ATP硫酸化酶基因MoMET3在稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中的功能分析

馮向陽 張震, 柴榮耀 邱海萍 王教瑜 毛雪琴 王艷麗 孫國昌,

(1浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 杭州 311300;2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所, 杭州 310021;*通訊聯(lián)系人, E-mail：zzhangcn928@sina.com)

ATP硫酸化酶基因MoMET3在稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中的功能分析

馮向陽1,2張震2,*柴榮耀2邱海萍2王教瑜2毛雪琴2王艷麗2孫國昌2,*

(1浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 杭州 311300;2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所, 杭州 310021;*通訊聯(lián)系人, E-mail：zzhangcn928@sina.com)

【目的】真菌對(duì)硫元素的利用始于ATP硫酸化酶對(duì)硫酸根離子的活化。對(duì)稻瘟病菌ATP硫酸化酶在病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中的功能進(jìn)行分析，可為稻瘟病的防治提供藥物靶標(biāo)?！痉椒ā坎捎猛粗亟M方法構(gòu)建基因敲除載體，并對(duì)突變體的表型進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】MoMET3基因是病菌營養(yǎng)生長(zhǎng)和分生孢子形成所必需的，但不是毒力因子。稻瘟病菌ATP硫酸化酶編碼基因MoMET3缺失后，突變體營養(yǎng)生長(zhǎng)速率減慢，產(chǎn)孢量降低，但是突變體對(duì)寄主的毒力不受影響；雖然基因缺失不影響突變體分生孢子萌發(fā)和附著胞成熟，但突變體在硫營養(yǎng)限制時(shí)孢子萌發(fā)后次生菌絲的生長(zhǎng)明顯受抑。MoMET3基因互補(bǔ)后，突變體恢復(fù)正常生長(zhǎng)，能利用硫酸鹽?！窘Y(jié)論】無機(jī)硫的還原對(duì)分生孢子的萌發(fā)和附著胞的成熟并不是必需的，分生孢子內(nèi)儲(chǔ)存的還原態(tài)硫化合物可以滿足這一過程中硫營養(yǎng)的需求，但病菌侵入寄主組織后需要吸收利用寄主源還原態(tài)硫以利于侵染菌絲的擴(kuò)展。

稻瘟病菌；ATP硫酸化酶；MoMET3；功能分析

硫元素是生物體內(nèi)一些重要化合物和大分子(蛋白質(zhì)，脂類，電子載體，中間代謝物)的組成物質(zhì)，是生命體生長(zhǎng)所必需的元素之一。真菌可從不同形態(tài)的含硫物質(zhì)中獲取硫元素，但自然界中無機(jī)硫酸鹽的同化仍是多數(shù)真菌硫元素獲取的最主要途徑。無機(jī)硫酸鹽被真菌吸收后，被ATP硫酸化酶還原成腺苷酰硫酸 (adenosine-5'-phosphosulfate, APS)，而后通過一系列還原過程，合成半胱氨酸。半胱氨酸在轉(zhuǎn)硫作用下逐漸轉(zhuǎn)化合成胱硫醚，高胱氨酸，最后合成甲硫氨酸；而甲硫氨酸可通過S-腺苷甲硫氨酸(SAM)轉(zhuǎn)化為高胱氨酸，后者可在反轉(zhuǎn)硫作用下重新形成半胱氨酸[1]。這一過程實(shí)現(xiàn)真菌硫元素在細(xì)胞內(nèi)的同化和循環(huán)利用。

在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)等真菌中已經(jīng)鑒定了硫代謝相關(guān)基因MET1、MET2、MET3、MET6、MET13等[2-5]。對(duì)病原真菌硫代謝相關(guān)基因的研究發(fā)現(xiàn)，硫代謝的相關(guān)基因在病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中也發(fā)揮著重要作用。在白色念珠菌(Candida albicans)中，甲硫氨酸合成酶編碼基因MET6是病菌生長(zhǎng)所必需的，添加外源甲硫氨酸也無法恢復(fù)MET6缺失突變體的正常生長(zhǎng)[6]。在禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)中，甲硫氨酸合成酶基因MET6缺失，導(dǎo)致突變體致病性喪失[7]。在新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)中，ATP硫酸化酶基因MET3突變體耐熱性降低，致病性喪失[8]；甲硫氨酸合成酶基因MET6突變體致病性喪失[9]。當(dāng)前研究證據(jù)顯示，這些硫代謝基因具有成為新藥物靶點(diǎn)的研究?jī)r(jià)值。

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的，是水稻生產(chǎn)中最重要的病害之一。稻瘟病菌是植物與病原真菌互作的模式生物之一[10]，稻瘟病菌基因功能的研究可為潛在的藥物靶點(diǎn)的發(fā)掘提供理論依據(jù)，也可為其他植物病原真菌相關(guān)研究提供借鑒。稻瘟病菌的侵染過程中，孢子的萌發(fā)、侵染結(jié)構(gòu)的形成、侵染菌絲的生長(zhǎng)，需要利用必要的營養(yǎng)物質(zhì)。稻瘟病菌硫代謝相關(guān)的研究表明，含硫氨基酸的合成在病菌生長(zhǎng)和致病過程中發(fā)揮著極其重要的作用。稻瘟病菌MoMET1基因編碼胱硫醚γ合成酶，參與半胱氨酸到胱硫醚的合成過程，MoSTR3基因編碼胱硫醚β裂解酶，將胱硫醚裂解為高半胱氨酸，MoMET1和MoSTR3突變體均表現(xiàn)致病性明顯下降[11-12]；MoMET6基因編碼甲硫氨酸合成酶，參與從高半胱氨酸到甲硫氨酸的合成過程，突變體致病性喪失[13]。這些基因主要集中在細(xì)胞內(nèi)有機(jī)態(tài)還原硫間的互相轉(zhuǎn)化，而無機(jī)硫酸鹽的同化對(duì)稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中的作用至今未有報(bào)道。為此，我們就稻瘟病菌ATP硫酸化酶在病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中的功能開展了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

稻瘟病菌野生型菌株Guy11、MoMET3基因缺失突變體、MoMET3隨機(jī)插入突變體均由本實(shí)驗(yàn)室保存；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL1，用于稻瘟病菌的遺傳轉(zhuǎn)化；供試質(zhì)粒pCAMBIA1300，用于敲除載體構(gòu)建；pBARGPE1攜有BAR抗性標(biāo)記，用于擴(kuò)增BAR表達(dá)盒。

1.2 基因序列分析

根據(jù)釀酒酵母ATP硫酸化酶的氨基酸序列，在稻瘟病菌的基因組數(shù)據(jù)庫(http://www. broadinstitute. org/annotation/genome/magnaporthe_comparative/Mu ltiHome.html)中進(jìn)行BLAST_P檢索，獲得其在稻瘟病菌中的同源序列。采用ClastW程序進(jìn)行蛋白序列聯(lián)配。

1.3 敲除載體的構(gòu)建

稻瘟病菌菌株于液體CM培養(yǎng)基中[14]，28℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d后，收集菌絲，采用CTAB法[14]提取基因組DNA。以稻瘟病菌菌株Guy11的基因組DNA為模板，用引物對(duì)APSP11/APSP12 PCR擴(kuò)增獲得MGG_15027基因的上游片段(大小約1.5 kb)，用引物對(duì)APSP17/APSP18 PCR擴(kuò)增獲得MGG_15027基因的下游片段(大小約1.5 kb)；以質(zhì)粒pBARGPE1為模板，用引物對(duì)BAR-F/BAR-R擴(kuò)增BAR表達(dá)盒(大小約0.9 kb)；用限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ和PstⅠ對(duì)質(zhì)粒pCAMBIA1300進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收約6.8 kb的骨架片段。采用Vazyme公司ClonExpress?II One Step Cloning Kit一步法將上述4個(gè)DNA片段做連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和DNA測(cè)序驗(yàn)證，獲得基因敲除載體pKOMET3。上述所用PCR引物見表1。

1.4 基因缺失突變體的獲得

稻瘟病菌的遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，AtMT)進(jìn)行，具體操作方法參考Wang等[15]。分別取1×106個(gè)/mL的野生型Guy11的孢子懸浮液與攜有pKOMET3的農(nóng)桿菌AGL1菌液(OD660≈0.6～0.8)100 μL，混合后涂布于IM培養(yǎng)基承載的硝酸纖維素膜上，23℃下共培養(yǎng)48 h后將膜剪成細(xì)條貼于含有50 μg/mL鹽酸四環(huán)素、50 μg/mL頭孢噻肟鈉和200 μg/mL草銨膦的CM平板上培養(yǎng)，待有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至含有草銨膦的CM平板上復(fù)篩1次，將能正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至CM平板上進(jìn)行培養(yǎng)。刮取轉(zhuǎn)化子菌絲，提取基因組DNA，采用PCR法驗(yàn)證基因同源重組事件的發(fā)生情況。首先，以引物對(duì)BAR-CF/BAR-CR擴(kuò)增BAR表達(dá)盒，驗(yàn)證T-DNA是否整合進(jìn)稻瘟病菌基因組；其次，以引物對(duì)APSP41/APSP42擴(kuò)增MoMET3基因部分片段，以引物對(duì)APSP45/APSP46擴(kuò)增包含MoMET3完整編碼區(qū)的DNA片段，根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無或大小判斷MoMET3基因是否被同源替換，最終獲得基因缺失突變體。所用引物見表1。

表1 本研究所用引物Table 1. Primers used in this study.

1.5 基因缺失突變體表型鑒定

1.5.1 突變體營養(yǎng)生長(zhǎng)和分生孢子產(chǎn)量的測(cè)定

野生型和突變體菌株在CM平板上28℃下暗培養(yǎng)3 d后，于菌落邊緣處切取約為2 mm×2 mm的菌塊，接種到直徑6 cm的CM平板上，28℃、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)6 d，觀察并記錄菌落形態(tài)、菌落直徑。用適量的雙蒸水洗刷平板后通過雙層擦鏡紙過濾收集分生孢子，在顯微鏡下觀察其形態(tài)及大小，并利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量。

1.5.2 ##突變體對(duì)硫營養(yǎng)的利用情況#

孢子懸浮液準(zhǔn)備：野生型和突變體菌株在CM平板上28℃下培養(yǎng)3 d后，于菌落邊緣處切取約為2 mm×2 mm的菌塊，接種在直徑9 cm的CM平板上，28℃下黑暗培養(yǎng)7 d，用無菌水刷去菌絲后，于28℃、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)48 h。用無菌水洗刷平板，收集分生孢子，并將濃度調(diào)至1×105個(gè)/mL待用。

取5 μL的孢子懸浮液點(diǎn)接種到MM平板和分別含有1 mmol/L甲硫氨酸、半胱氨酸和亞硫酸鈉的MM平板上，28℃、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)6 d，觀察并記錄菌落形態(tài)。

將野生型和突變體的孢子懸浮液濃度調(diào)至1×104個(gè)/mL，取2 μL的的孢子懸浮液點(diǎn)接種于MM平板上，28℃保濕暗培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h觀察孢子萌發(fā)及菌絲的生長(zhǎng)情況。

1.5.3 突變體侵染相關(guān)形態(tài)的分析

孢子萌發(fā)率和附著胞形成率測(cè)定：將野生型和突變體的孢子懸浮液濃度調(diào)至1×105個(gè)/mL，分別取20 μL孢子懸浮液置于塑料蓋玻片(購于Thermo Fisher Scientific公司)上，28℃下黑暗保濕培養(yǎng)一定時(shí)間后顯微鏡下統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率及附著胞形成率。

附著胞膨壓的測(cè)定：分別取20 μL野生型和突變體孢子懸浮液(1×105個(gè)/mL)置于塑料蓋玻片(購于Thermo Fisher Scientific公司)上，28℃黑暗保濕培養(yǎng)24 h后，分別用不同濃度的甘油溶液置換水溶液，并在10 min后在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)不同甘油處理下附著胞的塌陷率。

1.5.4 致病性測(cè)定

大麥離體葉片點(diǎn)接種：剪取生長(zhǎng)8 d的大麥(品種為ZJ-8)葉片，分別取20 μL梯度稀釋的突變體和野生型孢子液，點(diǎn)接種于大麥葉片上，在光照培養(yǎng)箱中28℃下黑暗保濕培養(yǎng)24 h后，光照培養(yǎng)，直至野生型接種處理顯現(xiàn)典型癥狀。比較并記錄各菌株的發(fā)病程度。

1.6 基因互補(bǔ)子的獲得

以稻瘟病菌菌株Guy11的基因組DNA為模板，用引物對(duì)APSP49/APSP50擴(kuò)增獲得MGG_15027基因片段(包含啟動(dòng)子和編碼區(qū)，大小約3.6 kb)；用限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ對(duì)質(zhì)粒pHKO(已連接HPH表達(dá)盒)進(jìn)行雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳回收約8.2 kb的骨架片段。采用Vazyme公司ClonExpress? Ⅱ One Step Cloning Kit一步法將上述2個(gè)DNA片段做連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和DNA測(cè)序驗(yàn)證，獲得基因互補(bǔ)載體pHMET3。所用引物見表1。

取1×106個(gè)/mL的敲除突變體M7的孢子懸浮液與攜有pHMET3質(zhì)粒的農(nóng)桿菌AGL1菌液(OD660≈0.6～0.8)各100 μL，混合后涂布于IM培養(yǎng)基承載的硝酸纖維素膜上，23℃下共培養(yǎng)48 h，將膜剪成細(xì)條貼于含有50 μg/mL鹽酸四環(huán)素、50 μg/mL頭孢噻肟鈉和200 μg/mL潮霉素的CM平板上培養(yǎng)，待有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至含有潮霉素的CM平板上復(fù)篩，并將能正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移至CM平板上進(jìn)行培養(yǎng)。刮取轉(zhuǎn)化子菌絲，提取基因組DNA，篩選能擴(kuò)增到MoMET3基因的轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)研究。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

辦好中國的事情，關(guān)鍵在黨，全面從嚴(yán)治黨是實(shí)現(xiàn)黨的歷史使命的必然要求。習(xí)近平總書記指出：“沒有規(guī)矩不成其為政黨，更不成其為馬克思主義政黨。”對(duì)于一個(gè)擁有8900多萬黨員、450多萬黨的基層組織的執(zhí)政黨，如果紀(jì)律不嚴(yán)，就是一盤散沙。黨的十八大以來，以習(xí)近平同志為核心的黨中央把紀(jì)律建設(shè)作為從嚴(yán)治黨的重要抓手，實(shí)現(xiàn)了全面從嚴(yán)治黨的重大突破。習(xí)近平總書記在多次講話中都突出強(qiáng)調(diào)紀(jì)律建設(shè)對(duì)全面從嚴(yán)治黨的重要性，提出了 “黨要管黨、從嚴(yán)治黨，紀(jì)律建設(shè)是治本之策?！薄凹o(jì)律不嚴(yán)，從嚴(yán)治黨就無從談起?！薄叭鎻膰?yán)治黨，重在加強(qiáng)紀(jì)律建設(shè)。”等一系列重要的論述，切實(shí)把黨的紀(jì)律建設(shè)擺在了從嚴(yán)治黨的突出位置。

突變體表型鑒定中的所有實(shí)驗(yàn)，每個(gè)菌株均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄與統(tǒng)計(jì)，用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MoMET3基因序列分析

利用釀酒酵母MET3基因編碼氨基酸序列于稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.broad-institute. org/annotation/genome/magnaporthe_comparative/Mu ltiHome.html)中進(jìn)行同源檢索，得到與MET3蛋白最為相似的同源蛋白，MGG_15027。MGG_15027基因全長(zhǎng)1721 bp，編碼由573個(gè)氨基酸組成的蛋白，無內(nèi)含子。生物信息學(xué)分析顯示，MGG_15027基因編碼蛋白包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，即nt_trans和NK結(jié)合域，與酵母MET3蛋白結(jié)構(gòu)一致。其氨基酸序列與釀酒酵母(S. cerevisiae)的MET3同源率約為63%(GenBank登錄號(hào)X06413)，與粗糙脈孢菌(N. crassa)ATP硫酸化酶的同源率最高，約為87%(GenBank登錄號(hào)為EAA35113)，且結(jié)合域相同。與構(gòu)巢曲霉(A. nidulans)的ATP硫酸化酶同源率約為78%(GenBank登錄號(hào)為AJ292542)，與白色念珠菌(C. albicans)的同源率約為57%(GenBank登錄號(hào)為AF164103)，與粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的同源率約為59% (GenBank登錄號(hào)D83992)，與人類病原真菌新型隱球菌(C. neoformans)CnMET3的同源率約為65% (GenBank登錄號(hào)為AY035556)。由此推斷，MGG_15027基因編碼是稻瘟病菌ATP硫酸化酶，暫命名為MoMET3。

2.2 MoMET3基因缺失突變體的獲得

為了研究MoMET3在稻瘟病菌中的生物學(xué)功能，利用同源重組技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定向敲除。經(jīng)AtMT轉(zhuǎn)化后，獲得了85個(gè)能在草胺膦平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以PCR擴(kuò)增的方法篩選MoMET3基因敲除突變體。MoMET3基因鄰

近基因組片段及pKOMET3限制性內(nèi)切酶酶切圖譜、預(yù)測(cè)的同源重組事件及擴(kuò)增用引物位置如圖1-A所示。以引物對(duì)BAR-CF/BAR-CR進(jìn)行擴(kuò)增，85個(gè)轉(zhuǎn)化子中均能擴(kuò)增到0.9 kb片段，表明各轉(zhuǎn)化子均有T-DNA插入。預(yù)期的MoMET3同源重組事件發(fā)生時(shí)，對(duì)于基因缺失突變體，引物對(duì)APSP41/APSP42不能擴(kuò)增到0.8 kb的MoMET3基因片段，引物對(duì)APSP45/APSP46僅能擴(kuò)增到2.0 kb的片段；而隨機(jī)插入突變體用上述引物對(duì)均可擴(kuò)增到相應(yīng)片段，且引物對(duì)APSP45/APSP46還能擴(kuò)增到2.7 kb的目的片段，結(jié)果顯示有34個(gè)轉(zhuǎn)化子發(fā)生了同源重組事件。PCR驗(yàn)證結(jié)果以部分轉(zhuǎn)化子為例(具體見圖1-B、1-C和1-D)。理論上候選基因缺失突變體均表現(xiàn)為相同的生物學(xué)表型，因此我們從中隨機(jī)選取了生長(zhǎng)表型相對(duì)一致的2個(gè)突變體(M7和M17)和隨機(jī)插入突變體R11用于后續(xù)的基因功能研究。

2.3 MoMET3缺失影響稻瘟病的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量

為了明確MoMET3基因缺失是否影響稻瘟病菌的營養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，突變體和野生型菌塊接種到CM平板上28℃、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)6 d后，觀察突變體和野生型的菌落形態(tài)，并測(cè)量菌落直徑和產(chǎn)孢量。結(jié)果顯示，相較于野生型菌株，突變體在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率顯著減緩，產(chǎn)孢量顯著降低，僅為野生型的35.3%。MoMET3基因缺失影響了稻瘟病菌在CM平板上的營養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢(圖2)。

圖1 MoMET3基因缺失突變體的獲得Fig. 1. Generation of the MoMET3 deletion mutants.

圖2 供試菌株在CM平板上的菌落形態(tài)與產(chǎn)孢情況(Mean±SD, n=6)Fig. 2. Morphology and conidiation of the tested M. oryzae strains on CM medium(Mean±SD, n=6).

2.4 MoMET3基因缺失突變體的生長(zhǎng)特性

MET3基因編碼ATP硫酸化酶，將SO42-活化為APS，起始硫還原利用過程。為了明確MoMET3基因參與的硫酸鹽同化對(duì)病菌生長(zhǎng)的影響，將5 μL突變體和野生型的孢子液(每1 mL含1×105個(gè)孢子)點(diǎn)接種于基本培養(yǎng)基上，于28℃、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)6 d。結(jié)果顯示，與野生型和隨機(jī)插入突變體相比，基因缺失突變體在基本培養(yǎng)基上無法形成菌落；當(dāng)在基本培養(yǎng)基中分別添加亞硫酸鈉、半胱氨酸和甲硫氨酸后，基因缺失突變體恢復(fù)生長(zhǎng)并形成菌落(圖3)。結(jié)果表明，MoMET3缺失僅阻斷了突變體對(duì)硫酸鹽的利用。

圖3 供試菌株對(duì)硫營養(yǎng)的利用情況Fig. 3. Utilization of sulfur compounds of the tested M. oryzae strains on minimal medium.

圖4 供試菌株在基本培養(yǎng)基上的菌絲形態(tài)Fig. 4. Morphology of M. oryzae on minimal medium.

為了進(jìn)一步分析MoMET3基因?qū)z生長(zhǎng)的影響，將2 μL突變體和野生型的孢子液(每1 mL含1×104個(gè)孢子)點(diǎn)接種于基本培養(yǎng)基平板上，觀察孢子萌發(fā)及菌絲的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，突變體與野生型的分生孢子一樣能在固體基本培養(yǎng)基中正常萌發(fā)，且在最初24 h內(nèi)，初生菌絲的生長(zhǎng)與野生型無明顯差異，但后續(xù)基因缺失突變體次生菌絲的生長(zhǎng)和分枝受到影響，在培養(yǎng)至72 h時(shí)，野生型的菌絲分枝多且密集，呈輻射狀向外擴(kuò)展；突變體的菌絲分枝少且稀疏，分枝菌絲呈螺旋狀卷曲(圖4)。上述結(jié)果表明，MoMET3缺失不影響突變體分生孢子萌發(fā)和初生菌絲的生長(zhǎng)，但次生菌絲的生長(zhǎng)受到硫酸鹽利用缺陷的限制。

由于MoMET3基因缺失不影響分生孢子的萌發(fā)，為了明確MoMET3基因缺失對(duì)稻瘟病菌附著胞分化的影響，將20 μL突變體和野生型的孢子液(每1 mL含1×105個(gè)孢子)分別點(diǎn)接于塑料蓋玻片上，28℃暗培養(yǎng)，在培養(yǎng)2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)率和附著胞形成率。結(jié)果顯示，相較于野生型，基因缺失突變體能分化形成形態(tài)正常的附著胞(圖5-A)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析也顯示，突變體分生孢子萌發(fā)率、附著胞形成率和附著胞塌陷率與野生型相比均無明顯差異(圖5-B～D)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MoMET3基因缺失不影響分生孢子的萌發(fā)和附著胞的分化成熟，同時(shí)也表明，稻瘟病菌分生孢子內(nèi)源的還原態(tài)硫物質(zhì)足以滿足分生孢子萌發(fā)和附著胞的成熟。

圖5 供試菌株分生孢子的萌發(fā)和附著胞的分化(Mean±SD, n=8)Fig. 5. Conidial germination and appressorial formation of MoMET3 deletion mutants(Mean±SD, n=8)

圖6 MoMET3基因缺失突變體的致病性Fig. 6. Pathogenicity test of MoMET3 deletion mutants.

2.5 MoMET3基因缺失不影響稻瘟病菌的致病性

為了明確MoMET3基因缺失對(duì)致病性的影響，分別用2 mL突變體和野生型的分生孢子液(每1 mL含1×105個(gè)孢子)噴霧接種對(duì)苗齡4周的水稻幼苗。結(jié)果表明，突變體接種水稻幼苗后能形成典型的稻瘟病病斑，且與野生型相比，發(fā)病嚴(yán)重度基本一致(圖6-A)。為了進(jìn)一步分析MoMET3缺失對(duì)毒力的影響，將突變體和野生型梯度稀釋的孢子懸浮液點(diǎn)接種于大麥葉片上。結(jié)果顯示，在不同孢子接種量水平下，突變體的毒力與野生型相比均無明顯差異(圖6-B)。上述結(jié)果表明，MoMET3基因缺失不影響突變體的毒力。

2.6 MoMET3互補(bǔ)恢復(fù)了缺失突變體對(duì)硫酸鹽的利用能力

我們將完整的MoMET3基因(包括啟動(dòng)子和編碼區(qū))重新導(dǎo)入突變體M7，獲得了互補(bǔ)子M7-C，并與Guy11和M7同時(shí)接種到CM平板和MM平板上培養(yǎng)。結(jié)果顯示，互補(bǔ)子M7-C恢復(fù)了在CM和MM平板的生長(zhǎng)速度(圖7)。結(jié)果表明，突變體M7在CM生長(zhǎng)速度減慢和對(duì)硫酸鹽利用能力的喪失是由MoMET3基因缺失引起。

3 討論

硫元素是合成許多化合物和大分子所必需的的重要元素之一，其中硫元素來源于無機(jī)硫的同化或者有機(jī)硫間的轉(zhuǎn)化。對(duì)于多數(shù)真菌，無機(jī)硫酸鹽同化是硫元素獲取的主要途徑。本研究通過對(duì)稻瘟病菌ATP硫酸化酶基因MoMET3靶向敲除，分析了稻瘟病菌硫酸鹽同化在病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病中作用。稻瘟病菌MoMET3基因缺失導(dǎo)致突變體菌絲生長(zhǎng)減慢，產(chǎn)孢降低，但突變體對(duì)寄主的致病性不受影響。MoMET3基因互補(bǔ)后，突變體恢復(fù)正常生長(zhǎng)，能利用硫酸鹽。表明無機(jī)硫的還原對(duì)分生孢子的萌發(fā)和附著胞的成熟并不是必需的，分生孢子內(nèi)儲(chǔ)存的還原態(tài)硫化合物可以滿足這一過程中硫營養(yǎng)的需求，但病菌侵入寄主組織后需要吸收利用寄主源還原態(tài)硫以利于侵染菌絲的擴(kuò)展。

圖7 供試菌株對(duì)硫營養(yǎng)的利用情況和在CM平板上的菌落形態(tài)Fig. 7. Utilization of sulfur compounds of the tested M. oryzae strains on minimal medium and the morphology of the tested M. oryzae strains on CM medium.

稻瘟病菌利用儲(chǔ)存在分生孢子中的營養(yǎng)物質(zhì)用于孢子的萌發(fā)和附著胞的分化[16,17]。稻瘟病菌MoMET3基因缺失不影響突變體分生孢子的萌發(fā)和附著胞的成熟，揭示了稻瘟病菌分生孢子內(nèi)可能存儲(chǔ)著非硫酸鹽形態(tài)的硫源，且可以滿足這一過程的硫營養(yǎng)需求。除硫酸鹽形態(tài)外，細(xì)胞內(nèi)硫元素可以多種化合物和大分子物質(zhì)存在。研究顯示，硫酸膽堿被認(rèn)為是真菌中一種重要的硫存儲(chǔ)物質(zhì)[18-20]，它是3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸與膽堿的反應(yīng)產(chǎn)物，它在膽堿脂酶的作用下釋放硫酸鹽。細(xì)胞內(nèi)硫酸膽堿中硫的利用，仍需經(jīng)歷MET3參與的硫同化過程。稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)和附著胞成熟過程中所需要的硫顯然與此無關(guān)。雖然其他形態(tài)的含硫物質(zhì)作為細(xì)胞硫營養(yǎng)至今未有明確的報(bào)道，但不排除稻瘟病菌利用這些含硫物質(zhì)滿足附著胞成熟過程中硫營養(yǎng)需求。

MoMET3基因缺失突變體在基本培養(yǎng)上次生菌絲的生長(zhǎng)受無機(jī)硫營養(yǎng)利用缺陷所抑制，而且突變體對(duì)寄主毒力未受影響，暗示著稻瘟病菌侵染寄主細(xì)胞時(shí)侵染菌絲的迅速增殖需要從寄主組織中吸收含硫物質(zhì)。硫在植物體內(nèi)主要以無機(jī)硫酸鹽和有機(jī)還原硫的形成積累，有機(jī)還原硫主要包括β-硫代葡萄糖苷、谷胱甘肽和SAM[21,22]。此外，植物組織中也有含硫氨基酸的存在[17,23,24]。雖然，無機(jī)硫酸鹽是真菌首選硫源，真菌也能吸收利用外源有機(jī)還原態(tài)的硫。酵母和粗糙脈孢霉等真菌中，已經(jīng)

鑒定了多個(gè)硫化合物轉(zhuǎn)移酶，包括甲硫氨酸滲透酶、半胱氨酸滲透酶和S-腺苷基甲硫氨酸滲透酶[25-29]，生物信息學(xué)分析顯示這些基因在真菌中普遍存在。稻瘟病菌MoMET3基因缺失雖然喪失了利用無機(jī)硫酸鹽的能力，但是由于真菌利用硫源的多樣化，這種硫利用途徑可被其他硫源利用途徑所補(bǔ)充。

綜上所述，稻瘟病菌ATP硫酸化酶參與的硫酸鹽還原對(duì)于病菌致病性是非必要的。但鑒于硫元素是生命活動(dòng)的重要性，后續(xù)從稻瘟病菌分生孢子存儲(chǔ)的或利于從寄主吸收的硫營養(yǎng)的利用著手，開展相關(guān)基因功能的研究并明確它們?cè)诓【l(fā)育和致病過程中的作用，有利于以硫營養(yǎng)利用為靶點(diǎn)開發(fā)新藥劑奠定理論依據(jù)。

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Functional Analysis of MoMET3 in Growth, Development and Pathogenicity of Magnaporthe oryzae

FENG Xiangyang1,2, ZHANG Zhen2,*, CHAI Rongyao2, QIU Haiping2, WANG Jiaoyu2, MAO Xueqin2, WANG Yanli2, SUN Guochang2,*

(1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agricultural and Forestry University, Hangzhou 311300, China;2Institute of plant protection and microbiology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;*Corresponding authors, E-mail: zzhangcn928@sina.com)

【Objective】 Sulfur is generally made biologically available by activation with ATP in a reaction catalyzed by ATP sulfurylase in fungi. The function of ATP sulfurylase in the growth and pathogenecity of Magnaporthe oryzae was analyzed to lay a foundation for target determination for rice blast prevention.【Method】The knockout vector was constructed by homologous recombination method, and the phenotype of the mutant was analyzed.【Result】MoMET3 was required for vegetative growth and conidiation, but not a virulence factor. The growth rate and conidiation of MoMET3-deleted mutants were significantly decreased in complete medium. Loss of MoMET3 did not affect conidial germination and appressiorial formation, but the growth of secondary hyphae was inhibited in the minimal medium. After complementation of MoMET3 gene, the mutant returned to normal growth and can utilize sulfate. 【Conclusion】These evidences revealed that the reduction of inorganic sulfur is not necessary for the process of conidial germination and appressiorial formation. The endogenous reduced sulfur in conidia was sufficient to meet the sulfur needs in the process of conidial germination and appressiorial formation, and utilization of host-derived reduced sulfur played an important role in the hypha expansion of the blast fungus in hosts.

Magnaporthe oryzae; ATP sulfurylase; MoMET3; functional analysis

Q785; S435.111.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)記碼：A

1001-7216(2017)05-0542-09

2017-02-13；修改稿收到日期：2017-05-23。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170136)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31470249)；浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2013C32019)。