食管鱗癌Eca109細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)LSD1的調(diào)控作用*

凡 丞，魯照明，張幸麗，田 菲，白一汝，趙 琦，彭柯崢，劉宏民，侯桂琴

鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

食管鱗癌Eca109細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)LSD1的調(diào)控作用*

凡 丞，魯照明，張幸麗，田 菲，白一汝，趙 琦，彭柯崢，劉宏民，侯桂琴#

鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

食管鱗癌；PI3K/AKT/mTOR通路；LSD1；H3K4me2

目的：探討食管鱗癌Eca109細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)LSD1的調(diào)控作用。方法用不同濃度的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制劑LY294002(0.5、1.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μmol/L)、RAD001(0.05、0.50、5.00、10.00、20.00和50.00 μmol/L)分別處理Eca109細(xì)胞24、48 h，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；然后分別用0、10、20 μmol/L LY294002或RAD001處理Eca109細(xì)胞24 h或20 μmol/L LY294002或RAD001處理不同時(shí)間(0～72 h)，采用Western blot檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路因子、LSD1及組蛋白H3K4me2表達(dá)的變化。結(jié)果LY294002、RAD001處理后，食管鱗癌細(xì)胞增殖受抑，且隨濃度的增加，抑制作用有增強(qiáng)的趨勢(shì)(P<0.05)；LY294002抑制Eca109細(xì)胞中p-p70S6K的表達(dá)，上調(diào)Raptor、Rictor、p-Akt(Ser473)以及組蛋白H3K4me2的表達(dá)；而RAD001抑制了Raptor、Rictor、p-p70S6K表達(dá)，增加p-Akt(Ser473)的表達(dá)，并且下調(diào)LSD1表達(dá)，上調(diào)組蛋白H3K4me2的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)I3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)LSD1存在調(diào)控作用。

食管鱗癌是我國尤其是河南省高發(fā)的惡性腫瘤,其易發(fā)生耐藥，復(fù)發(fā)率高且5 a生存率低，因此探索其發(fā)生的分子機(jī)制及尋找分子治療靶點(diǎn)具有重要意義[1]。研究[2]認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與組蛋白的甲基化和去甲基化水平的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系密切，組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1,LSD1)能夠特異性去除組蛋白H3K4me1/2或H3K9me1/2的甲基化；LSD1作為一種特異性的去甲基化酶在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，并且在多種惡性腫瘤中都存在LSD1的高表達(dá)[3]。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活能引起腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，是腫瘤發(fā)生的主要調(diào)控通路之一[4]。腫瘤發(fā)生過程中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路與LSD1之間是否存在調(diào)控關(guān)系尚不清楚。該研究以人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109為研究對(duì)象，利用PI3K抑制劑LY294002和mTOR抑制劑RAD001分別抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，探討PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)LSD1的調(diào)控作用及對(duì)其功能的影響，為探討食管鱗癌的分子發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料Eca109購自上海中科院細(xì)胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自以色列BI公司，LY294002、RAD001均購自美國MCE公司，LSD1抗體購自美國Abcam公司，H3K4me2、Raptor、Rictor、p-p70S6K、p-Akt(Ser473)及內(nèi)參GAPDH和H3抗體均購自美國CST公司，組蛋白提取試劑盒購自美國EpIGENTEK公司。LY294002和RAD001均用DMSO配制成濃度為20 mmol/L的母液并于-20 ℃保存。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3CCK-8實(shí)驗(yàn)將Eca109細(xì)胞接種于96孔板，6 000個(gè)/孔，過夜培養(yǎng)，然后分別用不同濃度的LY294002(0.5、1.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μmol/L)或RAD001(0.05、0.50、5.00、10.00、20.00和50.00 μmol/L)處理，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。用未處理細(xì)胞作為空白組，并設(shè)置對(duì)照組(只含RPMI 1640培養(yǎng)基)以消除培養(yǎng)基干擾。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后每孔加入5 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的光密度值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，并進(jìn)一步算出LY294002和RAD001的IC50。細(xì)胞增殖抑制率=1-(加藥孔細(xì)胞光密度值-空白孔細(xì)胞光密度值)/(對(duì)照孔細(xì)胞光密度值-空白孔細(xì)胞光密度值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Westernblot將Eca109細(xì)胞接種于6孔板，過夜培養(yǎng)后分別加入0、10和20 μmol/L的LY294002或RAD001處理24 h；或分別用20 μmol/L LY294002或RAD001處理細(xì)胞0、24、36、48和72 h。提取上述處理細(xì)胞及未處理細(xì)胞總蛋白及組蛋白，將40 μg蛋白(組蛋白為2 μg)經(jīng)SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，然后分別加入H3K4me2、Raptor、Rictor、p-p70S6K、p-Akt(Ser473)和LSD1一抗及內(nèi)參GAPDH和H3抗體(按11 000稀釋)，4 ℃孵育過夜；第2天用PBST洗3遍，加入相應(yīng)二抗(按110 000稀釋)，室溫孵育2 h后PBST洗3遍，ECL化學(xué)底物發(fā)光液顯影后暗室曝光，條帶用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量用目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較各組細(xì)胞增殖抑制率、mTOR通路相關(guān)信號(hào)分子、LSD1和組蛋白H3K4me2表達(dá)的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1LY294002、RAD001對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示，LY294002和RAD001處理24和48 h均能明顯抑制Eca109細(xì)胞增殖，且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率升高(表1、2)。LY294002在24 h和48 h的IC50分別為(45.618±3.219)和(19.167±3.142) μmol/L，RAD001分別為(49.868±4.488)和(18.263±5.621) μmol/L。

表1 LY294002對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的抑制作用(n=3) %

表2 RAD001對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的抑制作用(n=3) %

2.2LY294002和RAD001對(duì)Eca109細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的影響

LY294002處理后，Eca109細(xì)胞中p-p70S6K的表達(dá)下降，Raptor、Rictor、p-Akt(Ser473)的表達(dá)上調(diào)，且隨著LY294002濃度的增加，這種變化更加明顯；而RAD001處理Eca109細(xì)胞后，Raptor、Rictor、p-p70S6K的表達(dá)量隨著RAD001濃度的增加有降低的趨勢(shì)，而p-Akt(Ser473)的表達(dá)則有不同程度的增加。見圖1，表3、4。

2.3LY294002和RAD001對(duì)Eca109細(xì)胞LSD1及組蛋白H3K4me2表達(dá)的影響LY294002可使H3K4me2的表達(dá)上調(diào)，且H3K4me2的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增大有升高的趨勢(shì)，而LSD1的表達(dá)沒有明顯變化。RAD001能抑制LSD1的表達(dá)，升高H3K4me2的表達(dá)，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加，其作用更為顯著。見圖2、3及表5、6。

上：LY294002；下：RAD001；1～3：分別為0、10、20 μmol/L。 圖1 不同濃度 LY294002和 RAD001對(duì)PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

c(LY294002)/(μmol·L-1)RaptorRictorp-p70S6Kp-Akt(Ser473)00.334±0.0700.490±0.1200.458±0.0600.511±0.125100.779±0.049*0.673±0.1140.390±0.0620.806±0.165201.020±0.027*1.086±0.161*0.170±0.043*0.972±0.152*F136.59815.83621.8617.421P<0.0010.0040.0020.024

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05。

表4 RAD001對(duì)Eca109細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=3)

*：與0 μmol/L相比，P<0.05。

1～3：分別為0、10、20 μmol/L LY294002處理24 h；4～8：分別為20 μmol/L LY294002處理0、24、36、48、72 h。 圖2 LY294002對(duì)Eca109細(xì)胞中LSD1及組蛋白H3K4me2表達(dá)的影響

c/(μmol·L-1)LY294002LSD1H3K4me2RAD001LSD1H3K4me201.411±0.1240.698±0.1081.010±0.0930.707±0.202101.384±0.1471.219±0.174*0.871±0.0551.280±0.074*201.397±0.1081.321±0.050*0.481±0.221*1.302±0.098*F0.0342.60211.20618.327P0.9670.0020.0090.003

*：與0 μmol/L組相比，P<0.05。

表6 20 μmol/L LY294002或RAD001作用不同時(shí)間對(duì)Eca109細(xì)胞 LSD1及H3K4me2表達(dá)的影響(n=3)

*：與0 h組相比，P<0.05。

3 討論

LSD1是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的去甲基化酶，能夠催化組蛋白H3K4me1/2和H3K9me1/2脫甲基，抑制或激活轉(zhuǎn)錄，其在許多類型的惡性腫瘤中高表達(dá)，并且與腫瘤發(fā)生過程中的致癌作用密切相關(guān)。然而，腫瘤中導(dǎo)致LSD1上調(diào)的機(jī)制目前仍不明確[5-7]。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖和分化中起重要作用[8-10]，但目前關(guān)于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路與LSD1關(guān)系的研究很少，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具體調(diào)控機(jī)制還不清楚。有報(bào)道[11-12]證實(shí)，LSD1能夠和一些小分子形成共抑制復(fù)合物來調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路上游抑制子PTEN的轉(zhuǎn)錄。Yokoyama 等[13]的研究發(fā)現(xiàn)LSD1能夠調(diào)控PTEN的表達(dá)，在LSD1被抑制的情況下，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)也明顯被抑制。Shao等[14]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中EGFR能夠通過PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)LSD1的表達(dá)并能影響其功能，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這些實(shí)驗(yàn)都證明LSD1與mTOR通路之間存在著某種調(diào)控關(guān)系。

1～3：分別為0、10、20 μmol/L RAD001處理24 h；4～8：分別為20 μmol/L RAD001處理0、24、36、48、72 h。 圖3 RAD001對(duì)Eca109細(xì)胞中 LSD1及組蛋白H3K4me2表達(dá)的影響

為了探討食管鱗癌細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)LSD1的調(diào)控作用，作者首先研究了PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑LY294002和RAD001對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的影響及其對(duì)PI3K/AKT/mTOR通路的抑制作用，然后觀察抑制該通路后細(xì)胞中LSD1及組蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LY294002和RAD001均能抑制Eca109細(xì)胞增殖，并且能夠抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，且二者均能夠通過調(diào)節(jié)LSD1的去甲基化功能從而上調(diào)組蛋白H3K4me2的表達(dá)，并且RAD001對(duì)LSD1的表達(dá)也具有抑制作用。由此，初步推斷在食管鱗癌中LSD1可能處在PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的下游，且受此信號(hào)通路的調(diào)控。

Djukom等[15]和Werzowa等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，在治療胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和黑色素瘤時(shí)，單獨(dú)應(yīng)用RAD001或LY294002能夠上調(diào)p-Akt(Ser473)的表達(dá)，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生。該研究亦顯示食管鱗癌細(xì)胞中也存在類似的情況，這可能因?yàn)閙TOR通路存在多條反饋回路，當(dāng)mTOR被抑制后能夠引起該通路的負(fù)反饋激活[17]。這也可能是臨床單獨(dú)應(yīng)用RAD001效果相對(duì)較差的原因，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中食管鱗癌細(xì)胞對(duì)二者的敏感性不高(藥物作用48 h其IC50仍接近20 μmol/L)也可能是因?yàn)锳kt的負(fù)反饋激活。

總之，研究初步證實(shí)了Eca109細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)LSD1存在調(diào)控作用，為從表觀遺傳學(xué)的角度治療食管鱗癌提供了新思路。

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(2016-12-05收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Regulation effects of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway on LSD1 in Eca109 cells

FANCheng,LUZhaoming,ZHANGXingli,TIANFei,BAIYiru,ZHAOQi,PENGKezheng,LIUHongmin,HOUGuiqin

SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

esophageal squamous cell carcinoma;PI3K/AKT/mTOR signaling pathway;LSD1;H3K4me2

Aim: To explore the regulation effects of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway on LSD1 in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) Eca109 cells. Methods: Eca109 cells were treated with PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitor LY294002 or RAD001 with different concentrations for 24, 48 h, then the proliferation of cells was detected by CCK-8 assay. Eca109 cells were treated with LY294002 or RAD001 with different concentration for 24 h,or treated with LY294002 or RAD001 at the same concentration for different time,then the expressions of proteins in PI3K/AKT/mTOR signaling pathway, LSD1 and histone H3K4me2 were detected by Western blot, respectively. Results: The proliferation of Eca109 cells was significantly inhibited by LY294002 or RAD001, and the inhibition effects increased along with the increase of the concentration(P<0.05); LY294002 inhibited the expression of p-p70S6K and promoted the expressions of Raptor, Rictor, p-Akt(Ser473) and histone H3K4me2; while RAD001 inhibited the expressions of Raptor, Rictor, p-p70S6K, up-regulated the expressions of p-Akt(Ser473) and histone H3K4me2, and down-regulated that of LSD1(P<0.05). Conclusion: The PI3K/AKT/mTOR signaling pathway has regulation effects on LSD1.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.004

R735.1

#通信作者，女，1977年6月生，博士，副教授，研究方向：腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)，E-mail:hougq@zzu.edu.cn

*國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目 81430085；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目 162300410122