水稻著絲粒特異組蛋白CENH3抗體的制備與應(yīng)用

薛超 張融 郭瑞 劉帥 劉曉宇 沈明晨 鄧世峰 龔志云

(揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；*通訊聯(lián)系人，E-mail: zygong@yzu.edu.cn)

水稻著絲粒特異組蛋白CENH3抗體的制備與應(yīng)用

薛超 張融 郭瑞 劉帥 劉曉宇 沈明晨 鄧世峰 龔志云*

(揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；*通訊聯(lián)系人，E-mail: zygong@yzu.edu.cn)

【目的】著絲粒是真核生物染色體的基本功能元件之一，其功能是在細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)期精確地調(diào)控染色體配對(duì)和分離并維持染色體的穩(wěn)定。著絲粒結(jié)構(gòu)是由DNA和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體。著絲粒特異組蛋白(centromere-specific histone H3, CENH3)是功能著絲粒是否具有活性的最基本特征。所以制備CENH3的相關(guān)抗體是進(jìn)行著絲粒結(jié)構(gòu)與功能研究的前提條件之一?！痉椒ā客ㄟ^(guò)設(shè)計(jì)短肽進(jìn)行兔免疫實(shí)驗(yàn)，制備了水稻著絲粒特異組蛋白CENH3兔源抗體，利用ELISA和蛋白免疫熒光(immunofluorescence, IF)等檢測(cè)方法對(duì)抗體有效性進(jìn)行了鑒定。【結(jié)果】ELISA檢測(cè)顯示制備的CENH3抗體有效稀釋度為1: 40萬(wàn)，并且蛋白免疫熒光信號(hào)在水稻體細(xì)胞每條染色體的著絲粒區(qū)域均能檢測(cè)到。同時(shí)，該抗體也可以應(yīng)用于玉米等其他物種。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)獲得與CENH3相結(jié)合的DNA分子，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和FISH定位分析，結(jié)果顯示相應(yīng)的ChIP-DNA位于水稻功能著絲粒區(qū)域?！窘Y(jié)論】本研究制備的水稻CENH3兔源抗體能滿足著絲粒研究中相關(guān)實(shí)驗(yàn)的要求，可進(jìn)一步應(yīng)用于著絲粒的結(jié)構(gòu)與功能研究。

水稻；著絲粒特異組蛋白；染色質(zhì)免疫沉淀；蛋白免疫熒光

著絲粒是真核生物染色體中重要的結(jié)構(gòu)與功能元件, 是由DNA和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體, 是真核生物有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中染色體正常分離和傳遞所必需的染色體區(qū)域[1]。每條染色體必須擁有正常的功能著絲粒, 以維持物種染色體組成的穩(wěn)定性。目前, 已在擬南芥、水稻、玉米等植物的著絲粒進(jìn)行了較深入的分子生物學(xué)研究,都表明了著絲粒的功能非常保守, 但真核生物各物種的著絲粒DNA序列卻是高度變異的[2-4]。著絲粒DNA序列進(jìn)化速率極高, 在不同物種中, 組成著絲粒的DNA序列是沒(méi)有同源性的[5]。除芽殖酵母的著絲粒以外[6-7], 大多數(shù)生物的著絲粒均由高度重復(fù)的DNA序列構(gòu)成, 并且在這些重復(fù)序列會(huì)間或插入一些逆轉(zhuǎn)座子成分, 一起組成著絲粒特異DNA序列[8-12]。

相比之下, 著絲粒區(qū)域另外一個(gè)重要組成成分——著絲粒特異蛋白在真核生物中則相對(duì)保守。其中, 著絲粒特異組蛋白H3(centromere-specific histone H3, CENH3)是較早發(fā)現(xiàn)的一種重要蛋白,存在于真核生物活性著絲粒的核小體中, 是著絲粒形成的早期標(biāo)志[13-15]。第一個(gè)鑒定出的CENH3是人類活性著絲粒上的CENP-A蛋白[16]。CENH3是功能著絲粒染色質(zhì)最基本的特征, 與CENH3相連著絲粒染色質(zhì)只包含一小部分的衛(wèi)星DNA[17]。比如, 在栽培稻第8染色體的著絲粒中,與CENH3結(jié)合的衛(wèi)星DNA(CentO)約為750 kb,即其功能著絲粒的大小約為750 kb。CENH3在著絲粒染色質(zhì)的識(shí)別和保持中起關(guān)鍵作用[4], 決定動(dòng)粒組裝的位置和著絲粒的活性, 而且僅存在有活性的著絲粒中[18-23]。研究表明, 在果蠅和老鼠中, 當(dāng)CENH3被破壞或者缺失時(shí), 染色體不能正常傳遞[24-25]。在植物中，不同染色體著絲粒區(qū)域的DNA序列雖然差異很大，但是與CENH3結(jié)合的區(qū)域大小是一致的。如水稻中，通過(guò)CENH3的蛋白免疫熒光檢測(cè)，12條染色體著絲粒區(qū)域的CENH3信號(hào)強(qiáng)度是一致的[26]。此外，在擬南芥、玉米和甘蔗等植物中也鑒定出CENH3，幾乎存在于整個(gè)細(xì)胞周期中[15,27-28]。雖然著絲粒的功能很保守，但不同于H3的保守性，CENH3的快速進(jìn)化導(dǎo)致不同物種之間具有一定的特異性。因此,對(duì)CENH3進(jìn)行研究具有重要的意義。

真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在。因此, 研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互關(guān)系是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法之一, 其基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物, 并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體, 特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段, 通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè), 從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息[29-33]。通過(guò)用CENH3抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn), 可以確定所檢測(cè)的DNA序列是否屬于著絲粒的功能DNA元件, 同時(shí)對(duì)于CENH3抗體發(fā)生免疫沉淀的染色質(zhì)進(jìn)行克隆與分析, 可獲得功能著絲粒DNA序列[34]。ChIP實(shí)驗(yàn)表明, 擬南芥、玉米、水稻和甘蔗等植物通過(guò)衛(wèi)星DNA和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子元件能與CENH3發(fā)生相互作用, 說(shuō)明衛(wèi)星DNA和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子元件CR(centromere- specific retrotransposon)是這些物種著絲粒的功能組成成分[35]。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一, 同時(shí)也是單子葉植物的模式生物。近年來(lái)隨著水稻全基因組測(cè)序的完成, 對(duì)水稻各染色體組中不同染色體著絲粒的組成也進(jìn)行了深入分析。 其中, 栽培稻的著絲粒由串聯(lián)重復(fù)序列組成。 重復(fù)單元為155 bp的CentO。目前, 定位分析水稻著絲粒的方法除了對(duì)CentO的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)分析外, 還可以利用CENH3抗體進(jìn)行蛋白免疫分析。通過(guò)與水稻CENH3結(jié)合的蛋白免疫反應(yīng)研究表明, 水稻每一著絲粒結(jié)合的CENH3是十分相近的, 說(shuō)明不同染色體著絲粒功能DNA結(jié)合區(qū)域是特定的[26]。目前水稻CENH3抗體商品化產(chǎn)品很少，即使有也由于其特定的使用范圍，價(jià)格比較昂貴，所以相關(guān)研究中的大多數(shù)抗體由國(guó)外實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，但一般情況下獲得的途徑比較麻煩，因此制備CENH3抗體對(duì)進(jìn)一步開(kāi)展水稻或其他物種著絲粒的相關(guān)研究具有重要意義。

本研究對(duì)水稻著絲粒特異組蛋白CENH3抗體進(jìn)行制備, 并利用ELISA方法對(duì)抗體的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定, 通過(guò)蛋白免疫熒光進(jìn)一步驗(yàn)證該抗體的有效性。利用ChIP技術(shù)分析CENH3抗體, 對(duì)沉淀下來(lái)的DNA進(jìn)行PCR和FISH分析, 以明確該抗體應(yīng)用于水稻著絲粒研究的可能性, 并且對(duì)該抗體是否能應(yīng)用于其他物種進(jìn)行了鑒定，為進(jìn)一步利用和推廣該抗體開(kāi)展著絲粒相關(guān)研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料包括粳稻品種日本晴(Oryza sativa japonica, Nipponbare)、普通玉米(Zea mays)、小麥(Triticum aestivum)和大麥(Hordeum vulgare)種子。

1.2 水稻CENH3抗體的制備

本研究中通過(guò)人工設(shè)計(jì)合成CENH3的相關(guān)多肽, 對(duì)兔子進(jìn)行7次免疫后, 取兔子全血進(jìn)行純化。得到的抗體通過(guò)ELISA方法檢測(cè)效價(jià)?？贵w的效價(jià)為大于NC值2倍且大于0.25時(shí)的OD450值, 當(dāng)效價(jià)大于2時(shí), 我們認(rèn)為抗體是呈陽(yáng)性的。ELISA方法檢測(cè)具體步驟如下:

取純化的CENH3蛋白以濃度為1 μg/mL包被酶標(biāo)板, 每孔200 μg, 蓋上蓋子放入37℃溫箱溫育2 h。然后取出包被和封閉好的酶標(biāo)板, 將封閉液甩入水池, 用自來(lái)水沖洗2次, 在毛巾上拍干6次。選用HIS抗體(用牛奶稀釋, 1 mg/mL HIS抗體與牛奶的體積比為1∶8000)作為陽(yáng)性對(duì)照, 陰性對(duì)照為5%牛奶,并進(jìn)行稀釋(稀釋度分別為3125, 6250, 1.25萬(wàn), 2.5萬(wàn), 5萬(wàn), 10萬(wàn), 20萬(wàn), 40萬(wàn), 80萬(wàn)), 每孔100 μg, 蓋上蓋子放入37℃溫箱溫育1 h后, 取出酶標(biāo)板, 將板內(nèi)的一抗甩入水池, 自來(lái)水沖洗8遍, 拍干。將稀釋好的二抗以每孔100 μg的量依次加入酶標(biāo)板孔中, 蓋上蓋子放入37℃溫箱溫育45 min。從溫箱取出二抗溫育好的酶標(biāo)板, 甩去二抗, 用自來(lái)水沖洗10次, 在吸水毛巾上拍干。將準(zhǔn)備好的顯色液按每孔100 μg的量依次加入酶標(biāo)板孔中, 蓋上蓋子放入溫箱，15 min后從溫箱取出酶標(biāo)板, 將2 mol/L硫酸以每孔50 μg的量依次加入酶標(biāo)板孔中終止反應(yīng), 讀取吸光值。

1.3 蛋白免疫熒光檢測(cè)

根尖染色體制備: 采集新鮮根尖, 用4%多聚甲醛(w/v)室溫固定30～40 min, 然后用1×磷酸鹽緩沖液(8.0 g NaCl, 0.2 g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO4, 0.2 g KCl, 雙蒸水定容至1 L，調(diào)pH至7.4)清洗3次, 并保存在1×磷酸鹽緩沖液中, 于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩牧姿猁}緩沖液中取出準(zhǔn)備好的根尖材料, 取1 mm左右根尖于載玻片上, 加1滴磷酸鹽緩沖液, 加蓋玻片壓片, 壓好的載玻片迅速放于液氮中, 冷凍1～2 min, 用刀片迅速揭去蓋玻片, 晾干。

蛋白免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測(cè):向染色體制備好的載玻片上滴加30 μL含有R(兔源)-CENH3抗體的1×TNB溶液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.5; 0.15 mol/L NaCl; 0.5%阻斷劑), 蓋上蓋玻片,放入濕盒內(nèi)于37℃下保溫4 h以上; 取出后用1×磷酸緩沖液洗片3次, 每次5 min, 加50 μL含有anti-Rabbit-488抗體(Invitrogen)的1×TNB溶液, 放入濕盒內(nèi)于37℃避光保溫1 h; 1×磷酸鹽緩沖液洗片3次, 每次5 min, 晾干后, 加10 μL含有DAPI的抗褪色劑(Vector Laboratories, Inc.), 蓋上蓋玻片, 在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 染色質(zhì)免疫沉淀

1.4.1 細(xì)胞核的提取

染色體免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)參照Nagaki等的實(shí)驗(yàn)方法[35]并有所優(yōu)化。取8～10 d的日本晴幼苗葉片在液氮中研磨成粉狀, 加等體積的抽提緩沖液M1(4 mL 0.1 mol/L磷酸鉀, pH 7.0, 4 mL 1 mol/L NaCl, 31.25 μL β-巰基乙醇, 4.74 mL己二醇, 加ddH2O至40 mL)后放置在冰上, 于搖床上緩慢搖5 min。用滅菌后的Miracloth(EMD Chemicals, Inc.)過(guò)濾, 濾液在2410 r/min、4℃下離心10 min，去上清。加10 mL抽提緩沖液M2(3 mL 0.1 mol/L磷酸鉀, pH 7.0, 3 mL 1 mol/L NaCl, 300 μL 1 mol/L氯化鎂, 23.43 μL β-巰基乙醇, 3.54 mL己二醇, 130 μL Triton X-100, 加ddH2O至30 mL)混勻, 2410 r/min、4℃下離心10 min，去上清, 反復(fù)操作3次, 如沉淀中有雜質(zhì), 再重復(fù)上述操作。

1.4.2 細(xì)胞破碎

先加5 mL MNB緩沖液(2 mL 50%蔗糖, 0.5 mL 1 mol/L Tris-HCl, pH7.5, 40 μL 1 mol/L MgCl2, 10 μL 1 mol/L CaCl2, 加ddH2O至10 mL)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行清洗, 于2410 r/min、4℃下離心10 min, 去上清。再加4 mL MNB緩沖液混勻, 分裝成3管,每管1200 μL, 剩下的作為input, 在分裝的3管中分別加1.5 U的MNase(Sigma)對(duì)DNA片段進(jìn)行切割, 于37℃水浴鍋中水浴10 min, 每2 min搖1次。加15 μL EDTA終止反應(yīng)。于13 000 r/min、4℃下離心10 min，取上清, 用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)切割結(jié)果。切割后的DNA片段大小約147 kb。1.4.3 染色體免疫共沉淀

加入特異性抗體CENH3及溫育緩沖液[1 mL 1 mol/L NaCl, 400 μL 1 mol/L Tris-HCl, pH 7.5, 200 μL 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0, 40 μL 0.1 mol/L PMSF, 200 μL蛋白酶抑制劑混合物(Complete Mini), 加ddH2O至20 mL], 密封、8℃下，上下顛倒孵育過(guò)夜, 然后再用Protein A beads(GE Healthcare)密封放置在8℃上下顛倒孵育2 h。通過(guò)不同濃度的鹽溶液洗去與beads結(jié)合的非特異性染色質(zhì), 加400 μL 42℃預(yù)熱的洗提緩沖液(500 μL 1 mol/L NaCl, 200 μL 1 mol/L Tris-HCl, pH 7.5, 100 μL 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0, 500 μL 20% SDS, 加ddH2O補(bǔ)足至10 mL), 于65℃水浴鍋水浴15 min, 每5 min搖1次, 于13 000 r/min、室溫下離心5 min，取上清, 重復(fù)上次操作, 收集合并兩次上清, 然后收集并純化沉淀下來(lái)的ChIP-DNA。

1.4.4 ChIP-DNA的引物設(shè)計(jì)與PCR檢測(cè)

設(shè)計(jì)的引物序列: CentO上游引物5′-TGC GATGTTTTCTACTGGAATC-3′; CentO下游引物5′-AAATCATGTTTTGGCTCTTTTT-3′。

以ChIP-DNA作為模板, 使用20 μL體系(Sangon Biotech)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)體系為: 1 μL ChIP-DNA模板, 2 μL 10×緩沖液(含Mg2+), 1.6 μL dNTPs(2.5 mmol/L), 上下游引物各2.5 μL, 0.2 μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL), 加超純水補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后取10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳, 凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果, 并拍照保存。

1.5 熒光原位雜交檢測(cè)

1.5.1 根尖固定

取新鮮根尖置于2 mmol/L的8-羥基喹啉中,在20℃下處理2 h。用卡諾固定液(v甲醇∶v冰醋酸=3∶1)清洗3次后再用固定液室溫固定24 h, 然后置于－20℃下備用。從固定液中取出固定好的根尖,用蒸餾水清洗3次。切取2 mm左右的白色根尖部位置于酶解液(2%纖維素酶與1%果膠酶), 37℃下酶解40 min。酶解完全的根尖經(jīng)固定液清洗2次后, 用固定液再次固定5 min以上, 可置于－20℃下冷卻待用。

1.5.2 染色體制備

將充分冰凍的根尖取出, 置于一張載玻片上,滴加適量固定液于根尖上。用鑷子迅速敲碎根尖,再在載玻片上滴加少量固定液, 在酒精燈上點(diǎn)燃,使其充分燃燒, 斜置玻片晾干待用。

1.5.3 探針標(biāo)記

把1 μg ChIP-DNA溶于16 μL雙蒸水中。加入4 μL DIG-Nick-Translation Mix (Roche)混勻,離心。在15℃下反應(yīng)90 min。停止反應(yīng)后, 加入1 μL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)終止反應(yīng)。標(biāo)記的探針－20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 FISH檢測(cè)

在制備好的載玻片上加入70%甲酰胺50 μL,蓋上蓋玻片。將玻片置于85℃的雜交爐中100 s。取出置于70%的冰酒精中, 脫色搖床5 min, 然后分別置于90%、100%酒精中脫色搖床各2 min, 取出晾干。配置雜交液(含ChIP-DNA探針)置于沸水中水浴5 min, 然后置于冰中5 min以上。每玻片滴加20 μL雜交液, 置于雜交盒中, 放入37℃恒溫箱過(guò)夜處理。取出后用1×磷酸緩沖液脫色搖床3次, 每次5 min。FISH信號(hào)通過(guò)抗地高辛抗體偶聯(lián)羅丹明偶聯(lián)物(anti-digoxigenin-Rhodamine)檢測(cè), 染色體用DAPI反染。Olympus BX60鏡檢中獲得清晰圖像后, 以氣冷式數(shù)碼相機(jī)(CCD) (Olympus, DP80)攝像。

2 結(jié)果與分析

2.1 CENH3抗體的多肽合成與效價(jià)分析

根據(jù)NCBI的蛋白序列庫(kù)得到CENH3的序列如下:

N′-MARTKHPAVRKSKAEPKKKLQFERSP RPSKAQRAGGGTGTSATTRSAAGTSASGTPR QQTKQRKPHRFRPGTVALREIRKFQKTTELLIP FAPFSRLVREITDFYSKDVSRWTLEALLALQE AAEYHLVDIFEVSNLCAIHAKRVTIMQKDMQ LARRIGGRRPW-C′。

設(shè)計(jì)近氨基端的14個(gè)氨基酸序列(AEPKKK LQFERSPR)進(jìn)行多肽人工合成, 合成成功后利用該多肽進(jìn)行兔免疫實(shí)驗(yàn), 進(jìn)行抗體制備。7次免疫后提取兔血清, 進(jìn)行抗體效價(jià)的ELISA。由于HIS抗體分子量較小并且容易分離和純化, 選其作為系統(tǒng)操作的陽(yáng)性對(duì)照, 效價(jià)（即OD450值）為2.758；陰性對(duì)照為5%牛奶, 效價(jià)為0.075。血清抗體稀釋度為3125, 6250, 1.25萬(wàn), 2.5萬(wàn), 5萬(wàn), 10萬(wàn), 20萬(wàn), 40萬(wàn), 80萬(wàn)時(shí), 效價(jià)分別為2.491, 2.671, 2.758, 2.665, 2.652, 2.685, 2.457, 2.034, 1.084。可見(jiàn)，當(dāng)血清抗體稀釋度為1∶80萬(wàn)時(shí), OD450值小于2, 該濃度下的抗體呈陰性, 抗體靈敏度較低; 在稀釋度為1∶40萬(wàn)以內(nèi)的效價(jià)都大于2, 抗體靈敏性較好。因此制備的血清抗體其有效的稀釋度要控制在1∶40萬(wàn)以內(nèi)。

2.2 CENH3蛋白免疫熒光分析

蛋白免疫熒光分析是檢測(cè)著絲粒相關(guān)蛋白抗體是否有效的主要手段之一。通過(guò)觀察信號(hào)在染色體上的位置和強(qiáng)弱來(lái)判斷抗體的使用價(jià)值。

我們利用通過(guò)ELISA分析合格的CENH3抗體, 對(duì)水稻材料日本晴的根尖細(xì)胞進(jìn)行蛋白免疫熒光檢測(cè)(圖1), 其中染色體用含DAPI抗褪色劑反染, 如紅色區(qū)域所示; 綠色信號(hào)為CENH3蛋白信號(hào), 在細(xì)胞有絲分裂間期、前期、中期和后期時(shí)期信號(hào)都明顯可見(jiàn)。在有絲分裂間期看不出著絲粒區(qū)域所在位置, 但是染色質(zhì)經(jīng)堿性染料DAPI染色, 染色較深的區(qū)域是異染色質(zhì)區(qū)域(圖1-A1中箭頭所示), 染色較淺的區(qū)域是常染色質(zhì)區(qū)域, 而著絲粒就位于異染色質(zhì)區(qū)域?？梢钥闯? CENH3信號(hào)都出現(xiàn)在異染色質(zhì)區(qū)域(圖1-A3中箭頭所示); 在有絲分裂前期(圖1-B), 染色體形態(tài)分明, 可以清晰的辨識(shí)出染色體的主縊痕, 即著絲粒區(qū)域(圖1-B1中箭頭所示), 其中，共有24個(gè)CENH3的信號(hào)并且均位于染色體的著絲粒區(qū)域; 有絲分裂中期(圖1-C), 染色體并排分布在赤道板上, 在中期結(jié)束后染色體將加倍, 而CENH3的信號(hào)也將隨著著絲粒而加倍。細(xì)胞分裂后期(圖1-D), 染色體隨著著絲點(diǎn)被拉向兩級(jí), CENH3信號(hào)均位于子細(xì)胞的一側(cè)(如圖1-D3所示)。在所觀察的有絲分裂的各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞中, 均能觀察到明顯可見(jiàn)的CENH3的信號(hào), 表明制備的抗體可用于蛋白免疫熒光分析。

圖1 水稻日本晴根尖細(xì)胞CENH3抗體的蛋白免疫熒光信號(hào)檢測(cè)分析Fig. 1. Immunofluorescence analysis of CENH3 antibody in somatic root tip cells of Nipponbare.

圖2 大麥(A)、小麥(B)和玉米(C)根尖細(xì)胞CENH3抗體的蛋白免疫熒光信號(hào)檢測(cè)分析Fig. 2. Immunofluorescence analysis of CENH3 antibody in somatic root tip cells of barley(A), wheat(B) and maize(C).

同時(shí), 為了驗(yàn)證制備的CENH3抗體是否在其他作物上也有效,分別對(duì)小麥、大麥和玉米的根尖染色體進(jìn)行了蛋白免疫熒光檢測(cè)(圖2)。在小麥和大麥的根尖染色體上并沒(méi)有檢測(cè)到CENH3信號(hào), 但是在玉米上能夠觀察到明顯的CENH3信號(hào), 并且也位于著絲粒區(qū)域。說(shuō)明本研究制備的CENH3抗體在玉米中的蛋白免疫熒光分析有效。

2.3 ChIP-DNA的PCR分析

由于水稻著絲粒是由蛋白和DNA組成的復(fù)合體, 所以分析與著絲粒蛋白相結(jié)合DNA序列的特征是進(jìn)行著絲粒功能和結(jié)構(gòu)分析的重要內(nèi)容之一。近年來(lái)發(fā)展的染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)方法是研究蛋白與DNA互作的主要手段。為了進(jìn)一步分析本研究中所獲得的著絲粒蛋白CENH3抗體是否能應(yīng)用于相關(guān)的ChIP分析, 我們利用該抗體進(jìn)行ChIP-PCR驗(yàn)證該DNA是否來(lái)源于水稻著絲粒特異DNA序列。

通過(guò)分別對(duì)基因組DNA(Input), 陰性對(duì)照(Mock)和ChIP-DNA設(shè)置兩個(gè)重復(fù)組, 以水稻著絲粒特異DNA序列CentO設(shè)計(jì)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖3)。以陽(yáng)性對(duì)照(基因組DNA)為模板擴(kuò)增出相關(guān)條帶, 由于水稻著絲粒特異DNA序列CentO是重復(fù)序列, 所以擴(kuò)增出3個(gè)條帶, 而陰性對(duì)照(Mock)幾乎沒(méi)有相應(yīng)條帶擴(kuò)增出。而由CENH3抗體所獲得的ChIP-DNA序列為模板可以擴(kuò)增出相應(yīng)條帶, 并與陽(yáng)性對(duì)照相吻合。說(shuō)明該ChIP-DNA來(lái)源于水稻著絲粒特異DNA序列。

2.4 ChIP-DNA的FISH定位分析

染色體熒光原位雜交(FISH)是驗(yàn)證重復(fù)序列在染色體上具體位置的重要方法之一。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CENH3抗體的ChIP-DNA是否位于著絲粒區(qū)域, 我們將ChIP-DNA標(biāo)記成FISH探針, 進(jìn)行熒光原位雜交。根據(jù)FISH的檢測(cè)結(jié)果(圖4), 紅色信號(hào)為染色體, 綠色信號(hào)為ChIP-DNA的雜交信號(hào), 其中ChIP-DNA的信號(hào)位于染色體著絲粒區(qū)域, 進(jìn)一步說(shuō)明該ChIP-DNA位于水稻著絲粒區(qū)域, 是與著絲粒特異組蛋白CENH3特異結(jié)合的DNA序列。

圖3 CENH3抗體免疫沉淀DNA的PCR結(jié)果Fig. 3. PCR results of ChIP-DNA immunoprecipitated with CENH3 antibody.

3 討論

本研究中制備的CENH3抗體, 通過(guò)效價(jià)的測(cè)定和蛋白免疫熒光檢測(cè), 都證明了CENH3抗體的有效性, 蛋白熒光信號(hào)存在于水稻細(xì)胞各時(shí)期的著絲粒上。同時(shí), 對(duì)制備的CENH3抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀, 得到ChIP-DNA, 通過(guò)FISH定位分析進(jìn)一步證明制備的CENH3抗體可用于ChIP分析。

圖4 日本晴根尖細(xì)胞ChIP-DNA的熒光原位雜交信號(hào)檢測(cè)結(jié)果Fig. 4. FISH analysis of ChIP-DNA in somatic root tip cells of Nipponbare.

CENH3是組蛋白H3的變體, 存在于真核生物的功能著絲粒中[18]。近年來(lái), 在玉米、水稻和擬南芥中都鑒別出植物的CENH3。對(duì)于著絲粒特異組蛋白CENH3的定位分析重要的方法之一就是利用對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行蛋白免疫熒光檢測(cè)。目前,可用于蛋白免疫熒光分析的抗體很多, 但是這些抗體不一定可以用到ChIP分析上, 這一方面和抗體的制備有關(guān)系, 另一方面是由于抗體的復(fù)雜性導(dǎo)致非特異性反應(yīng)較多, 從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法判斷, 所以對(duì)于制備的抗體需要進(jìn)一步的純化。此前, 我們實(shí)驗(yàn)室使用的CENH3抗體都是購(gòu)買或贈(zèng)與的國(guó)外制備抗體, 獲得途徑繁瑣或研究成本較高, 所以很有必要通過(guò)自己制備有效可用的CENH3抗體。本研究中, 我們制備的水稻CENH3抗體, 先后通過(guò)ELISA方法測(cè)定效價(jià), 蛋白免疫熒光進(jìn)行檢測(cè), 都證實(shí)制備的CENH3抗體是有效的。同時(shí), 進(jìn)一步的ChIP分析和FISH定位分析證明由該抗體所免疫共沉淀獲得的DNA序列是屬于水稻功能著絲粒區(qū)域。確定制備的CENH3抗體具有較好的特異性, 可應(yīng)用于與著絲粒結(jié)構(gòu)與功能分析的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中, 對(duì)進(jìn)一步解析水稻CENH3及著絲粒功能關(guān)系的研究提供了便利條件。另外，該抗體還可以應(yīng)用于玉米等其他物種，

為進(jìn)一步推廣該抗體的使用提供可能。

[1] Allshire R C, Karpen G H. Epigenetic regulation of centromeric chromatin: Old dogs, new tricks? Nat Rev Genet, 2008, 9: 923-937.

[2] Malik H S, Henikoff S. Major evolutionary transitions in centromere complexity. Cell, 2009, 138: 1067-1082. [3] Henikoff S, Ahmad K, Malik H S. The centromere paradox: Stable inheritance with rapidly evolving DNA. Science, 2001, 293: 1098-1102.

[4] Sullivan B A, Blower M D, Karpen G H. Determining centromere identity: Cyclical stories and forking paths. Nat Rev Genet, 2001, 2: 584-596.

[5] Lefrancois P, Auerbach R K, Yellman C M, Roeder G S, Snyder M. Centromere-like regions in the budding yeast genome. PLoS Genet, 2013, 9: e1003209.

[6] Clarke L. Centromeres: proteins, protein complexes, and repeated domains at centromeres of simple eukaryotes. Curr Opin Genet&Dev, 1998, 8: 212-218.

[7] Cheeseman I M, Drubin D G, Barnes G. Simple centromere, complex kinetochore: Linking spindle microtubules and centromeric DNA in budding yeast. J Cell Biol, 2002, 157: 199-203.

[8] Schueler M G, Higgins A W, Rudd M K, Gustashaw K, Willard H F. Genomic and genetic definition of a functional human centromere. Science, 2001, 294: 109-115.

[9] Sun X, Le H D, Wahlstrom J M, Karpen G H. Sequence analysis of a functional Drosophila centromere. Genome Res, 2003, 13: 182-194.

[10] Ananiev E V, Phillips R L, Rines H W. Chromosomespecific molecular organization of maize (Zea mays L.)centromeric regions. Proc Natl Acad Scie USA, 1998, 95: 13073-13078.

[11] Kamm A, Galasso I, Schmidt T, Heslop-Harrison J S. Analysis of a repetitive DNA family from Arabidopsis arenosa and relationships between Arabidopsis species. Plant Mol Biol, 1995, 27: 853-862.

[12] Cheng Z, Dong F, Langdon T, Ouyang S, Buell C R, Gu M, Blattner F R, Jiang J. Functional rice centromeres are marked by a satellite repeat and a centromere-specific retrotransposon. Plant Cell, 2002, 14: 1691-1704.

[13] Yoda K, Ando S, Morishita S, Houmura K, Hashimoto K, Takeyasu K, Okazaki T. Human centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 7266-7271.

[14] Cleveland D W, Mao Y, Sullivan K F. Centromeres and kinetochores: From epigenetics to mitotic checkpoint signaling. Cell, 2003, 112: 407-421.

[15] Talbert P B, Masuelli R, Tyagi A P, Comai L, Henikoff S. Centromeric localization and adaptive evolution of an Arabidopsis histone H3 variant. Plant Cell, 2002, 14: 1053-1066.

[16] Earnshaw W C, Rothfield N. Identification of a family of human centromere proteins using autoimmune sera from patients with scleroderma. Chromosoma, 1985, 91: 313-321.

[17] Jin W, Melo J R, Nagaki K, Talbert P B, Henikoff S, Dawe R K, Jiang J. Maize centromeres: Organization and functional adaptation in the genetic background of oat. Plant Cell, 2004, 16: 571-581.

[18] Nagaki K, Terada K, Wakimoto M, Kashihara K, Murata M. Centromere targeting of alien CENH3s in Arabidopsis and tobacco cells. Chrom Res, 2010, 18: 203-211.

[19] Kurumizaka H, Horikoshi N, Tachiwana H, Kagawa W. Current progress on structural studies of nucleosomes containing histone H3 variants. Curr Opin Struct Biol, 2013, 23: 109-115.

[20] Palmer D K, O'Day K, Wener M H, Andrews B S, Margolis R L. A 17-kD centromere protein (CENP-A) copurifies with nucleosome core particles and with histones. J Cell Biol, 1987, 104: 805-815.

[21] Bui M, Dimitriadis E K, Hoischen C, An E, Quenet D, Giebe S, Nita-Lazar A, Diekmann S, Dalal Y. Cellcycle-dependent structural transitions in the human CENP-A nucleosome in vivo. Cell, 2012, 150: 317-326.

[22] Malvezzi F, Litos G, Schleiffer A, Heuck A, Mechtler K, Clausen T, Westermann S. A structural basis for kinetochore recruitment of the Ndc80 complex via two distinct centromere receptors. EMBO J, 2013, 32: 409-423.

[23] Hori T, Shang W H, Takeuchi K, Fukagawa T. The CCAN recruits CENP-A to the centromere and forms the structural core for kinetochore assembly. J Cell Biol, 2013, 200: 45-60.

[24] Blower M D, Karpen G H. The role of Drosophila CID in kinetochore formation, cell-cycle progression and heterochromatin interactions. Nat Cell Biol, 2001, 3: 730-739.

[25] Howman E V, Fowler K J, Newson A J, Redward S, MacDonald A C, Kalitsis P, Choo K H. Early disruption of centromeric chromatin organization in centromere protein A (Cenpa) null mice. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 1148-1153.

[26] Nagaki K, Cheng Z, Ouyang S, Talbert P B, Kim M, Jones K M, Henikoff S, Buell C R, Jiang J. Sequencing of a rice centromere uncovers active genes. Nat Genet, 2004, 36: 138-145.

[27] Zhong C X, Marshall J B, Topp C, Mroczek R, Kato A, Nagaki K, Birchler J A, Jiang J, Dawe R K. Centromeric retroelements and satellites interact with maize kinetochore protein CENH3. Plant Cell, 2002, 14: 2825-2836.

[28] Nagaki K, Murata M. Characterization of CENH3 and centromere-associated DNA sequences in sugarcane. Chrom Res, 2005, 13: 195-203.

[29] van Lente F, Jackson J F, Weintraub H. Identification of specific crosslinked histones after treatment of chromatin with formaldehyde. Cell, 1975, 5: 45-50.

[30] Jackson V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible crosslinking agent. Cell, 1978, 15: 945-954.

[31] Jackson V, Chalkley R. A new method for the isolation of replicative chromatin: selective deposition of histone on both new and old DNA. Cell, 1981, 23: 121-134.

[32] Jackson V, Chalkley R. Use of whole-cell fixation to visualize replicating and maturing simian virus 40: Identification of new viral gene product. Proc Natl Acad Sci USA, 1981, 78: 6081-6085.

[33] Solomon M J, Varshavsky A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: A probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82: 6470-6474.

[34] Lee H R, Zhang W, Langdon T, Jin W, Yan H, Cheng Z, Jiang J. Chromatin immunoprecipitation cloning reveals rapid evolutionary patterns of centromeric DNA in Oryza species. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102: 11793-11798.

[35] Nagaki K, Talbert P B, Zhong C X, Dawe R K, Henikoff S, Jiang J. Chromatin immunoprecipitation reveals that the 180-bp satellite repeat is the key functional DNA element of Arabidopsis thaliana centromeres. Genetics, 2003, 163: 1221-1225.

Preparation and Application of Centromere-Specific Protein CENH3 Antibody in Rice

XUE Chao, ZHANG Rong, GUO Rui, LIU Shuai, LIU Xiaoyu, SHEN Mingchen, DENG Shifeng, GONG Zhiyun*
(Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology/Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops/Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;*Corresponding author, E-mail: zygong@yzu.edu.cn)

【Objective】 The centromeres of eukaryotic chromosomes are essential for cell division and inheritance of genetic information. The centromere is a complex composed of centromeric proteins and DNA motifs. In particular, a centromere-specific histone 3 variant, referred to CENH3, is a key centromere-specific protein for centromeric chromatin. So the preparation of CENH3 antibody is necessary for the research of centromeric structure and function.【Method】We designed a short-peptide for the rabbit immune experiment and prepared CENH3 antibody in rice. ELISA and protein immunofluorescence(IF) assay were performed to detect the effectiveness and availability of CENH3 antibody. 【Result】 The effective dilution of CENH3 antibody was detected at 1:400 000. Through IF analysis, obvious signals were detected in the centromeric region of each chromosome in rice and maize. DNA associated with CENH3 was selectively immunoprecipitated in chromatin immunoprecipitation assay(ChIP). After PCR amplification and FISH(fluorescence in situ hybridization) analysis, the results showed ChIP-DNA was located in functional centromere in rice. 【Conclusion】 These results demonstrated that CENH3 antibody prepared in this study can meet the requirement of related experiments in the research of centromere, and the antibody was prepared successfully.

rice; centromere-specific histone; chromatin immune-precipitation assay; immunofluorescence

Q786; S511.01

A

1001-7216(2017)05-0475-08

2017-03-24; 修改稿收到日期：2017-05-18。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(3137021)；江蘇省“青藍(lán)工程”項(xiàng)目。