新型香稻渝恢2103香味分子遺傳特性分析

王春萍張現(xiàn)偉白文欽蔣曉英吳 紅林 清 唐永群姚 雄張巫軍唐榮莉李經(jīng)勇,*雷開榮,*重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心逆境農(nóng)業(yè)研究重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 4039;重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院重慶再生稻研究中心,重慶 4060

新型香稻渝恢2103香味分子遺傳特性分析

王春萍1,**張現(xiàn)偉2,**白文欽1蔣曉英1吳 紅1林 清1唐永群2姚 雄2張巫軍2唐榮莉1李經(jīng)勇2,*雷開榮1,*
1重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心逆境農(nóng)業(yè)研究重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401329;2重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院重慶再生稻研究中心,重慶 402160

香味是優(yōu)良稻米品質(zhì)的重要衡量標(biāo)準(zhǔn)之一, 2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)是最主要的香味物質(zhì), 然而2AP生物合成機(jī)理至今仍未確鑿。本研究篩選了與2AP生物合成密切相關(guān)的甜菜堿脫氫酶2基因(Badh2)在30份水稻材料中的3種突變類型, 從中發(fā)現(xiàn)1份新的香稻材料渝恢2103, 該材料Badh2基因序列編碼區(qū)無(wú)突變, 遺傳分析顯示渝恢2103與badh2-E7突變型香稻宜香1B香味基因不等位, 與非香稻雜交F2香與非香分離比接近9∶7, 與香稻雜交F2香與非香分離比接近7∶9, 表明渝恢2103的香味受多基因控制。進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)比較了與2AP生物合成相關(guān)基因在日本晴、渝恢2103和宜香1B的表達(dá)情況, 結(jié)果顯示, Badh2基因在日本晴和渝恢2103中表達(dá)差異不大, 但在宜香1B中表達(dá)量異常高; 多數(shù)脯氨酸與谷氨酸代謝途徑相關(guān)基因在宜香1B中的表達(dá)水平顯著高于日本晴和渝恢2103; 推測(cè)宜香1B的2AP合成同時(shí)受Badh2基因以及脯氨酸與谷氨酸代謝途徑相關(guān)基因的影響; 渝恢2103香味形成可能與這些基因無(wú)必然聯(lián)系。渝恢2103特殊的遺傳特性可能為水稻香味形成機(jī)理研究提供新的突破點(diǎn)。

香稻; 2-乙酰-1-吡咯啉; 脯氨酸; 谷氨酸; Badh2; 遺傳特性

香米以其清香可口的特色深受消費(fèi)者喜愛(ài)和國(guó)內(nèi)外稻米市場(chǎng)的青睞, 也激勵(lì)著育種研究者不斷發(fā)掘香稻基因資源和培育新的香稻品種。目前大部分研究結(jié)果表明水稻香味是由單隱性基因控制, 位于第8染色體上的甜菜堿合成酶2基因(Badh2)突變導(dǎo)致功能丟失, 使得香味物質(zhì) 2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)合成前體物質(zhì)積累, 最終大量集聚2AP而形成水稻香味[1-4]。

目前, 對(duì)2AP生物合成途徑的研究已取得一些進(jìn)展, 但仍不夠確鑿。Romanczyk等[5]用15N標(biāo)記脯氨酸和谷氨酸, 用16C標(biāo)記葡萄糖, 結(jié)果在培養(yǎng)的蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)出的2AP中發(fā)現(xiàn)了15N和16C, 表明脯氨酸和谷氨酸可能是2AP合成的氮源, 葡萄糖則可能是2AP合成的碳源。但在16C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中還觀察到大量其他同位素離子峰, 表明有其他 C原子的摻入。Yoshihashi等[6]研究發(fā)現(xiàn)2AP的形成與脯氨酸含量相關(guān), 認(rèn)為L(zhǎng)-脯氨酸是2AP合成的主要前體物質(zhì),為吡咯啉環(huán)的形成提供氮源[7]。1-吡咯啉是 2AP合成的前體, 多數(shù)研究認(rèn)為 1-吡咯啉是通過(guò) γ-氨基丁醛(GABald)自發(fā)環(huán)化形成, GABald是脯氨酸代謝的中間物質(zhì), GABald量的多少受菜堿脫氫酶 2 (BADH2)活性影響, BADH2具有催化 γ-氨基丁醛(GABald)的功能, 在 Badh2基因發(fā)生突變的香稻品種中, BADH2功能缺失, 導(dǎo)致GABald的積累, 從而增加該物質(zhì)轉(zhuǎn)向2AP的生物合成[4,8]。也有研究發(fā)現(xiàn)1-吡咯啉是吡咯啉-5-羧酸脫羧形成, 提高吡咯啉-5-羧酸水平可增加2AP的積累, 吡咯啉-5-羧酸是谷氨酸代謝的中間產(chǎn)物, 受谷氨酸代謝相關(guān)酶類如吡咯啉-5-羧酸合成酶 (P5CS)活性影響[9]。關(guān)于2AP乙?；膩?lái)歷, 研究認(rèn)為丙酮醛能夠提供乙?；c 1-吡咯啉生成 2AP[10], 也有研究認(rèn)為丙酮醛能夠與吡咯啉-5-羧酸在室溫下直接生成2AP[9]?？傊? 2AP生物合成途徑十分復(fù)雜, 其具體生成過(guò)程及其與 Badh2基因的聯(lián)系還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

在香稻Badh2基因上游調(diào)控區(qū)域和外顯子區(qū)域已發(fā)現(xiàn)20余種突變[11], 其中頻率最高的是位于第7外顯子的8堿基缺失和3個(gè)SNP位點(diǎn)[1], 其次是位于第 2外顯子 7堿基的缺失[12]。Shi等[13]在香稻南海138的Badh2基因5′非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)3個(gè)堿基缺失,在啟動(dòng)子區(qū)域有 8個(gè)堿基的缺失, 并且發(fā)現(xiàn)badh2-E7型突變也存在啟動(dòng)子區(qū)域8個(gè)堿基的缺失,但不存在5′非編碼區(qū)3個(gè)堿基缺失。然而也有些研究發(fā)現(xiàn)有些水稻品種Badh2基因序列與非香稻相同,但仍具有香味。Fitgerald等[14]分析了313份來(lái)自世界各地的香稻材料Badh2基因第7外顯子突變情況,發(fā)現(xiàn)279份材料存在8堿基缺失, 15份材料不存在突變, 19份材料為雜合型, 因此推斷還有其他基因?qū)е?AP的合成。但其未對(duì)這 15份材料進(jìn)行進(jìn)一步的 Badh2基因序列分析和遺傳分析, 因此也不排除這15份材料包含之后發(fā)現(xiàn)的badh2-E2、badh2-E8等突變類型, 還有可能包含其他至今都未發(fā)現(xiàn)的基因類型。Amarawahi等[15]利用香稻Pusa1121與非香稻1342雜交建立重組自交系(RIL), 定位到3個(gè)分布在水稻第3、第4、第8染色體上的與香味相關(guān)的位點(diǎn), 并且發(fā)現(xiàn)所有濃香型和 82%具有中等香味或淡香型的RIL在Badh2基因第7外顯子處有8堿基缺失, 難以置信的是68.5%非香型的RIL也含有8堿基缺失, 因此, 他認(rèn)為水稻香味不僅受 Badh2基因 1個(gè)基因控制, 甚至 Badh2基因可能只是真正控制香味性狀基因的 1個(gè)標(biāo)記。隨后, 該研究團(tuán)隊(duì)又利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)結(jié)合前期的QTL定位結(jié)果在第3、第4、第8染色體上發(fā)現(xiàn)10個(gè)差異表達(dá)的基因, 其中第3染色上1個(gè)基因, 第4染色體8個(gè)基因, 第8染色體1個(gè) Badh2基因[16], 再次證明水稻香味由多基因控制。Cheng等[17]研究發(fā)現(xiàn)香稻Bamati 370和非香稻雜交 F2只有 15.6%的單株香味能達(dá)到親本 Bamati 370香味程度, 表明水稻香味為多基因控制, 通過(guò)基因定位他們?cè)谒镜?染色體上發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與香味相關(guān)的位點(diǎn)。因此, 水稻香味產(chǎn)生的原因還存在多種不同研究結(jié)果, 需要不斷尋找新的突破點(diǎn)來(lái)闡明。

本研究以30份水稻材料, 分析其在Badh2基因第2外顯子、第7外顯子和啟動(dòng)子區(qū)域的突變情況,重點(diǎn)圍繞其中的1份特殊香稻材料渝恢 2103, 分析其 Badh2基因序列特點(diǎn), 香味遺傳特性, 以及 2AP生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)特點(diǎn), 為水稻香味形成機(jī)理研究提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實(shí)驗(yàn)室保存和重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院重慶市再生稻研究中心提供的30份水稻材料, 即日本晴、渝恢2103、宜香1B、渝香糯1號(hào)、中香1號(hào)、559、560、561、十里香、2014特1、2014特2、2014特3、2014特 4、香軟稻、黃金稻、黑豐香糯、太香 2號(hào)、豐黑 2號(hào)、黑香糯、高產(chǎn)黑米、綠米、綠玉香、天龍香、海南萬(wàn)里香、千里香、紅米、黑香旱米、人參黑寶稻、超優(yōu)30和香粘。

1.2 香味鑒定

采用 KOH浸泡法鑒定葉片香味[18]。植株孕穗前期, 取植株葉片鮮重1 g左右, 剪成碎片放入小玻璃瓶中, 加入10 mL 1.7%的KOH溶液, 立即蓋緊瓶蓋, 在室溫下保持 10 min, 然后逐一打開瓶蓋迅速嗅香味有無(wú), 每份材料 3次重復(fù), 每次重復(fù)由不同實(shí)驗(yàn)人員完成。

采用咀嚼法鑒定米粒香味[19]。隨機(jī)選取每株一穗進(jìn)行鑒定, 如果首先連續(xù)5粒種子都有香味則認(rèn)為該植株所有種子都有香味; 否則要咀嚼16粒種子,如果16粒種子全不香則認(rèn)為該植株所有種子都沒(méi)有香味; 如果16粒種子中香與不香的米粒同時(shí)存在則認(rèn)為存在香味性狀分離。

1.3 Badh2基因突變位點(diǎn)檢測(cè)

根據(jù)Shi等[12]分別合成Badh2基因第2外顯子和第 7外顯子突變檢測(cè)引物 FMbadh2-E2A和FMbadh2-E7, 根據(jù)Shi等[13]合成Badh2基因啟動(dòng)子區(qū)域突變檢測(cè)引物STS。分別以30份水稻材料基因組DNA為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR體系為10 μL,含5 μL 2×Es Taq MasterMix (康為世紀(jì))、0.5 μL基因組DNA (100 ng μL–1)、上下游引物各0.5 μL (10 μmol L–1), ddH2O補(bǔ)足體積。PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s, 共30個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增后, 利用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.4 Badh2基因克隆及序列分析

主要按照Shi等[12]的方法合成Badh2基因克隆引物, 參照日本晴Badh2基因組序列(GenBank登錄號(hào)為 AP004463)設(shè)計(jì) Badh2基因啟動(dòng)子區(qū)域引物, Badh2PRM1-1-F: 5′-CATCGAGATAGGCAGGCACA A-3′, Badh2PRM1-1-R: 5′-GAACCGCCAAGATCAC TTGTCT-3′; Badh2PRM2-1-F: 5′-GGTTTCGAGTTT AGTCGAGA-3′, Badh2PRM2-1-R: 5′-GCCTACTGT ATCCTCCTCAT-3′。分別以非香水稻日本晴, 香型水稻渝恢2103、宜香1B和黑香糯基因組DNA為模板, 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, PCR體系為 20 μL, 含 10 μL 2×Es Taq MasterMix (康為世紀(jì))、1 μL基因組DNA (100 ng μL–1)、上下游引物各 1 μL (10 μmol L–1), ddH2O補(bǔ)足體積。PCR程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s、58～60℃退火30 s、72℃延伸2 min, 共30個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增后, PCR產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳, 分析得到目的條帶, 用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(OMEGA)純化。將純化產(chǎn)物鏈接pMD19-T載體(TaKaRa)并轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞(TRANCE), 篩選陽(yáng)性菌落送立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序。利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)、EditSeq和MegAlign軟件進(jìn)行基因序列分析。

1.5 香味遺傳特性分析

配制雜交組合渝恢2103(香)/宜香1B(香)、渝恢2103(香)/日本晴(非香)和渝恢 2103(香)/R838(非香),獲得F1種子, 用F1植株葉片鑒定香味。進(jìn)一步通過(guò)F2種子及葉片香味性狀確定香味分離比, 用 χ2進(jìn)行適合性檢驗(yàn)。

1.6 2AP生物合成相關(guān)基因表達(dá)分析

分別參照 Chen等[4]和Forlani等[20]的方法合成Badh2基因、內(nèi)參Actin基因和谷氨酸、脯氨酸代謝途徑相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物。用RNA提取試劑盒(艾德萊生物)分別提取日本晴、渝恢 2103和宜香1B莖段、葉片和揚(yáng)花后10 d幼穗RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bio-Rad)對(duì)RNA進(jìn)行去基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用Bio-Rad CFX96 Real-time System熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR, 反應(yīng)體系20 μL, 含iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) 10 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1.0 μL, ddH2O補(bǔ)足體積。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 香味性狀鑒定

利用 KOH浸泡法鑒定葉片和咀嚼法鑒定籽粒,發(fā)現(xiàn)有12份材料為香稻, 包括宜香1B、渝恢 2103、渝香糯1號(hào)、561、中香1號(hào)、2014特3、香軟稻、黃金稻、太香2號(hào)、豐黑2號(hào)、黑香糯和黑豐香糯,其余18份材料為非香稻。

2.2 Badh2基因突變位點(diǎn)檢測(cè)

在30份水稻材料中共檢測(cè)到2份材料為第2外顯子突變, 9份材料為第7外顯子突變, 這11份材料全部為香稻。香稻渝恢2103的Badh2基因在第2外顯子和第7外顯子未發(fā)生任何突變。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有21份材料在Badh2基因啟動(dòng)子區(qū)域存在8堿基插入, 其中包括渝恢2103在內(nèi)的10份香稻和11份非香稻材料, 日本晴、高產(chǎn)黑米和第 2外顯子發(fā)生突變的黑豐香糯和黑香糯 4份材料未發(fā)生突變, 另外5份材料未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶(表1和圖1)。

表1 30份水稻材料Badh2基因突變位點(diǎn)Table 1 Mutation sites of Badh2 gene in 30 rice varieties

圖1 30份水稻材料Badh2基因突變位點(diǎn)Fig. 1 Mutation sites of Badh2 gene in 30 rice varieties

2.3 Badh2基因克隆及序列分析

使用12對(duì)引物分別對(duì)渝恢2103、宜香1B和黑香糯的Badh2基因序列進(jìn)行分段克隆, 最后拼接,獲得該基因包括起始密碼子上游2500 bp在內(nèi)的約9300 bp全基因序列。通過(guò)與日本晴Badh2基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 3份材料與日本晴相似度可達(dá) 99%,宜香1B在第7外顯子處存在8堿基缺失和3個(gè)單堿基突變, 黑香糯在第2外顯子存在7堿基缺失。渝恢2103在編碼區(qū)沒(méi)有突變, 只在啟動(dòng)子區(qū)域與宜香1B都有8堿基插入, 黑香糯不存在這一突變,這與2.2中的結(jié)果一致。3份材料在第2內(nèi)含子都存在2個(gè)堿基缺失, 渝恢2103第4內(nèi)含子出現(xiàn)了10個(gè)堿基插入, 宜香 1B和黑香糯在該處出現(xiàn)了 8個(gè)堿基插入。

2.4 渝恢2103香味遺傳特性分析

渝恢2103/宜香1B、渝恢2103/R838 (非香)以及渝恢 2103/日本晴組合 F1單株都不香(表 2)。渝恢2103/宜香 1B組合 F2香與非香分離比接近 7∶9(χ2=0.203), 渝恢 2103/R838和渝恢 2103/日本晴兩個(gè)組合F2香與非香分離比接近9∶7 (χ2=3.80, 1.06)。

2.5 2AP生物合成相關(guān)基因表達(dá)分析

在 3份材料日本晴、渝恢 2103和宜香 1B中, Badh2基因在莖、葉和幼穗中的表達(dá)趨勢(shì)基本相同,即在宜香1B中的表達(dá)量顯著大于渝恢2103和日本晴, 尤其在宜香1B幼穗中表達(dá)量異常高, 渝恢2103和日本晴差異不大(圖3)。谷氨酸和脯氨酸代謝相關(guān)基因P5CS1、P5CS2、P5CR、ProDH和P5CDH在幾份材料莖、葉和幼穗中的表達(dá)趨勢(shì)基本相同, 即在宜香1B中表達(dá)量最高, 在日本晴中其次, 在渝恢2103中最低。

圖2 Badh2基因主要突變位點(diǎn)分布Fig. 2 Distribution of main mutation sites of Badh2 gene

表2 渝恢2103雜交后代香味分離情況Table 2 Segregation of fragrance in hybrid offspring of Yuhui 2103

3 討論

近年來(lái), 大多數(shù)水稻香味研究是建立在承認(rèn)Badh2單基因控制香味的思維模式上, 導(dǎo)致尋找香味新品種時(shí)也多是圍繞該基因的突變進(jìn)行的, 然而進(jìn)一步對(duì)突變位點(diǎn)與基因功能之間聯(lián)系的研究很少。在目前發(fā)現(xiàn)的 Badh2基因突變類型中, 除了最普遍的第2外顯子和第7外顯子突變外, Shi等[13]發(fā)現(xiàn)在香稻南海138以及badh2-E7型突變的Badh2基因啟動(dòng)子區(qū)域有 8個(gè)堿基的插入, 本研究發(fā)現(xiàn)除了badh2-E7型突變外, 有包括渝恢2103在內(nèi)的10份香稻和另外 11份非香稻材料都能檢測(cè)到這種突變,說(shuō)明該啟動(dòng)子區(qū)域的突變與水稻香味沒(méi)有必然的聯(lián)系。另外, 還有5份材料不能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶, 推測(cè)在該區(qū)域還有其他突變位點(diǎn)。因此, 在 Badh2基因中的一些突變盡管位于基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域甚至是編碼區(qū)域, 但可能只是其遺傳進(jìn)化中的一個(gè)簡(jiǎn)單事件,在香味的形成中并未起到太大作用。目前針對(duì)Badh2基因突變開發(fā)的一些分子標(biāo)記, 在實(shí)際輔助育種中的有效性還有待于證實(shí)。Badh2基因內(nèi)含子區(qū)域突變與香味形成的相關(guān)性還未見報(bào)道, 本研究 3份香稻材料Badh2基因序列第2和第4內(nèi)含子出現(xiàn)了突變, 在 GenBank公布的蘇御糯(EU770320.1)和武香粳(EU770321.1) 2份香稻的Badh2基因序列第2內(nèi)含子也出現(xiàn)了相同突變, 在第 4內(nèi)含子分別出現(xiàn)了10堿基和6堿基插入。這兩處突變是否存在于所有香稻的 Badh2基因序列中, 其與水稻香味形成是否存在相關(guān)性, 有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。繼續(xù)開展對(duì)已有突變類型的深入研究和發(fā)掘香味形成相關(guān)新基因?qū)?duì)香味形成的機(jī)制闡明具有推動(dòng)作用。

圖3 2AP生物合成相關(guān)基因表達(dá)情況Fig. 3 Expression profile of genes involved in 2AP biosynthesis

非香稻中并不是不合成 2AP, 而是合成的量少[21-22], 因此, 我們可以假設(shè), 當(dāng)與 2AP合成相關(guān)的不同遺傳位點(diǎn)聚集在一起相互作用的時(shí)候就導(dǎo)致不同量2AP生成, 從而形成不同程度香味的水稻材料, 但由于目前對(duì)香味程度鑒定技術(shù)方法的不成熟,絕大多數(shù)現(xiàn)有的研究報(bào)道都只能對(duì)香味的有無(wú)進(jìn)行判斷。位于第8染色體上的Badh2基因是一個(gè)比較重要或者比較普遍存在的控制水稻香味的基因, 因?yàn)榍叭说亩ㄎ谎芯慷及l(fā)現(xiàn)了這個(gè)位點(diǎn)[3,15,17,21,23]。本研究發(fā)現(xiàn)渝恢 2103與badh2-E7突變型香稻宜香1B雜交 F1為非香, 說(shuō)明渝恢 2103香味基因位點(diǎn)與badh2-E7突變型不等位, 證明了其他控制香味的基因位點(diǎn)的存在。渝恢2103與非香稻日本晴和 R838雜交 F2香與非香都基本呈 9∶7分離, 與香稻宜香1B雜交 F2香與非香分離比接近 7∶9, 表明當(dāng)有了宜香1B的遺傳物質(zhì)摻入后, 其遺傳后代具有香味的群體反而變小了, 證明存在多基因間的互作, 這其中包括結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子。

Chen等[4]比較了Badh2基因在香稻與非香稻中的表達(dá)差異, 研究結(jié)果表明香稻中 Badh2基因表達(dá)量與非香稻中差異不大, Badh2基因突變導(dǎo)致其翻譯水平降低, 并不影響轉(zhuǎn)錄水平。本研究發(fā)現(xiàn)Badh2基因在宜香 1B中的表達(dá)水平卻顯著高于非香型日本晴和渝恢 2103, 尤其在幼穗中表達(dá)量異常高。這一結(jié)果與前人的研究存在差異, 可能有2個(gè)原因: (1)不同品種間遺傳背景存在較大差異, 同一基因在不同材料中的本底表達(dá)本身就存在較大差異。(2)是植物的一種生理調(diào)節(jié), 宜香1B的Badh2基因第7外顯子存在8堿基的缺失, 導(dǎo)致有功能的BADH2蛋白質(zhì)含量降低, 于是增加 Badh2基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)以調(diào)節(jié)之, 渝恢2103與日本晴間的差異不大, 也暗示渝恢2103香味的形成與Badh2基因沒(méi)有直接聯(lián)系。

Huang等[9]研究香稻中較高的 2AP含量與香稻中較高的吡咯啉-5-羧酸水平有關(guān), 而后者與吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因表達(dá)水平的上調(diào)有關(guān), 因此推測(cè) P5CS催化谷氨酸生成吡咯啉-5-羧酸, 吡咯啉-5羧酸降解成 1-吡咯啉后與丙酮醛作用生成2AP。其實(shí), 谷氨酸生成吡咯啉-5-羧酸的過(guò)程也是合成脯氨酸的一個(gè)關(guān)鍵步驟, 吡咯啉-5-羧酸在吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)的作用下就生成脯氨酸, 脯氨酸又能在脯氨酸脫氫酶(ProDH)催化下生成吡咯啉-5-羧酸, 吡咯啉-5-羧酸在吡咯啉-5-羧酸脫氫酶(P5CDH)作用下生成谷氨酸。因此, 脯氨酸與谷氨酸能夠通過(guò)吡咯啉-5-羧酸以及幾種關(guān)鍵酶建立起一個(gè)代謝循環(huán)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)宜香 1B中這幾個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量整體趨勢(shì)顯著高于日本晴和渝恢2103。因此, 我們推測(cè), 在宜香1B中有兩條途徑限制2AP的合成, 一條是脯氨酸代謝成GABald后生成1-吡咯啉的過(guò)程, 受BADH2蛋白限制, 另一條是谷氨酸或脯氨酸代謝生成吡咯啉-5-羧酸, 后者又生成 1-吡咯啉的過(guò)程, 受脯氨酸和谷氨酸代謝循環(huán)中的幾種關(guān)鍵酶影響, 渝恢2103香味形成可能與這些蛋白酶無(wú)必然聯(lián)系。然而, 這種不同材料間的比較受遺傳背景差異等因素限制, 結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究團(tuán)隊(duì)正在構(gòu)建渝恢2103等材料雜交后代的重組自交系和近等位基因系, 從而消除遺傳背景的差異, 為進(jìn)一步揭示其香味分子遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

渝恢2103是一份新的香稻材料, 該材料Badh2基因序列編碼區(qū)無(wú)突變, 與badh2-E7突變型香稻宜香 1B香味基因不等位, 與非香稻雜交 F2香與非香分離比接近9∶7, 與香稻雜交F2香與非香分離比接近 7∶9, 表明渝恢 2103的香味受多基因控制。Badh2基因在日本晴和渝恢 2103中表達(dá)差異不大,但在宜香1B中表達(dá)量異常高; 多數(shù)脯氨酸與谷氨酸代謝途徑相關(guān)基因(P5CS1、P5CS2、P5CR、P5DH、ProDH)在宜香 1B中的表達(dá)水平顯著高于日本晴和渝恢2103; 推測(cè)宜香1B的2AP合成同時(shí)受Badh2基因以及脯氨酸與谷氨酸代謝途徑相關(guān)的基因影響,渝恢2103香味形成可能與這些基因無(wú)必然聯(lián)系。渝恢 2103特殊的遺傳特性可能為水稻香味形成機(jī)制研究提供新的突破點(diǎn)。

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Molecular Genetic Characteristics of Fragrance in a New Fragrant Rice Variety Yuhui 2103

WANG Chun-Ping1,**, ZHANG Xian-Wei2,**, BAI Wen-Qin1, JIANG Xiao-Ying1, WU Hong1, LIN Qing1, TANG Yong-Qun2, YAO Xiong2, ZHANG Wu-Jun2, TANG Rong-Li1, LI Jing-Yong2,*, and LEI Kai-Rong1,*
1Chongqing Key Laboratory of Adversity Agriculture, Biotechnology Research Center, Chongqing Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 401329, China;2Chongqing Ratooning Rice Research Center, Chongqing Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 402160, China

A major component 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) in fragrance is one of the important indices of high-quality rice, however, the biosynthetic pathway of 2AP has not been demonstrated clearly. The betaine aldehyde dehydrogenase 2 (BADH2) is considered to be closely related to 2AP biosynthesis. In this study, three mutations in Badh2 gene were screened from thirty rice varieties and a new fragrant rice variety Yuhui 2103 was discovered. The new variety has no mutation in the coding region of Badh2 gene and the Badh2 allele of Yuhui 2103 can complement the defect of the badh2-E7 allele in Yixiang 1B. From crosses between Yuhui 2103 and non-fragrant varieties the segregating ratios of F2fragrant to non-fragrant individuals were 9:7, while from crosses between Yuhui 2103 and fragrant varieties the segregating ratios of F2fragrant to non-fragrant individuals were 7:9, indicating that fragrance of Yuhui 2103 is not controlled by only one gene. Furthermore, expression patterns of genes involved in 2AP biosynthesis were examined by the quantitative real-time PCR (qRT-PCR) in Nipponbare, Yuhui 2103, and Yixiang 1B. There was no significant difference in transcription level of Badh2 in Nipponbare and Yuhui 2103, however, the transcription levelof Badh2 in Yixiang 1B was unexpectedly high. The expression levels of most of the genes involved in proline and glutamatic acid metabolism were significantly higher in Yixiang 1B than that in Nipponbare and Yuhui 2103. It is proposed that 2AP biosynthesis in Yixiang 1B is both influenced by Badh2 and the genes involved in proline and glutamatic acid metabolism, however, there is no necessary relationship between these genes and the fragrance of Yuhui 2103. The novel genetic characters of Yuhui 2103 may bring new breakthrough to the study of fragrance formation mechanism in rice.

Fragrant rice; 2-Acetyl-1-pyrroline; Proline; Glutamatic acid; Badh2; Genetic characteristics

(

): 2016-12-05; Accepted(接受日期): 2017-04-19; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-05-23.

10.3724/SP.J.1006.2017.01499

本研究由重慶市農(nóng)發(fā)良種創(chuàng)新暨重大科研推廣項(xiàng)目(NKY2016AA003), 重慶市農(nóng)發(fā)基礎(chǔ)科研項(xiàng)目(NKY2016AC024), 重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2016jcyjA0091)和重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2014cstc-jbky-00549)資助。

This study was supported by Chongqing Agriculture Seed Innovation and Major Research Extension Project (NKY2016AA003), Chongqing Agriculture Basic Research Project (NKY2016AC024), Chongqing Basic and Frontier Research Program (cstc2016jcyjA0091), and Chongqing Basic Research Fund (2014cstc-jbky-00549).

*通訊作者(Corresponding authors): 李經(jīng)勇, E-mail: ljy@cqagri.gov.cn; 雷開榮, E-mail: leikairong@126.com

**同等貢獻(xiàn) (Contributed equally to this work)

聯(lián)系方式: 王春萍, E-mail: wcp49930000@sina.com, Tel: 023-65717006; 張現(xiàn)偉, E-mail: ycty2006@126.com, Tel: 023-49847001

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170523.1856.008.html