涼粉草DNA條形碼通用序列的篩選及其混偽品分子鑒定

魏星任+葉清蓮+馬新業(yè)+龍潔怡+張嬌+嚴(yán)萍+詹若挺+陳蔚文

摘要：提取涼粉草基因組總DNA，使用通用引物擴(kuò)增核基因ITS1、ITS2序列和葉綠體psbA-trnH、rbcL、matK序列并進(jìn)行測序，使用CodonCode Aligner軟件對完整序列進(jìn)行拼接并對其進(jìn)行比對，使用MEGA 7.0鄰接法（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。結(jié)果表明，matK序列擴(kuò)增成功率低；ITS1序列存在單一變異位點(diǎn)且測序成功率低；ITS2、rbcL和psbA-trnH等3個(gè)序列無變異位點(diǎn)，序列擴(kuò)增成功率、測序成功率高，序列長度在233～671 bp，從系統(tǒng)聚類樹上得出ITS2序列可以將涼粉草與其他3種混偽品區(qū)分開，而rbcL和psbA-trnH序列在區(qū)分時(shí)存在一定的混淆。ITS2序列可以考慮作為鑒別涼粉草的優(yōu)選序列。

關(guān)鍵詞：涼粉草；DNA條形碼；分子鑒定；ITS2；混偽品

中圖分類號： R282.710.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0032-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2017-01-25

基金項(xiàng)目：廣東省高等院校學(xué)科與專業(yè)建設(shè)專項(xiàng)（編號：2013CXZDA011）；廣東省普通高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號：2016KYTD02）；廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號：201610572099）。

作者簡介：魏星任（1993—），女，廣東揭陽人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：524344346@qq.com。

通信作者：嚴(yán)萍，博士，副研究員，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：yanping@gzucm.edu.cn。

[ZK）]

涼粉草（Mesona chinensis）為唇形科（Labiatae）涼粉草屬（Mesona）植物，別稱仙人草、仙草、仙人凍、薪草，是一類重要的經(jīng)濟(jì)和藥用植物，全世界有8～10種，零星分布于印度東北部、東南亞及我國東南各省的廣大地區(qū)[1]。在我國，主要分布于福建、臺灣、浙江、廣東、廣西及云南等地。據(jù)《全國中草藥匯編》記載，仙草性味澀、甘、寒，具清暑解渴、涼血解暑及利尿之功效[2]，主治中暑，小兒酢皰、丹毒入腹、消渴、感冒、高血壓、黃疸、腎臟病、糖尿病和關(guān)節(jié)肌肉疼痛等。

長期以來，涼粉草以野生資源為主，不同地區(qū)的資源在長期進(jìn)化過程中形成了在外部形態(tài)特征甚至內(nèi)部的生理結(jié)構(gòu)上的極大差異。隨著用量的不斷提升，涼粉草的種質(zhì)資源問題得到了重視，分子標(biāo)記是資源鑒定與評價(jià)有的效方法之一。關(guān)杰敏等得到了一種適合涼粉草基因組DNA的提取方法，能提供高質(zhì)量的涼粉草總DNA[3]。李曉暉等表明，SCoT和ISSR等2種分子標(biāo)記均適用于涼粉草種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究[4-5]。DNA條形碼是一種特異性的分子鑒定技術(shù)，Chen等經(jīng)過大樣本量研究，證明DNA條形碼應(yīng)用于植物分子鑒定非常高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度[6-12]，2015版《中國藥典》第三部規(guī)定DNA條形碼植物類藥材鑒定以核糖體ITS2作為主體條形碼，并以psbA-trnH為輔進(jìn)行[13]。目前涼粉草的DNA條形碼方面研究也只涉及單一序列ITS2，本研究選取了廣東省、廣西壯族自治區(qū)、福建省、臺灣、江西省等地的涼粉草為樣本，基本涵蓋絕大部分涼粉草產(chǎn)地，并選用了核基因ITS1、ITS2序列和葉綠體基因rbcL、psbA-trnH和matK序列作為候選序列，旨在通過更多的涼粉草樣本來優(yōu)選出合適的候選片段作為DNA條形碼鑒定該植物的序列。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取涼粉草26份，涼粉草樣品試驗(yàn)號MB-01～MB-10采集自廣州中醫(yī)藥大學(xué)2號山體（藥王山），為各地移栽品種；MB-11～MB-26由廣東南嶺藥業(yè)股份有限公司提供（詳見表1）。試驗(yàn)標(biāo)本經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室講師林穎鑒定，憑證標(biāo)本保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥科學(xué)與工程研究中心。KM280868、FJ513094為Genbank上獲得的涼粉草登錄號?；靷纹窐颖拘蛄?7份，均在Genbank上下載，其材料信息見表2。涉及涼粉草常見的混偽物種：線紋香茶菜（Isodon lophanthoides Buch. -Ham. ex D. Don H. Hara）、溪黃草（Isodon serra Maxim. Hara）和筋骨草（Ajuga ciliate Bunge）。

1.2儀器與試劑

所用儀器有BS224S型電子分析天平（德國賽多利斯公司），MJ-Mini型PCR儀（BioRad），DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像儀（法國VL），微量紫外分光光度計(jì)（北京天根有限公司），Milipore-Q型純水儀（Millipore公司）。

試劑有DP321植物基因組DNA提取試劑盒、MD109 100 bp DNA ladder（北京天根有限公司）、DRR 100B Ex Taq（TaKaRa），ITS1、ITS2、rbcL、psbA-trnH引物（華大基因科技有限公司）。

1.3方法

1.3.1DNA提取將采集到的新鮮樣品用75%乙醇洗凈表面，置于烘箱中40 ℃烘干，稱取樣品30 mg加入液氮中充分碾磨。按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作并用微量紫外分光光度計(jì)測定提取的DNA濃度及純度。

1.3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，簡稱PCR）擴(kuò)增及測序本試驗(yàn)所用引物序列及PCR條件見表3。PCR體系包括1.0 μL上、下游引物，1.0 μL基因組DNA，12.5 μL Taq酶，用ddH2O補(bǔ)充到25 μL；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并送華大基因科技有限公司完成雙向測序。

1.3.3序列分析使用CodonCode Aligner V6.0.2對測序峰圖進(jìn)行校對拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)的序列，使用DNAMAN 8.0進(jìn)行多序列比對；使用MEGA 7.0對試驗(yàn)樣本所得基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，評價(jià)不同候選序列ITS2、rbcL和psbA-trnH對涼粉草的鑒定能力。endprint

2結(jié)果與分析

[HTK]2.1序列長度、葡萄糖含量和變異分析[HT]

ITS1、ITS2、psbA-trnH、rbcL序列電泳圖條帶清晰，無雜帶，擴(kuò)增成功率為96%，matK反復(fù)試驗(yàn)均擴(kuò)增成功率低（圖1）。ITS2、psbA-trnH、rbcL的測序成功率為100%，ITS1測序成功率為68%，遠(yuǎn)低于前三者的成功率，且ITS1存在2個(gè)變異位點(diǎn)，所以在本研究中ITS1、matK不作為推薦的優(yōu)選序列。

[FL（2K2]由表4可知，不同的3條候選序列在序列長度、GC含量方面有較明顯的差異。序列長度由高到低依次為rbcL、psbA-trnH、ITS2，GC含量從高到低依次為ITS2、rbcL、psbA-trnH。3條候選序列均無變異位點(diǎn)。

2.2不同候選序列對涼粉草及其混偽品的鑒定能力

采用NJ法構(gòu)建不同序列的系統(tǒng)聚類樹，利用Bootstrap法1 000次重復(fù)檢驗(yàn)各分支的支持率，NJ樹構(gòu)建結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，ITS2序列能將所有的樣品聚為兩大支，其中涼粉草單獨(dú)成一支，具有明顯的單系性，然后與筋骨草聚為一大支，同時(shí)線紋香茶菜及其變種與溪黃草組成另外一大支；rbcL序列將所有的樣品聚成兩大支，涼粉草與筋骨草成為一大支，然而不能與其他混偽品形成的另一大支區(qū)分開；psbA-trnH序列涼粉草單獨(dú)成支，然而無法與線紋香茶菜及其變種區(qū)分開。所以只有ITS2序列能夠?qū)龇鄄菖c其混偽品線紋香茶菜、溪黃草和筋骨草區(qū)分開，其他2個(gè)序列則無法完全區(qū)分。

3小結(jié)

本試驗(yàn)采用5條通用的候選DNA條形碼序列對26個(gè)不同產(chǎn)地涼粉草樣品及其混偽品進(jìn)行對比研究。matK序列是葉綠體DNA中進(jìn)化的比較快的序列，但是在涼粉草中很難成功擴(kuò)增；ITS1的測序效率較低只有68%且存在2個(gè)變異位點(diǎn)；psbA-trnH、RbcL序列不能完全把涼粉草與本研究所用到的混偽品區(qū)分開；只有ITS2序列有較高的擴(kuò)增效率和測序效率且能準(zhǔn)確鑒別涼粉草與其他3種混偽品。所以建議優(yōu)先選擇ITS2序列作為鑒別涼粉草的DNA條形碼的基因序列。

[FK（W20][TPWXR2.tif][FK）]

DNA的ITS序列，結(jié)果顯示ITS序列在ITS1區(qū)段的第355位和ITS2區(qū)段的第578位存在2個(gè)堿基的差異[14]，與本研究結(jié)果有所不同，可能是試驗(yàn)收集樣本不相同導(dǎo)致的。同時(shí)與師玉華等的結(jié)黃玉吉等通過克隆測序法測定了涼粉草不同品系核糖體論即ITS2序列能夠鑒別涼茶藥材涼粉草溪黃草、[JP3]斷血流和筋骨草[15]相符合，本研究相對于馬定乾等的研究的先進(jìn)之處在于對熱門通用序列進(jìn)行了篩選，[JP2]驗(yàn)證了候選序列對于涼粉草的適用性和鑒別能力，所以得出的結(jié)論更加客觀、全面。[JP]

本研究所涉及的混偽品數(shù)據(jù)全部來源于GenBank，且網(wǎng)上涼粉草混偽品相關(guān)數(shù)據(jù)較少，所以今后的研究中考慮增加混偽品試驗(yàn)樣本數(shù)量。本研究雖然具有一定的不足，但仍然對涼粉草的分子鑒定有參考意義。[HT][FL）]

[KH*4D]

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