• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    懷地黃內(nèi)生細菌的分離鑒定及抗菌活性

    2017-09-28 08:27:25王瑞飛康春曉許圓圓楊清香
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年13期
    關(guān)鍵詞:抑菌活性生物防治

    王瑞飛+康春曉+許圓圓+楊清香

    doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.023[HT9.]

    摘要:從藥用植物懷地黃的根中分離出32株內(nèi)生細菌,并選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、地黃斑枯病和地黃根腐病5種菌作為供試菌株,采用點菌法、平板對峙法和菌餅法測定抗菌活性。結(jié)果顯示,懷地黃中分離的32株內(nèi)生菌對5種供試菌具有不同的抑制能力,其中有8株細菌對供試的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉都有抑制作用,顯示出廣譜的抗菌性;有2株細菌DH-10和DH-11對選取的5種供試菌都有抑制作用,且抗菌活性較強,具有生防菌開發(fā)潛力。所分離的活性內(nèi)生菌通過16S rRNA基因序列分析,主要分布在芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和大腸埃希氏菌屬,其中對地黃斑枯病和根腐病都具有拮抗作用的內(nèi)生菌主要集中在芽孢桿菌屬中。

    關(guān)鍵詞:懷地黃;內(nèi)生細菌;抑菌活性;生物防治

    中圖分類號: S182文獻標(biāo)志碼: A[HK]

    文章編號:1002-1302(2017)13-0082-04[HS)][HT9.SS]

    收稿日期:2016-09-01

    基金項目:國家自然科學(xué)基金(編號:21277041、21477035);河南省高??萍紕?chuàng)新團隊支持計劃(編號:13IRTSTHN009)。

    作者簡介:王瑞飛(1983—),男,河南汝州人,博士,講師,主要從事農(nóng)業(yè)資源與微生物學(xué)研究。E-mail:wswrf@163.com。

    通信作者:楊清香,博士,教授,主要從事資源與環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail:yangqx66@163.com。[HJ]

    [ZK)]

    植物內(nèi)生菌(endophyte)是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部,而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物[1]。它們能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性物質(zhì),有抗菌、抗腫瘤、殺蟲、免疫抑制、抗氧化等生物學(xué)活性[2-5]。已有的報道顯示,從內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)新活性化合物的比例為51%,超過土壤微生物的38%[6],因此,利用植物內(nèi)生菌篩選高效、新穎、低毒的抗菌活性物質(zhì)潛力巨大。除了能夠促進植物生長和賦予植物抗逆性[7-8]之外,植物內(nèi)生菌還可以通過分泌抗生物質(zhì)和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性[9]等不同機制,來減輕和防治植物病蟲害。植物內(nèi)生菌的以上特性使其成為醫(yī)藥工業(yè)、農(nóng)用化學(xué)品工業(yè)研究的一個新起點[10]。

    懷地黃(Rehmannia glutinosa Libosch)是玄參科(Scrophulariaceae)地黃屬(Rehmannia)多年生草本植物,主產(chǎn)于河南、遼寧、河北、山東、浙江等地。它以根入藥,具有多種藥效,常用于治病養(yǎng)生、滋補保健、清熱涼血、養(yǎng)陰生津[11],具有廣泛的臨床應(yīng)用價值和重要的經(jīng)濟價值。但是,對于懷地黃內(nèi)生菌的研究并不深入。本研究對采自河南省焦作市武陟地區(qū)的懷地黃進行內(nèi)生菌的分離篩選,以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉、地黃斑枯病菌和地黃根腐病菌為供試菌株,對所得菌株進行抗菌活性的初步研究,探討懷地黃內(nèi)生菌對不同病原菌的拮抗作用,為開發(fā)利用地黃植物內(nèi)生菌資源提供了初步的試驗依據(jù)。

    1材料與方法

    [HTK]1.1材料[HT]

    1.1.1植物材料懷地黃于2012年11月采自河南省焦作市武陟地區(qū)。

    1.1.2供試菌種大腸桿菌(Escherichia coli,革蘭氏陰性)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,革蘭氏陽性)和黑曲霉(Aspergillus niger,霉菌)均由河南師范大學(xué)環(huán)境微生物實驗室保存,地黃斑枯病病菌(Septoris digitalis)和地黃根腐病病菌(Fusarium silani)2種病原真菌購自河南科技學(xué)院。

    1.1.3培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基,真菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基[12]。

    1.2方法

    1.2.1內(nèi)生菌的分離純化與保存[11]

    取新鮮的懷地黃塊根,用清水洗去表面泥土,在無菌條件下去除表皮,依次用70%乙醇浸泡3 min、0.1%HgCl2溶液浸泡3 min、70%乙醇分別浸泡1 min,然后用無菌水清洗5~7次,放置在無菌吸水紙上晾干;取最后1次清洗水涂布于LB培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng) 2 d,檢測表面消毒是否徹底。用無菌刀片將消毒后的懷地黃塊根切成1 cm見方的小塊,接種于LB培養(yǎng)基上,于37 ℃培養(yǎng) 2 d。待平板上懷地黃塊周圍長出菌后,轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上進行劃線分純。再等培養(yǎng)基上有菌長出后,立即挑選新的菌落進行純化,直到平板上菌落外觀形態(tài)一致為止,將純化后的單一菌株在試管斜面中劃線,并于4 ℃條件下保藏。

    1.2.2內(nèi)生菌抗菌活性測定

    本試驗采用平板點接法、平板對峙法[11]和菌餅法[13]來測定內(nèi)生菌的抗菌活性。

    平板點接法應(yīng)用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌,將經(jīng)平板活化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌配置成一定濃度的菌懸液,細胞濃度一般為105~106 CFU/mL之間。將懸液均勻涂布于LB培養(yǎng)基上,將分離出的內(nèi)生菌點接于平板上,37 ℃培養(yǎng)24~48 h,看是否有抑菌圈的出現(xiàn),統(tǒng)計抑菌強度大小。

    平板對峙法用于黑曲霉,將分離出的內(nèi)生菌和黑曲霉分別接種于PDA平板上,兩者相間隔2 cm,于28 ℃培養(yǎng)5~7 d,看分離出的內(nèi)生菌是否對黑曲霉有抑制效果。處理組菌絲生長速度慢于對照組則表明此內(nèi)生菌對黑曲霉有抑制效果。

    菌餅法應(yīng)用于地黃根腐病菌(Fusarium silani)和地黃斑枯病菌(Fusarium wilt)拮抗內(nèi)生菌的篩選。將分離出的內(nèi)生菌配置成一定濃度的菌懸液,細胞濃度一般為105~106 CFU/mL 之間。將懸液均勻涂布于LB培養(yǎng)基上,地黃病原菌分別接種于PDA平板上,在接菌的PDA平板上打孔挑取直徑為5 mm地黃枯萎病菌和地黃根腐病菌菌餅接種于LB平板中,挑取菌餅于空白LB平板作對照。28 ℃培養(yǎng)5~7 d,觀察菌落生長情況及抑制效果。按下列公式計算抑制率:菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。endprint

    1.2.3內(nèi)生細菌鑒定將純化后的菌株進行DNA提取[14]、16S rRNA的擴增和測序。采用16S rRNA通用引物27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增[15]。將提取的DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列檢測,利用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因序列進行比對分析,通過MEGA 4.1軟件對同源序列以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列進行多重序列比對,運用NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,初步確定菌株的分類地位。

    2結(jié)果與分析

    2.1活性內(nèi)生細菌分離和抑菌活性測定

    采用嚴格的組織表面消毒法,對地黃塊根進行了內(nèi)生細菌的分離,共獲得32株內(nèi)生細菌。利用大腸桿菌、金黃色球菌、黑曲霉、地黃斑枯病病菌和地黃根腐病病菌作為供試菌種對所分離的內(nèi)生菌的抑菌效果進行研究。結(jié)果表明,32株地黃內(nèi)生細菌對5種供試菌有不同程度的抑制效果。抑制大腸桿菌的活性菌占分離總菌數(shù)的56.3%,抑制金黃色葡萄球菌的活性菌占分離總菌數(shù)的53.1%,抑制黑曲霉的活性菌株占分離總細菌數(shù)的比例高達75.0%,抑制地黃斑枯病病菌的活性菌株占分離總細菌數(shù)的18.8%,抑制地黃根腐病病菌的活性菌株占分離總細菌數(shù)的9.4%。在這些具有抗菌活性的菌株中,DH-10和DH-11這2株細菌對5種供試菌均能有效抑制(表1);1株細菌DH-01對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和地黃斑枯病病菌均能有效抑制(表1);1株細菌 DH-23 對金黃色葡萄球菌、黑曲霉、地黃斑枯病病菌和地黃根腐病病菌均能有效抑制(表1);8株菌(DH-01、DH-10、DH-11、DH-17、DH-26、DH-27、DH-28和DH-29)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉均能有效抑制(表1)?;钚詢?nèi)生菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑制效果舉例見圖1。這些結(jié)果表明,地黃內(nèi)生菌中的部分菌株具有較為廣譜的抗菌活性。

    針對能夠?qū)е碌攸S斑枯病和根腐病的病原菌的進一步分析顯示,32株地黃內(nèi)生細菌中有6株內(nèi)生細菌(DH-01、DH-06、DH-08、DH-10、DH-11和DH-23)對地黃斑枯病有抑制作用(圖2),DH-8和DH-10抑制作用最強,抑制率達95%以上;有3株內(nèi)生菌DH-10、DH-11和DH-23對地黃根腐病病菌表現(xiàn)出明顯的抑制(圖2),其抑菌率依次為94.2%、71.4%、85.7%。值得關(guān)注的是,具有抑制地黃根腐病病菌作用的3株內(nèi)生菌同時也具備抑制地黃斑枯病的作用,尤其是DH-10對2種病原真菌的抑制率均達到了94%以上,有望被用作生物防治菌種進行開發(fā)利用。

    2.2活性內(nèi)生菌的鑒定

    對所分離的32株內(nèi)生菌分別進行16S rRNA基因序列分析和BLAST比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示,這32株內(nèi)生菌主要分布在芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和大腸埃希氏菌屬。

    在這些內(nèi)生菌中,分布于芽孢桿菌屬的25株占總分離菌株數(shù)的78.1%。其中,2株活性菌DH-10和DH-11分別與Bacillus tequilensis和Bacillus vallismortis有99%和84%的相似性,且對5種供試菌都有抑制作用。除了這2株菌外,還有2株菌對地黃根腐病病菌有抑制作用。分布于假單胞菌屬的4株菌占總分離菌株的12.5%,主要集中在Pseudomonas brassicacearum和Pseudomonas fluorescens。其中有3株菌不同程度的抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉,有1株菌DH-23對地黃斑枯病病菌和根腐病病菌有抑制作用。分布于大腸埃希菌屬的3株菌占總分離菌株的9.4%,其中DH-08對地黃斑枯病病菌有一定的抑制作用,DH-17對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉都有抑制作用,對于該屬菌的生

    [FK(W21][TPWRF1.tif][FK)]

    防抗菌作用還未曾見報道。

    3結(jié)論與討論

    從懷地黃根中分離得到32株內(nèi)生細菌,這些內(nèi)生菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉都有不同程度的抑制作用,其中8株內(nèi)生菌對革蘭氏陰性和陽性細菌以及霉菌都有抗性,顯示抗菌譜廣、抗菌活性強的特性;其中有2株細菌DH-10和DH-11對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、地黃枯萎病病菌和地黃根腐病病菌5種供試菌株都有拮抗作用,且抗菌活性較強。

    采用細菌16S rRNA基因序列對分離出的32株細菌進行分子生物學(xué)鑒定和遺傳進化分析發(fā)現(xiàn),這些內(nèi)生菌主要分布在芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和大腸埃希菌屬中。其中對懷地黃枯萎病和根腐病病菌都有抑制作用的菌株主要分布在芽孢桿菌屬中。本研究發(fā)現(xiàn)具有最廣譜抗菌活性的DH-10和DH-11分別與芽孢桿菌屬中的Bacillus vallismortis 和Bacillus tequilensis具有密切的親緣關(guān)系。Michael等于1996年首次從土壤中分離得到Bacillus vallismortis,證明這株菌與枯草芽孢桿菌密切相關(guān)[16]。Gatson等于2006年首次發(fā)現(xiàn)Bacillus tequilensis 16S rRNA基因序列與枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出

    [FL)]

    [FK(W11][TPWRF2.tif][FK)]

    [FL(2K2]99%的相似性[17]。已有的報道顯示,枯草芽孢桿菌廣泛應(yīng)用于植物根部、枝干、葉、花部以及果蔬采后病害防治方面[18],甚至用于人和動物疾病的治療和預(yù)防。因此,本研究首次從地黃內(nèi)生菌中分離到的這2種芽孢桿菌可能與枯草芽孢桿菌在一些生理活性上具有密切關(guān)聯(lián)性,比如它們的抑菌活性。除此之外,本研究中分離得到的芽孢桿菌屬內(nèi)生菌中存在大量抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的活性菌。目前,普遍的觀點認為芽孢桿菌主要通過營養(yǎng)和空間位點競爭、抗菌物質(zhì)產(chǎn)生、溶菌作用、誘導(dǎo)植物抗病性等方面來發(fā)揮其防病促生作用[19-20]。正是通過這些相關(guān)機制,芽孢桿菌殺菌劑對多種植物病原菌產(chǎn)生較強的拮抗作用,并同時具備環(huán)境兼容性好、抗逆性強、對人畜安全、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點[21]。endprint

    因此,利用所獲得的具有抗菌活性的芽孢桿菌進一步深入進行研究,開發(fā)相關(guān)微生物菌劑是筆者后續(xù)要進行的重要工作之一。

    [HS2]參考文獻:

    [1][ZK(#]Zhang H W,Song Y C,Tan R X. Biology and chemistry of endophytes[J]. Nature Product Reports,2006,23(5):753-771.

    [2]Zhang Y,Proenca R,Maffei M,et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue[J]. Nature,1994,372(6505):425-432.[HJ1.8mm]

    [3]Stierle A,Strobel G,Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae,an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science,1993,260(5105):214-216.

    [4]姚玉秀,魏希穎. 藥用植物內(nèi)生真菌生物活性及其成分研究[J]. 藥用生物技術(shù),2011,18(2):185-188.

    [5]Strobel G,Daisy B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,2003,67(4):491-502.

    [6]Yu H S,Zhang L,Li L,et al. Recent developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by endophytes[J]. Microbiological Research,2010,165(6):437-449.

    [7]朱峰,林永成,周世寧,等. 紅樹內(nèi)生真菌#2526和#1850中[XCZ111.tif;%88%88]酮類代謝產(chǎn)物的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2004,15(6):406-409.

    [8]Chaintreuil C,Giraud E,Prin Y,et al. Photosynthetic bradyrhizobia are natural endophytes of the African wild rice Oryza breviligulata[J]. Applied[KG*1]and[KG*1]Environmental[KG*1]Microbiology,2000,66(12):5437-5447.

    [9][ZK(#]Chen C,Bauske E M,Musson G,et al. Biological control of Fusarium wilt on cotton by use of endophytic bacteria[J]. Biological Control,1995,5(1):83-91.[ZK)]

    [10][ZK(#]Harish S,Kavino M,Kumar N,et al. Induction of defense-related proteins by mixtures of plant growth promoting endophytic bacteria against Banana bunchy top virus[J]. Biological Control,2009,51(1):16-25.

    [11]楊清香,謝永生,張昊,等. 懷地黃活性內(nèi)生菌的分離鑒定及抗菌抗腫瘤活性[J]. 微生物學(xué)通報,2010,37(10):1467-1474.

    [12]沈萍. 微生物學(xué)實驗[M]. 3版.北京:高等教育出版社,1999:49.

    [13]單文榮,劉花粉,李俊霞,等. 菌餅法篩選不同活性物對棉花黃萎病菌抑制效果研究[J]. 中國棉花,2010,37(8):16-18.

    [14]Stahl D A,F(xiàn)lesher B,Mansfield H R,et al. Use of phylogenetically based hybridization probes for studies of ruminal microbial ecology[J]. Applied and Environmental Microbiology,1988,54(5):1079-1084.

    [15]Yang Q X,Zhang J,Zhu K F,et al. Influence of oxytetracycline on the structure and activity of microbial community in wheat rhizosphere soil[J]. Journal of Environmental Sciences,2009,21(7):954-959.

    [16]Roberts M S,Nakamura L K,Cohan F M. Bacillus[KG*2/3]vallismortis[KG*2/3]sp.[ZK)][HT][HJ][HT][FL)]

    [KH*4D]

    [HT8.][ZK(#]nov.,a close relative of Bacillus subtilis,isolated from soil in Death Valley,California[J]. International Journal of Systematic Bacteriology,1996,46(2):470-475.

    [17]Gatson J W,Benz B F,Chandrasekaran C,et al. Bacillus tequilensis sp. nov.,isolated from a 2000-year-old Mexican shaft-tomb,is closely related to Bacillus subtilis[J]. International Journal of [JP2]Systematic and Evolutionary Microbiology,2006,56(7):1475-1484.[JP]

    [18]黃海嬋,裘娟萍. 枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究進展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(3):213-215,219.

    [19]Bais H P,F(xiàn)all R,Vivanco J M. Biocontrol subtilis against infection of arabidopsis roots by pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production[J]. Plant Physiology,2004,134(1):307-319.

    [20]Julkowska D,Obuchowski M,Holland I B,et al. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type:critical effects of surfactin and the composition of the medium[J]. Journal of Bacteriology,2005,187(1):65-76.

    [21]朱明妍,劉姣,杜春梅. 芽孢桿菌生物防治植物病害研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(34):16635-16638.endprint

    猜你喜歡
    抑菌活性生物防治
    植物內(nèi)生菌在植物病害中的生物防治
    淺談林業(yè)有害生物防治
    林業(yè)有害生物防治技術(shù)分析
    加強有害生物防治,保護林木生態(tài)安全——方城縣有害生物防治工作成效顯著
    5種植物粗提物對稻瘟病菌的抑菌活性
    一株放線菌藍色素的提取及相關(guān)研究
    一株植物內(nèi)生放線菌次級代謝產(chǎn)物的提取及抑菌活性研究
    科技視界(2016年11期)2016-05-23 17:09:25
    植物病害生物防治
    白芨多糖的抑菌作用研究
    魁蚶蛋白胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的抑菌活性
    五月伊人婷婷丁香| 国产精品福利在线免费观看| 少妇高潮的动态图| 亚洲,欧美,日韩| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产v大片淫在线免费观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品久久久久久久末码| 男女视频在线观看网站免费| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲图色成人| 少妇高潮的动态图| 国产不卡一卡二| 亚洲国产欧美人成| 在现免费观看毛片| 久久久a久久爽久久v久久| 搞女人的毛片| 村上凉子中文字幕在线| 听说在线观看完整版免费高清| 国产亚洲av嫩草精品影院| 中文字幕制服av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 精品一区二区三区视频在线| 国产精品永久免费网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 干丝袜人妻中文字幕| 久久久久久久午夜电影| 亚洲成人久久性| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产成人精品一,二区 | 91精品一卡2卡3卡4卡| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲在线自拍视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 99热精品在线国产| 人人妻人人看人人澡| 日韩视频在线欧美| 大香蕉久久网| 国产免费一级a男人的天堂| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲18禁久久av| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲五月天丁香| 国产69精品久久久久777片| 最近手机中文字幕大全| 久久久久网色| 日本欧美国产在线视频| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产极品精品免费视频能看的| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲精品日韩av片在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲av一区综合| 最后的刺客免费高清国语| 国产麻豆成人av免费视频| 国产高清三级在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 99热网站在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 日韩欧美国产在线观看| 久久久久国产网址| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲综合色惰| 最新中文字幕久久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av| 少妇的逼好多水| 免费观看人在逋| 性色avwww在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 久久草成人影院| 国产 一区 欧美 日韩| 看片在线看免费视频| 大香蕉久久网| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久这里只有精品中国| 在线观看午夜福利视频| av黄色大香蕉| 亚洲成人久久性| 精品久久久久久久久av| 久久久久性生活片| 国产伦在线观看视频一区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| a级毛色黄片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 欧美日韩在线观看h| 青青草视频在线视频观看| 99热这里只有是精品在线观看| 少妇高潮的动态图| 亚洲av男天堂| 可以在线观看的亚洲视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩av不卡免费在线播放| 色综合站精品国产| 麻豆av噜噜一区二区三区| av在线亚洲专区| 黄片无遮挡物在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久草成人影院| 99久久九九国产精品国产免费| 26uuu在线亚洲综合色| 69av精品久久久久久| 校园春色视频在线观看| av.在线天堂| 亚洲av成人av| 春色校园在线视频观看| av专区在线播放| 大型黄色视频在线免费观看| 免费看美女性在线毛片视频| 精品久久久久久成人av| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产av不卡久久| 国产真实乱freesex| 美女被艹到高潮喷水动态| 日韩人妻高清精品专区| 日本av手机在线免费观看| 亚洲人成网站在线播| 亚洲av二区三区四区| 国产私拍福利视频在线观看| 国产真实乱freesex| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜免费男女啪啪视频观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲三级黄色毛片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 我要搜黄色片| 高清在线视频一区二区三区 | 婷婷精品国产亚洲av| 日日撸夜夜添| 少妇人妻精品综合一区二区 | 夫妻性生交免费视频一级片| 日本黄色片子视频| 男人的好看免费观看在线视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产片特级美女逼逼视频| 日韩一区二区三区影片| 国产成人a区在线观看| 黄色一级大片看看| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲欧洲国产日韩| 成人漫画全彩无遮挡| 午夜激情福利司机影院| 国内精品久久久久精免费| 18+在线观看网站| 亚洲精品自拍成人| 有码 亚洲区| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 九九在线视频观看精品| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲人与动物交配视频| 国产91av在线免费观看| 日韩欧美在线乱码| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 在线播放国产精品三级| 中文字幕av在线有码专区| 三级经典国产精品| 日日啪夜夜撸| 国产亚洲91精品色在线| 深爱激情五月婷婷| 美女内射精品一级片tv| 在线免费十八禁| 99热这里只有是精品在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久久久久久久久成人| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲综合色惰| а√天堂www在线а√下载| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美bdsm另类| 最后的刺客免费高清国语| 国产精品电影一区二区三区| eeuss影院久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲av中文av极速乱| 欧美日韩乱码在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日韩中字成人| 在线免费十八禁| 国产伦理片在线播放av一区 | 女人被狂操c到高潮| 少妇高潮的动态图| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产精品蜜桃在线观看 | 欧美日韩乱码在线| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美激情在线99| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 老司机影院成人| 欧美激情国产日韩精品一区| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品综合久久久久久久免费| 六月丁香七月| 伦精品一区二区三区| 高清日韩中文字幕在线| 成人二区视频| 日韩欧美 国产精品| 观看美女的网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 五月伊人婷婷丁香| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产视频内射| 寂寞人妻少妇视频99o| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99热这里只有精品一区| 一区二区三区高清视频在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日本色播在线视频| 亚洲最大成人手机在线| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产av一区在线观看免费| 亚洲精品自拍成人| 国内精品宾馆在线| 亚洲,欧美,日韩| 日韩三级伦理在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 一区二区三区高清视频在线| 在线观看午夜福利视频| 看免费成人av毛片| 中国国产av一级| 精品人妻一区二区三区麻豆| 最好的美女福利视频网| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 色综合色国产| 一级毛片久久久久久久久女| 99热精品在线国产| 国产精品一及| 亚洲av电影不卡..在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 久久人人爽人人片av| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产成人精品久久久久久| 丰满的人妻完整版| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产精品蜜桃在线观看 | 少妇人妻一区二区三区视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 我要搜黄色片| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av.av天堂| 在线免费十八禁| 波多野结衣巨乳人妻| av在线蜜桃| 黑人高潮一二区| 亚洲精品国产av成人精品| 日本三级黄在线观看| 亚洲最大成人中文| 日本与韩国留学比较| 综合色av麻豆| 最近的中文字幕免费完整| 日韩一区二区视频免费看| 不卡一级毛片| 色综合站精品国产| 少妇熟女欧美另类| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产 一区精品| 亚洲国产精品成人综合色| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 永久网站在线| 淫秽高清视频在线观看| 91精品国产九色| 亚洲成人av在线免费| 国产成人精品婷婷| 99热6这里只有精品| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av| 我的女老师完整版在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本在线视频免费播放| 全区人妻精品视频| 亚洲高清免费不卡视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产三级在线视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 悠悠久久av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品野战在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品自拍成人| 欧美性感艳星| 少妇的逼水好多| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品久久久久久久末码| 免费看光身美女| 欧美精品国产亚洲| 能在线免费观看的黄片| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美zozozo另类| 国产单亲对白刺激| 国产成人freesex在线| 亚洲精品国产成人久久av| 一夜夜www| 99热精品在线国产| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲一区高清亚洲精品| 免费无遮挡裸体视频| 青春草亚洲视频在线观看| 99热精品在线国产| 搡女人真爽免费视频火全软件| 干丝袜人妻中文字幕| 中文亚洲av片在线观看爽| 日韩av在线大香蕉| 可以在线观看毛片的网站| 国产高清激情床上av| 91精品国产九色| 成年女人看的毛片在线观看| 插阴视频在线观看视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 免费黄网站久久成人精品| 国产精品无大码| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 97超碰精品成人国产| 丰满乱子伦码专区| 精品久久久久久久久久久久久| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美精品一区二区大全| 国产片特级美女逼逼视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清| av在线老鸭窝| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲不卡免费看| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久久性生活片| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 大香蕉久久网| 欧美成人一区二区免费高清观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产伦理片在线播放av一区 | 亚洲国产欧美在线一区| 如何舔出高潮| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲色图av天堂| 99久久无色码亚洲精品果冻| 少妇的逼水好多| 国产精品人妻久久久影院| 国产日韩欧美在线精品| 搡女人真爽免费视频火全软件| 99久国产av精品| 国内精品美女久久久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 亚洲在线自拍视频| 久久国产乱子免费精品| 欧美成人免费av一区二区三区| 看十八女毛片水多多多| 最后的刺客免费高清国语| 日韩一区二区视频免费看| 草草在线视频免费看| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲av中文av极速乱| 精品无人区乱码1区二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 免费观看的影片在线观看| 日本三级黄在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 国产人妻一区二区三区在| 在线观看av片永久免费下载| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费观看在线日韩| 亚洲成人久久爱视频| 大香蕉久久网| 一本久久中文字幕| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 久久精品人妻少妇| 国产精品久久视频播放| 欧美日韩国产亚洲二区| 99在线人妻在线中文字幕| 免费黄网站久久成人精品| 久久久午夜欧美精品| 夜夜夜夜夜久久久久| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲最大成人手机在线| 日韩av不卡免费在线播放| 最近中文字幕高清免费大全6| 黄色一级大片看看| 午夜福利在线观看吧| 国产免费男女视频| 69av精品久久久久久| 亚洲成av人片在线播放无| 深爱激情五月婷婷| 看黄色毛片网站| 18禁在线播放成人免费| 欧美人与善性xxx| 久久久久久大精品| 亚洲性久久影院| 国产成人精品婷婷| 亚洲欧美成人精品一区二区| 波多野结衣高清作品| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久中文看片网| 99热这里只有精品一区| 97超视频在线观看视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产成人精品一,二区 | 亚洲国产精品国产精品| 我的女老师完整版在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲在线自拍视频| 久久精品影院6| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 美女国产视频在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品一及| 日韩一区二区视频免费看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产精品野战在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久国产成人精品二区| avwww免费| 国产69精品久久久久777片| 少妇丰满av| av黄色大香蕉| 久久久久久久久大av| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 最新中文字幕久久久久| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美最黄视频在线播放免费| 黄色视频,在线免费观看| 国产 一区 欧美 日韩| www.色视频.com| 亚洲在线观看片| 国产成人91sexporn| 日韩大尺度精品在线看网址| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲七黄色美女视频| av在线亚洲专区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产伦理片在线播放av一区 | 91精品国产九色| 亚洲美女视频黄频| 久久人人爽人人片av| 欧美一区二区精品小视频在线| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 极品教师在线视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产精品蜜桃在线观看 | 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲精品影视一区二区三区av| 三级国产精品欧美在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产一区二区三区av在线 | 国产精品无大码| 性欧美人与动物交配| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 桃色一区二区三区在线观看| 国产成人91sexporn| 久久这里有精品视频免费| 天堂√8在线中文| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 尾随美女入室| 一本久久精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 欧美成人a在线观看| 91久久精品电影网| 麻豆国产av国片精品| av在线观看视频网站免费| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲美女视频黄频| 久久这里有精品视频免费| 国产私拍福利视频在线观看| 国产色婷婷99| 亚洲av一区综合| 成人欧美大片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 美女cb高潮喷水在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲在线观看片| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久久久久亚洲中文字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 中文在线观看免费www的网站| 久久久久久久久大av| 高清在线视频一区二区三区 | 女的被弄到高潮叫床怎么办| 色综合亚洲欧美另类图片| 老女人水多毛片| 91久久精品国产一区二区三区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 成人综合一区亚洲| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲色图av天堂| 深爱激情五月婷婷| 九九在线视频观看精品| 色视频www国产| 午夜福利在线在线| 久久久久久久久久久丰满| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 真实男女啪啪啪动态图| 在线观看av片永久免费下载| 1024手机看黄色片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 91狼人影院| 舔av片在线| 中文在线观看免费www的网站| 国产私拍福利视频在线观看| 国产精品一二三区在线看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 嫩草影院新地址| 伦精品一区二区三区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 成年av动漫网址| 2022亚洲国产成人精品| 成年av动漫网址| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产精品电影一区二区三区| 夜夜爽天天搞| 亚洲经典国产精华液单| 一级黄片播放器| av免费在线看不卡| 国产高清三级在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 日韩欧美 国产精品| 热99re8久久精品国产| 亚洲真实伦在线观看| 国产单亲对白刺激| 亚洲欧洲国产日韩| 国产高清三级在线| 有码 亚洲区| 亚洲在线自拍视频| 丰满乱子伦码专区| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美色视频一区免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 中文字幕制服av| 色综合站精品国产| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜爱爱视频在线播放| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲性久久影院| 欧美zozozo另类| 亚洲av中文av极速乱| 久久人妻av系列| 精品久久久久久久久av| 在线观看66精品国产| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产淫片久久久久久久久| 久久亚洲精品不卡| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产精品精品国产色婷婷| 国产成人精品久久久久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 色吧在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | av福利片在线观看| 99热6这里只有精品| 1000部很黄的大片| 国产单亲对白刺激| 色哟哟·www| 在线观看66精品国产| 亚洲国产色片| 99热网站在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久精品综合一区二区三区| 国产av麻豆久久久久久久| 最后的刺客免费高清国语| av在线观看视频网站免费| 亚洲美女搞黄在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美精品一区二区大全| 国产69精品久久久久777片| 亚洲精品粉嫩美女一区| 人体艺术视频欧美日本| 一本一本综合久久| 精品一区二区免费观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美性猛交黑人性爽|