水稻對(duì)穗枯病的抗病機(jī)理初步研究

李路 徐以華梁夢(mèng)琦王玲劉連盟侯雨萱 黎起秦黃世文,*

(1廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南寧 530003；2中國(guó)水稻研究所，杭州 310006；*通訊聯(lián)系人，E-mail：qqli5806@gxu.edu.cn；huangshiwen@caas.cn)

水稻對(duì)穗枯病的抗病機(jī)理初步研究

李路1,2徐以華1,2梁夢(mèng)琦2王玲2劉連盟2侯雨萱2黎起秦1,*黃世文1,2,*

(1廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南寧 530003；2中國(guó)水稻研究所，杭州 310006；*通訊聯(lián)系人，E-mail：qqli5806@gxu.edu.cn；huangshiwen@caas.cn)

【目的】水稻在孕穗期比苗期更容易感染穗枯病(Bacterial panicle blight of rice)并出現(xiàn)病癥。本研究旨在探究水稻不同時(shí)期對(duì)穗枯病的抗性機(jī)理，為培育抗病水稻品種奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎脟婌F法和注射法分別對(duì)苗期和孕穗期的抗、感病水稻品種接種穎殼伯克氏菌（Burkholderia glumae），測(cè)定處理組與對(duì)照組的3種抗氧化酶(POD、CAT、SOD)活性的差異，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定5種防衛(wèi)反應(yīng)基因(PR1a、PR10b、Rcht、LOX、PAL)的表達(dá)量?！窘Y(jié)果】B. glumae的侵染能引起水稻活性氧的積累，提高抗氧化酶活性，使部分防衛(wèi)反應(yīng)基因大量表達(dá)，但是苗期和孕穗期的應(yīng)答有較大區(qū)別。水稻孕穗期的抗氧化酶(SOD、CAT和POD)活性和防衛(wèi)反應(yīng)基因(PR10b、Rcht和PAL)的表達(dá)量比苗期高，但PR1a和LOX的表達(dá)量卻低于苗期?！窘Y(jié)論】B. glumae能誘導(dǎo)孕穗期的水稻產(chǎn)生更多抗病反應(yīng)，參與抗病反應(yīng)的主要是水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

水稻；穗枯??；抗氧化酶；防衛(wèi)反應(yīng)基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

水稻穗枯病(Bacterial panicle blight of rice，BPBR)又稱水稻細(xì)菌性谷枯病(Bacterial grain rot of rice)，由Goto等[1]于1956年在日本發(fā)現(xiàn)，隨后在亞洲、南北美洲和非洲的20多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道[2]，可造成水稻大幅減產(chǎn)。2007年，水稻穗枯病被我國(guó)列為檢疫性病害[3]，但近幾年水稻穗枯病的發(fā)生越來越嚴(yán)重[4]。穎殼伯克氏菌(Burkholderia glumae)是穗枯病的病原菌，在水稻苗期和穗期分別引起水稻爛秧、谷粒變色和稻穗枯死[4]。當(dāng)病原菌群體數(shù)量不大時(shí)，被侵染的苗期水稻不會(huì)表現(xiàn)明顯的病癥，病原菌潛伏在稻株內(nèi)，到孕穗期才爆發(fā)，引起稻穗枯死，但少量病原菌侵染稻穗，卻可以迅速引起谷粒變色[5]。同一種病原菌在寄主不同生長(zhǎng)期侵染不同部位，以及寄主在不同生長(zhǎng)期的抗性差異還鮮有報(bào)道。

植物在抵御病原菌侵染時(shí)能產(chǎn)生并積累活性院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2014RG005-2)；浙江省三農(nóng)六方項(xiàng)目(CTZB-F160728AWZ-SNY1-4)。氧(reactive oxygen species，ROS)。過多的ROS使植物體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化，蛋白質(zhì)、色素、酶、核酸的氧化損傷，甚至植物死亡[6]。植物本身的防御機(jī)制，如一些酶促反應(yīng)對(duì)ROS的累積進(jìn)行清除，使ROS處于低水平的動(dòng)態(tài)平衡，以此來維持植物的正常形態(tài)[7]。其中，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)可將超氧陰離子自由基(O2·－)歧化成H2O2和O2，過氧化物酶(peroxidase,POD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)催化H2O2向H2O的轉(zhuǎn)化[8-9]。POD還是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，它參與木質(zhì)素的合成，促進(jìn)傷口愈合，參與富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)結(jié)構(gòu)的形成和將酚類物質(zhì)氧化為醌，增強(qiáng)植株對(duì)病原菌的抗性[10]。

防衛(wèi)反應(yīng)基因在植物體內(nèi)快速累積和大量表達(dá)是植物抵抗病原菌侵染的必要條件。防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因主要包括與植保素合成相關(guān)基因(如苯丙氨酸解氨酶基因PAL、脂氧合酶合成基因LOX)、病程相關(guān)基因(如幾丁質(zhì)酶基因Rcht、PR1酸性蛋白基因PR1a、類似核糖核酸酶基因PR10b)、與結(jié)構(gòu)抗性有關(guān)的基因(木質(zhì)素合成有關(guān)基因)、核糖體失活蛋白(RIP)基因等。其產(chǎn)物直接作用于病原菌，限制病原的擴(kuò)展、增殖和對(duì)寄主的破壞[11]。病程相關(guān)基因(PR基因)的表達(dá)是一種廣譜、非專性的抗性[12]。PR基因的誘導(dǎo)和表達(dá)與植物信號(hào)傳導(dǎo)途徑的啟動(dòng)有關(guān)。目前研究較多的有茉莉酸(jasmonic acid, JA)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和水楊酸(salicylic acid, SA)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。JA途徑是亞麻酸通過脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)等酶的反應(yīng)生成茉莉酸甲酯。SA途徑源于苯丙烷類代謝途徑，苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase, PAL)是與苯丙烷代謝酶途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶[13]，PAL活性增強(qiáng)則進(jìn)一步促進(jìn)植物內(nèi)源SA的合成[14]。PAL還參與木質(zhì)素、植保素和酚類化合物的合成，與植物抗病性有密切聯(lián)系[15]。

本研究選用高感穗枯病和中抗水稻品種，通過噴霧法接種幼苗以及注射法接種幼穗，測(cè)定了受病原菌侵染后，苗期和穗期的水稻植株抗氧化酶的活性，以及防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)變化，初步探討了水稻不同時(shí)期對(duì)穗枯病的抗病機(jī)理差異。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)

1.1.1 水稻材料和菌種來源

經(jīng)兩年的接種鑒定，我們篩選出對(duì)穗枯病表現(xiàn)中抗的水稻品種鄂宜105以及高感品種輻恢838。所用水稻種子由國(guó)家水稻種質(zhì)資源中期庫提供。LMG2196(B.glumae)由浙江大學(xué)謝關(guān)林教授提供。

1.1.2 水稻秧苗培育及種植

水稻種子用3 %過氧化氫消毒24 h，滅菌水浸泡24 h后催芽。播種到含有滅菌土的塑料盒(18 cm×14 cm×12cm)中，置溫室(30℃)中培養(yǎng)。需長(zhǎng)至穗期的水稻在苗齡25 d左右進(jìn)行移栽。

1.1.3 菌懸液配制

將已活化的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中28℃下振蕩培養(yǎng)18 h，此時(shí)LMG2196處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。4000 r/min下將菌體離心至管底，加0.9%滅菌生理鹽水稀釋，用分光光度計(jì)(UnicoUV-4802，中國(guó))調(diào)菌液濃度至7×108CFU·mL-1(OD600= 0.517)。

1.2 接種及取樣

1.2.1 噴霧接種

于水稻2葉期，將濃度7×108CFU·mL-1的菌懸液均勻噴施在水稻葉片上，以噴施等體積生理鹽水的水稻為對(duì)照。

1.2.2 注射接種

水稻孕穗期時(shí)，用5 mL注射器將濃度7×108CFU·mL-1的菌懸液注射進(jìn)穗苞，至穗苞頂部有菌懸液溢出，以注射等體積生理鹽水的水稻為對(duì)照。

1.2.3 取樣

試驗(yàn)設(shè)8個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，分別為接種后0、6、12、24、48、72、96和120 h。水稻苗期取莖葉，孕穗期取幼穗。樣品取完后放液氮速凍，置－80℃下保存。

1.3 抗氧化酶活性測(cè)定

1.3.1 酶液的制備

稱取0.1 g樣品，加0.9 mL滅菌生理鹽水，冰浴勻漿后，4℃、2500 r/min下離心10 min，取上清備用。

1.3.2 過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定

用POD測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))測(cè)定樣品中POD的活性。利用POD催化H2O2反應(yīng)的原理，用分光光度計(jì)(UnicoUV-4802，中國(guó))測(cè)定420 nm處的OD值，根據(jù)以下公式計(jì)算POD活性：

POD活性(U/mg)=(A測(cè)定管－A空白管)/(12×樣品蛋白濃度) ×4000/3

1.3.3 過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定

用CAT測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))測(cè)定樣品中CAT的活性。CAT分解H2O2可被H8MoN2O4迅速中止，剩余的H2O2與H8MoN2O4產(chǎn)生淡黃色絡(luò)合物，測(cè)定其在405 nm處的OD值，根據(jù)以下公式計(jì)算CAT的活性。

表1 熒光定量PCR的引物Table 1. Specific primers for real-time PCR

CAT活力(U/mg)=(A對(duì)照管－A測(cè)定管)/60×271/(取樣量×樣品蛋白濃度)

1.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定

用SOD測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))測(cè)定樣品中SOD的活性。O2·－氧化羥胺形成亞硝酸鹽，加入顯色劑后呈現(xiàn)紫紅色。測(cè)定其在550 nm處的吸光值，根據(jù)以下公式計(jì)算總SOD活力。

總SOD活力(U/mg)=2×(A對(duì)照管－A測(cè)定管)/ A對(duì)照管×反應(yīng)液總體積/(取樣量×樣品蛋白濃度)

1.4 防衛(wèi)基因表達(dá)量分析

1.4.1 RNA提取及檢測(cè)

采用Trizol法提取葉片的總RNA[16]。葉片用液氮研磨后加入1 mL的Trizol(Invitrogen，美國(guó))混勻，12 000 r/min、4℃下離心5 min，取上清加500 μL氯仿混勻，12 000 r/min、4℃下離心15 min，取上清加入500 μL異丙醇混勻，12 000 r/min、4℃下離心10 min，棄上清，加入1 mL 80 %乙醇(－80℃提前預(yù)冷)混勻，12 000 r/min、4℃下離心2 min，棄乙醇，加入適量 DEPC ddH2O溶解。取1 μL用Nanodrop 2000(ThermoScientific，美國(guó))測(cè)定RNA的濃度。剩余RNA 保存于－80℃下備用。

1.4.2 cDNA合成

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover kit, ToYoBo，日本)的步驟，將總RNA加DEPC水至12 μL，65℃下變性后放冰上冷卻2 min，加4 μL 4倍濃度的降解預(yù)混液(4× DNA Master Mix)與基因組DNA清除劑(gDNA Remover)的混合物，37℃下放置15 min，去除總RNA中的gDNA，加4 μL 5倍濃度的反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液(5×RT Master Mix Ⅱ)，37℃下放置15 min，50℃下放置5 min，最后98℃下放置5 min。

1.4.3 目的基因的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增

試驗(yàn)所用的引物列在表1，其中泛素基因(Ubq)為內(nèi)參基因。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中包括1 μL模板，10 μL 2倍濃度的SYBR Green染色法PCR預(yù)混液( 2×SYBR Green PCR Master Mix, VazymeAceQTM，中國(guó))，0.2 μL引物(10 μmol/L)和8.6 μL ddH2O。擴(kuò)增條件如下：95℃下5 min；95℃下5 s，55℃/58℃ 下10 s，72℃下15 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，Bio-Rad FX96熒光定量PCR(Bio-Rad，德國(guó))自動(dòng)顯示Ct值。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析

水稻苗期以未接種病原菌的處理(－Bg)為對(duì)照，采用相對(duì)定量2－△△Ct法[17]計(jì)算接種病原菌處理(+Bg)中各基因的相對(duì)表達(dá)量。孕穗期以苗期表達(dá)量為對(duì)照，計(jì)算孕穗期相對(duì)苗期的各基因表達(dá)量變化。取3個(gè)重復(fù)的平均值計(jì)算樣品和對(duì)照處理的差異表達(dá)比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期和穗期不同抗性水稻品種抗氧化酶的活性

2.1.1 POD的活性

接種病原菌后，兩個(gè)水稻品種的POD活性總體高于同期對(duì)照。苗期，非親和反應(yīng)比親和反應(yīng)的POD活性更強(qiáng)且相對(duì)于對(duì)照的凈增加值也更大。非親和反應(yīng)在接種6 h和96 h有兩次高峰，而親和反應(yīng)只在6 h有最高峰(圖1-A)。水稻孕穗期的POD活性高于苗期，親和反應(yīng)與非親和反應(yīng)的POD在接種后24 h有最高活性，非親和反應(yīng)在72 h后有上升趨勢(shì)(圖1-B)。說明水稻孕穗期的POD活性凈增加量高于苗期，非親和反應(yīng)中的POD活性高于親和反應(yīng)。

圖1 不同抗性水稻品種中過氧化物酶(POD)的活性Fig. 1. Activity of peroxidase(POD) in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

圖2 不同抗性水稻品種中過氧化氫酶(CAT)的活性Fig. 2. Activity of catalase(CAT) in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

2.1.2 CAT的活性

接種B. glumae后，水稻苗期和孕穗期的CAT活性都處于低水平，非親和反應(yīng)中的活性更高，凈增加值更大。苗期接種后，非親和反應(yīng)的CAT活力在24 h有最高峰，親和反應(yīng)相比對(duì)照的增幅不大(圖2-A)。在孕穗期接種后，非親和反應(yīng)在6 h和96 h有較高活性，親和反應(yīng)在24 h和96 h的活性較高，但增長(zhǎng)量小于非親和反應(yīng)(圖2-B)。說明非親和反應(yīng)中CAT活性的增強(qiáng)比親和反應(yīng)更快，凈增加量更高；水稻孕穗期的CAT活性高于苗期。

2.1.3 SOD的活性

苗期接種后，兩個(gè)水稻品種的SOD活性均在6～12 h較高，此后親和反應(yīng)的變化與對(duì)照相似，而非親和反應(yīng)在48～120 h中高于對(duì)照(圖3-A)。孕穗期接種后，親和反應(yīng)的SOD在72 h有最大活性，非親和反應(yīng)在24 h活性最高，并從72 h開始呈上升趨勢(shì)(圖3-B)。說明非親和反應(yīng)中的SOD活性上升速度更快，凈增加量也高于親和反應(yīng)；水稻孕穗期的SOD凈增加量高于苗期。

2.2 苗期和穗期不同抗性水稻品種防衛(wèi)基因的表達(dá)2.2.1 PR1a的表達(dá)量

苗期接種后，非親和反應(yīng)的PR1a在接種后6～12 h的表達(dá)量均為對(duì)照的1.5倍以上，而親和反應(yīng)在病原菌侵染前期都處于低水平，120 h才約為對(duì)照1.7倍。孕穗期接種后，非親和反應(yīng)與親和反應(yīng)的PR1a均為下調(diào)表達(dá)(圖4)。說明苗期的非親和反應(yīng)比親和反應(yīng)中PR1a的表達(dá)量更高，表達(dá)時(shí)間更早；B. glumae的侵染對(duì)PR1a的誘導(dǎo)作用不大。

圖3 不同抗性水稻品種中超氧化物歧化酶(SOD)的活性Fig. 3. Activity of superoxide dismutase(SOD) in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

圖4 不同抗性水稻品種中PR1a相對(duì)表達(dá)量Fig. 4. Relative expression of PR1a in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

圖5 不同抗性水稻品種中PR10b相對(duì)表達(dá)量Fig. 5. Relative expression of PR10b in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

2.2.2 PR10b的表達(dá)量

苗期接種后，非親和反應(yīng)的PR10b在6 h表達(dá)量約為對(duì)照的9倍，在24～48 h和96 h也有很高的表達(dá)；而親和反應(yīng)在12 h和120 h約為對(duì)照1.8倍。孕穗期接種后，非親和反應(yīng)的PR10b在6～96 h比苗期有更高的表達(dá)量；親和反應(yīng)在6～72 h的表達(dá)也高于苗期(圖5)。以上結(jié)果說明，B. glumae的侵染能誘導(dǎo)水稻PR10b的大量表達(dá)，且孕穗期的表達(dá)量高于苗期；非親和反應(yīng)比親和反應(yīng)中PR10b的表達(dá)量更高且表達(dá)時(shí)間更早。

2.2.3 Rcht的表達(dá)量

苗期接種后，非親和反應(yīng)中Rcht在6～12 h的表達(dá)量是對(duì)照的2.31～3.78倍，而親和反應(yīng)在72～96 h才有高水平表達(dá)。孕穗期接種后，非親和反應(yīng)中Rcht在6～24 h和72～120 h的表達(dá)均高于苗期，而親和反應(yīng)僅在6 h和96 h有約為苗期2倍的表達(dá)量(圖6)。可見，B. glumae與水稻互作時(shí)能誘導(dǎo)Rcht的大量表達(dá)，其表達(dá)量與水稻品種和生長(zhǎng)時(shí)期有關(guān)，非親和反應(yīng)比親和反應(yīng)的Rcht表達(dá)量更高且表達(dá)時(shí)間更早，水稻孕穗期的表達(dá)量高于苗期。

2.2.4 LOX的表達(dá)量

苗期接種后，非親和反應(yīng)的LOX在接種24 h后有對(duì)照1.86倍的表達(dá)量；親和反應(yīng)在接種后6 h的表達(dá)量為對(duì)照的1.53倍。兩個(gè)組合中的LOX在孕穗期的表達(dá)都顯著低于苗期（圖7）。說明B. glumae不能通過誘導(dǎo)LOX的表達(dá)來啟動(dòng)水稻的JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

2.2.5 PAL的表達(dá)量

苗期接種后，非親和反應(yīng)的PAL的表達(dá)量與對(duì)照相似；但親和反應(yīng)在24和72 h的表達(dá)量分別為對(duì)照1.63和1.58倍。孕穗期接種后，PAL的表達(dá)量顯著高于苗期。非親和反應(yīng)中PAL的表達(dá)在0～96 h均顯著高于苗期；親和反應(yīng)中PAL在0～24和96 h也有很高表達(dá)，但表達(dá)量小于非親和反應(yīng)（圖8）。可見，孕穗期的PAL在兩個(gè)水稻品種中都有很高的表達(dá)，且非親和反應(yīng)的表達(dá)量高于親和反應(yīng)?？赏茢郟AL參與的SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑在水稻孕穗期抵抗B. glumae的侵染中有重要作用。

圖6 不同抗性水稻品種中Rcht相對(duì)表達(dá)量Fig. 6. Relative expression of Rcht in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

3 討論

植物體內(nèi)的抗氧化性酶主要由SOD、CAT和POD等組成，SOD清除O2·－、POD和CAT都能分解H2O2，酶活較低時(shí)，植物大量積累O2·－，與H2O2發(fā)生Harber-Weiss反應(yīng)，產(chǎn)生更具毒性的·OH，引起膜脂過氧化反應(yīng)，從而使寄主表現(xiàn)病癥[18-19]。由于寄主與病原物的不同組合，植物的抗病機(jī)制會(huì)有所差異[20]。在稻瘟菌(Magnaporthe grisea)與水稻互作過程中，POD的活性與抗稻瘟病的能力正相關(guān)，但其他酶的作用說法不一。宋海超等[20]提出，早期的SOD和CAT活性與抗稻瘟病的能力呈負(fù)相關(guān)。而葛秀春等[21]的結(jié)果表明SOD和CAT活性與對(duì)照相似。楊民和等[22]對(duì)稻瘟菌(M. grisea)侵染的水稻組織中的CAT進(jìn)行了定位觀察，發(fā)現(xiàn)CAT主要產(chǎn)生于細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)和囊泡膜上，并且非親和性互作中的累積量更高。植物在生長(zhǎng)過程中，各種酶的活性都是動(dòng)態(tài)變化的，并且不同生育期的水稻抗氧化酶活性也有差異[15]。本研究以未接種病原菌的水稻作為對(duì)照，排除了水稻自身氧化酶表達(dá)變化的影響。研究發(fā)現(xiàn)，POD、SOD和CAT在非親和反應(yīng)中的凈增加量高于親和反應(yīng)，并且水稻孕穗期的活性更高。各類酶在水稻苗期出現(xiàn)的最高值時(shí)間與水稻品種無關(guān)，但SOD和CAT在孕穗期的非親和反應(yīng)中上升速度更快。因此，推測(cè)水稻孕穗期的抗病反應(yīng)比苗期更強(qiáng)，抗病品種與感病品種的抗病性差異在孕穗期更為明顯。

圖7 不同抗性水稻品種中LOX相對(duì)表達(dá)量Fig. 7. Relative expression of LOX in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

圖8 不同抗性水稻品種中PAL相對(duì)表達(dá)量Fig. 8. Relative expression of PAL in rice varieties with different resistance to bacterial panicle blight.

本研究中，CAT的活性在接種病原菌后的增量并不高。Baker等[9]報(bào)道，細(xì)胞中H2O2水平很低時(shí)，CAT的清除能力也很低。因此對(duì)兩個(gè)時(shí)期接種后的水稻H2O2水平進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)時(shí)期的H2O2含量均處于低水平，且孕穗期的H2O2含量比苗期高，非親和反應(yīng)高于親和反應(yīng)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。推測(cè)CAT的低活性可能是因?yàn)樗倔w內(nèi)H2O2的含量不夠高。

稻瘟病菌(M. grisea)侵染后，水稻的LOX和PAL都能高度表達(dá)，因此JA和SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑能迅速啟動(dòng)[13]，而細(xì)條病菌(Xanthomonas. oryzae pv. oryzicola)侵染后的水稻只能啟動(dòng)JA信號(hào)途徑[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，JA途徑的關(guān)鍵酶脂氧合酶的基因表達(dá)量非常低，而SA途徑的關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶的基因表達(dá)量非常高，這個(gè)現(xiàn)象在孕穗期尤其明顯。因此，推測(cè)SA途徑是水稻抵御穎殼伯克氏菌(B. glumae)侵染的過程中的主要信號(hào)傳導(dǎo)途徑。但B. glumae侵染后的水稻是否能通過其他通路誘導(dǎo)啟動(dòng)JA途徑還需要更多研究去證實(shí)。據(jù)報(bào)道，SA與具有CAT活性的蛋白(SABP)結(jié)合能抑制CAT活性，使其失去催化H2O2的能力[24]。這可能是本研究中CAT活性較低的另一個(gè)原因。

與其他寄主與病原菌互作過程相似，B. glumae侵染水稻后，PR基因能不同程度地被誘導(dǎo)表達(dá)來激活防御反應(yīng)，非親和反應(yīng)中的表達(dá)水平高于親和反應(yīng)，并且表達(dá)時(shí)序也有差異。B. glumae能誘導(dǎo)PR10b和Rcht的顯著上調(diào)表達(dá)，但對(duì)PR1a的誘導(dǎo)作用不大。說明水稻與B. glumae互作的前期，不是所有抗病基因都能被誘導(dǎo)表達(dá)。但前期未表達(dá)的基因能否在后期被誘導(dǎo)，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

在寄主與病原互作時(shí)，植物的生長(zhǎng)與其抗病性的關(guān)聯(lián)性還不清楚[25]。Hugot等[26]報(bào)道，煙草被霜霉(Peronospora tabacina)侵染時(shí)，其抗性從營(yíng)養(yǎng)期到生殖期表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。Kus[27]研究發(fā)現(xiàn)，成熟的擬南芥植株比幼苗對(duì)丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性更強(qiáng)，但是Chen等[28]的試驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)這個(gè)差異。本研究中，水稻孕穗期的抗病性比苗期更強(qiáng)，這個(gè)現(xiàn)象可能與植物不同生育期的抗病性有關(guān)，也可能與B. glumae的侵染方式有關(guān)。據(jù)報(bào)道，水稻孕穗期之前，若病原菌群體數(shù)量不大，B. glumae侵入稻株后可以潛伏在水稻體內(nèi)，對(duì)水稻不會(huì)造成較大傷害，但在孕穗期開始急劇增殖并對(duì)寄主造成毀滅性破壞[5]。說明病原菌的群體數(shù)量或者群體感應(yīng)對(duì)寄主的抗病性有重要作用。因此，不同時(shí)期的水稻對(duì)穗枯病的抗性差異可能與B. glumae的侵染方式有關(guān)。水稻苗期抗穗枯病而穗期感病的機(jī)制揭示，對(duì)培育抗穗枯病的水稻材料具有科學(xué)借鑒意義。

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A Primary Study on the Mechanism Behind Resistance to Bacterial Panicle Blight of Rice

LI Lu1,2, XU Yihua1,2, LIANG Mengqi2, WANG Ling2, LIU Lianmeng2, HOU Yuxuan2, LI Qiqin1,*, HUANG Shiwen1,2,*

(1College of Agronomy, Guangxi University, Nanning 530003, China；2China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006，China；*Corresponding author, E-mail: qqli5806@gxu.edu.cn, huangshiwen@caas.cn）

【Objective】Rice is more susceptible to bacterial panicle blight at the booting stage than seedling stage. The objective of the study is to understand the resistant mechanism in different growing stage of rice and lay a basis for breeding rice varieties with high resistance.【Method】The spraying and injection method were used to inoculate seedlings and panicles of resistant and susceptible rice with Burkholderia glumae, respectively. The activities of three antioxidant enzymes (peroxidase, catalase and superoxide dismutase) of treatments and control were investigated. Real-time PCR was used to detect the expression of five defense response genes (PR1a, PR10b, Rcht, LOX and PAL).【Result】The infection of B. glumae induced the accumulation of reactive oxygen species, the increase of antioxidant enzymes activities and the higher expression of some defense genes. However, the defense response was different at the seedling stage and booting stage of rice. At the booting stage, the activities of antioxidant enzymes (peroxidase, catalase and superoxide dismutase) and the expression of PR10b, Rcht and PAL were higher, but the expression levels of PR1a and LOX were lower than those at the seedling stage.【Conclusion】B. glumae could induce more defense response of rice in booting stage, salicylic acid signaling pathway played an important role during the defense.

rice; bacterial panicle blight; antioxidant enzyme; defense gene; real-time fluorescence quantitative PCR

S435.111.4+5

A

1001-7216（2017）05-0551-08

2016-12-20；修改稿收到日期：2017-02-14。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2016YFD0200801)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程資助項(xiàng)目(CAAS-ASTIP-2013-CNRRI)；中央級(jí)公益性科研