水化，枸櫞酸鹽緩沖液高火2 min低火15 min微波抗原修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，加一抗4 ℃孵育過夜，加通用型二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，封片，鏡檢采集數(shù)據(jù)。用PBS代替一抗作為陰性對照。由2名對患者臨床資料不知情的病理科醫(yī)生同時閱片，結(jié)果有分歧時由第三人閱片，共同討論，判定結(jié)果。應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡閱片，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)黃色或棕黃色著色。在高倍鏡(×400)下觀察10個視野，觀察陽性細(xì)胞染色程度并計算陽性細(xì)胞百分比。細(xì)胞無著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色著色分別計為0、1、2、3分；陽性細(xì)胞百分比<5%、5%～、26%～、51%～、>75%分別計為0、1、2、3、4分。兩項評分相加，<2分判為陰性，≥2分判為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。不同膽管組織、不同臨床病理特征的ICC組織中GRP78和IL-6陽性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法；ICC組織中GRP78和IL-6表達(dá)的關(guān)聯(lián)性采用列聯(lián)系數(shù)評估；采用Kaplan-Meier法分別繪制GRP78、IL-6陰性和陽性患者的生存曲線，并進(jìn)行Log-rank檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3種膽管組織中GRP78和IL-6表達(dá)的比較

GRP78、IL-6主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖1)。肝內(nèi)膽管結(jié)石組和ICC組GRP78、IL-6的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但均大于正常膽管組，見表1。

2.2不同臨床病理特征患者ICC組織中GRP78和IL-6表達(dá)的比較見表2。分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期高的患者ICC組織中GRP78陽性表達(dá)率較高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期較高者IL-6陽性表達(dá)率較高(P<0.05)。

*與正常膽管組比較，P<0.01。

表2 不同臨床病理特征患者ICC組織中GRP78和IL-6表達(dá)的比較

續(xù)表2

*:精確概率。

2.3ICC組織中GRP78和IL-6表達(dá)的關(guān)聯(lián)性見表3。在48例ICC組織中，GRP78和IL-6的表達(dá)呈正關(guān)聯(lián)。

表3 ICC組織中GRP78和IL-6表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 例

rP=0.280，P=0.044。

2.4GRP78和IL-6表達(dá)與ICC患者預(yù)后的關(guān)系

對48例ICC患者采用電話方式進(jìn)行隨訪，隨訪時間自患者接受手術(shù)之日起至2016年6月1日或患者死亡或失訪日期(失訪7例)。生存曲線見圖2、3，分析結(jié)果顯示，GRP78陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者生存曲線差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.999,P=0.046)；IL-6陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者生存曲線差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.944,P=0.331)。

圖2 GRP78陽性和陰性表達(dá)患者的生存曲線

圖3 IL-6陽性和陰性表達(dá)患者的生存曲線

3 討論

研究[4-5]表明，在葡萄糖缺乏、酸中毒、缺氧、鈣離子平衡失調(diào)、病毒和細(xì)菌感染等刺激下，細(xì)胞中的蛋白質(zhì)無法折疊或錯誤折疊并堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并啟動未折疊蛋白反應(yīng)，從而誘發(fā)一系列病理生理改變。GRP78又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白,屬于熱休克蛋白70(heat shock protein70, HSP70)家族的一員，主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白[6]。它通過阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的新生肽聚集及參與調(diào)控未折疊蛋白反應(yīng)，啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性細(xì)胞凋亡及鈣離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，發(fā)揮其生物功能[7]。許多實體腫瘤產(chǎn)生于局部炎癥刺激，炎癥細(xì)胞可以誘發(fā)正?；虻牟环€(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致一系列病理生理學(xué)改變，最終誘發(fā)惡性腫瘤[8]。GRP78可以通過PERK、IRE1和ATF-6信號通路促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)，促進(jìn)包括IL-6在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的釋放[9-10]。IL-6可以通過結(jié)合受體IL-6Rα和共同受體gp130激活JAK/STAT信號通路，從而誘發(fā)腫瘤[11-12]。已有研究[13-14]證實，GRP78在肺癌、肝癌、胃癌等多種實體腫瘤組織中存在高表達(dá)現(xiàn)象，并同腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移情況及預(yù)后密切相關(guān)。有證據(jù)[15]顯示，在膽管癌患者的血清和腫瘤細(xì)胞中IL-6表達(dá)上調(diào)，腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移與IL-6存在密切聯(lián)系。另外IL-6還可以誘發(fā)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管的生成[16]。肺癌、卵巢癌等患者血清IL-6水平與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)，并在化療或手術(shù)后隨之降低，提示IL-6可以作為腫瘤的治療靶點之一[17]。

該研究結(jié)果顯示，ICC和肝內(nèi)膽管結(jié)石膽管組織中GRP78和IL-6的表達(dá)均高于正常膽管組織；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化、TNM晚期的ICC患者癌組織中GRP78陽性表達(dá)率較高，GRP78陽性表達(dá)的患者術(shù)后生存時間短于陰性表達(dá)者；TNM晚期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ICC患者癌組織中IL-6的表達(dá)升高，但未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與術(shù)后預(yù)后有關(guān)。ICC組織中GRP78和IL-6的表達(dá)具有關(guān)聯(lián)性，提示二者可能參與了ICC的發(fā)生發(fā)展。研究[18-20]發(fā)現(xiàn)，通過基因敲除的方法抑制GRP78的表達(dá)，不僅能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，也提高了腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，提示GRP78未來可以成為治療腫瘤的靶點。

總之，GRP78和IL-6在ICC組織中的表達(dá)升高， 兩者可能參與了肝內(nèi)膽管結(jié)石誘導(dǎo)膽管組織癌變的過程，并與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。GRP78和IL-6有可能成為ICC治療的靶點。

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(2016-11-15收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Expressions of GRP78 and IL-6 in intrahepatic cholangiocarcinoma tissue

TANGWenchao,ZHAIWenlong,YEJianwen,WANGGang,LIZhiyuan,CHENXiangdong

DepartmentofHepatobiliaryopancreatSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

GRP78;IL-6;hepatolithiasis;intrahepatic cholangiocarcinoma

Aim: To explore the expressions of GRP78 and IL-6 in intrahepatic cholangiocarinoma(ICC) tissue.Methods: The expressions of GRP78 and IL-6 were detected by immunohistochemical technique in 48 cases of ICC, 48 cases of hepatolithiasis and 30 cases of normal intrahepatic bile duct tissue.Results: The positive rates of GRP78 and IL-6 in ICC tissue were 64.6% and 60.4%, in hepatolithiasis tissue were 75.0% and 68.8%, respectively, which were significantly higher than those in normal intrahepatic bile duct tissue(6.7% and 13.3%,P<0.05). The expression of GRP78 was positively correlated with that of IL-6 (rP=0.280，P=0.044) in ICC tissue. The expression of GRP78 was related with tumor histologic grade(P=0.035), lymph node metastasis(P=0.015) and TNM stage(P<0.01). The patients with positive expression of GRP78 had shorter survival time than those with negative expression(P<0.05). The expression of IL-6 was associated with lymph node metastasis(P=0.008) and TNM stage(P=0.015).There was no significant difference in survival curves of the patients with positive expression of IL-6 and those with negative expression(P=0.331).Conclusion: GRP78 and IL-6 may participate in the progress, growth and metastasis of ICC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.023

R735.8

#通信作者，男，1976年10月生，博士，副教授，副主任醫(yī)師，研究方向：肝膽胰外科疾病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：zhaiwenlong@sina.com

*河南省高校科技創(chuàng)新人才支持計劃 14HASTIT030