HPLC測定不同生長年限蒙古黃芪中黃芪甲苷含量

閆晉晉+姚妙+楊薪正+王信隆+廖國珍

摘 要：目的：探討蒙古黃芪（AstragalusRadix）中黃芪甲苷的含量與生長年限的關(guān)系，為確定其最佳采收年限、保證藥材質(zhì)量控制、種質(zhì)資源的評價及為了進一步明確其功效提供參考依據(jù)。方法：采用HPLC法測定不同生長年限的蒙古黃芪中黃芪甲苷的有效含量。色譜柱為AgilentZORBAXSB-C18柱（4.6mm×150mm，5μm），流動相經(jīng)過預(yù)實驗確定為乙腈-水（35：65），最佳流速為1.0ml/min，最佳柱溫為30℃。結(jié)果：不同生長年限的蒙古黃芪中黃芪甲苷含量發(fā)生明顯變化，隨著生長年限的增長，藥材中黃芪甲苷含量基本呈上升趨勢，該成分在1、2年生蒙古黃芪中含量較低，且2年生含量略微高于1年生的含量；3、4年生蒙古黃芪中含量出現(xiàn)明顯升高的趨勢，尤其是4年生含量急劇上升，幅度最大。5、6年生藥材中其含量變化不大，且有微弱的下降趨勢。結(jié)論：不同的生長年限蒙古黃芪中黃芪甲苷含量差異較大，應(yīng)根據(jù)不同需求選擇合適的采收時間。

關(guān)鍵詞：蒙古黃芪；高效液相色譜法；黃芪甲苷；含量比較；不同生長年限

中圖分類號：Q94 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-2945（2017）28-0085-03

黃芪系豆科植物膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.或蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongho-licus（Bge.）Hsiao.的干燥根莖[1]。為《中國藥典》收錄的常用中藥材之一，較膜莢黃芪根部在生長過程中形態(tài)易產(chǎn)生雞爪根的特點[2]，蒙古黃芪則相對穩(wěn)定，近年來商品黃芪中多為蒙古黃芪。其性微溫、味甘，具有補氣固表、托毒排膿、斂瘡生肌，利尿等生物活性。是玉屏風(fēng)顆粒、頸舒膠囊、心通口服液[3]等著名中成藥的原料藥材之一，近年來，蒙古黃芪的消耗量逐年增加，已達年消耗量數(shù)千噸，今后市場需求量還將進一步釋放。但同時也存在掠奪式的采挖，野生蒙古黃芪資源已瀕臨滅絕的現(xiàn)狀，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代化生產(chǎn)的需要，因此人工馴化與栽培正在大規(guī)模種植。蒙古黃芪的主要活性成分之一為黃芪甲苷，具有提高人體免疫力、增強機體抗病能力[4]、提高機體抗應(yīng)激能力、抗病毒[5]等多種功效。

近年來，有研究報道，黃芪甲苷還具有改善心肺功能[6]的功效，是蒙古黃芪的主要有效成分之一，同時還是評價黃芪藥材質(zhì)量[7]、藥用價值的一項重要指標(biāo)。目前，對蒙古黃芪在不同生長年限中黃芪甲苷的含量變化及規(guī)律的研究還未見系統(tǒng)的報道。為此，筆者在經(jīng)過預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法（HPLC）對陜西渾源縣恒山周邊廣泛種植的6種不同生長年限的蒙古黃芪中的黃芪甲苷含量進行分析，以期為蒙古黃芪最佳采收期的確定、藥材質(zhì)量控制、種質(zhì)資源的評價[8]及為了進一步明確其功效提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。1、2、3、4、5和6年生蒙古黃芪于2015年10月、2016年10月采自山西省大同市渾源縣，均為人工馴化后栽培品種，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中草藥鑒定專家許文友教授鑒定為蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge. Var. MongholicusHsiaoBge.]的干燥根莖，去除須根后清洗干凈并切片、烘干。

1.1.2 主要試劑黃芪甲苷對照品（批號：0781-200109），由西北農(nóng)林科技大學(xué)中草藥指紋圖譜實驗室提供，專供含量測定使用；經(jīng)HPLC檢測純度≥98%；色譜乙腈，由上?；瘜W(xué)試劑有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號為20060530；其他試劑均為由西安醫(yī)專藥學(xué)實驗室提供的國產(chǎn)分析純；水為購自人人樂超市的娃哈哈牌飲用純凈水。

1.1.3 主要儀器安捷倫Agilent1260LC高效液相色譜儀，由美國Agilent公司生產(chǎn)，同機配置有真空在線脫氣機、六通閥進樣器、柱溫箱、Alltech ELSD 3300蒸發(fā)光散射檢測器、Infinity四元梯度泵；Agilentchemstation化學(xué)工作站；KQ-250DE型超聲波清洗器，由江蘇昆山市超聲儀器公司生產(chǎn)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，由上海亞榮儀器有限公司生產(chǎn)；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式真空泵，由鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；MettlerAE240電子天平，由梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)；FZ-102型微型植物樣品粉碎機，由北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，由北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備精密稱定干燥至恒重的黃芪甲苷對照品3.000mg，加甲醇10.00ml，制成濃度為300μg/ml的溶液，即得對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備將蒙古黃芪樣品風(fēng)干后粉碎，過60目篩，精密稱取蒙古黃芪粉末4g，置于索氏提取器中，加入甲醇40ml，過夜，常溫下加入適量的甲醇加熱回流提取一次，提取液回收甲醇濃縮至干燥殘渣，殘渣用水（微熱）溶解，然后水飽和的正丁醇振蕩重復(fù)提取3次，并將正丁醇液合并，然后用20mL氨試液洗滌，重復(fù)2次，棄掉氨液，正丁醇液蒸干，再次用甲醇溶解并定容于5mL的容量瓶中，搖勻后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件。色譜柱，AgilentZORBAXSB-C18柱（4.6mm×150mm，5μm），流動相為一定體積比的乙腈-水（35：65），流速設(shè)定為1.0ml/min，色譜柱溫度設(shè)定為30℃。進樣量5μL。黃芪甲苷對照峰的理論塔板數(shù)不低于4000，黃芪甲苷與其他成分出峰的分離度R均大于1.5，分離效果良好。

1.2.4 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系考察對照品溶液按照濃度差精密吸取6份，按2、4、8、10、15、20μL分別注入高效液相色譜儀，按照“1.2.3”項下確定的色譜條件進樣，計算峰面積后，用SPSS23.0軟件計算x（對照品進樣量的自然對數(shù)）y與（對照品峰面積的自然對數(shù)）的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)R。endprint

（2）精密度試驗根據(jù)“1.2.3”項下確定的色譜分離條件，精密吸取對照品溶液10μl，分5次連續(xù)進樣，對每次峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD進行計算，以評價儀器的精密度。

（3）穩(wěn)定性試驗取同一種供試品溶液（編號 HS-07），精密吸取6份，每份10μl，按“1.2.3”項下確定的的色譜條件進樣，時間段分別設(shè)定為0、2、4、8、16、24h，依次進行，對每個時間點的峰面積進行相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD的計算，結(jié)果用來評價供試品溶液的穩(wěn)定性良好程度。

（4）重復(fù)性試驗選取同一蒙古黃芪樣品（編號 HS-08），分別平行取樣5次，按“1.2.2”項下確定的方法制備供試品溶液，然后按“1.2.3”項下確定的色譜條件依次進樣，對每個樣品峰面積的RSD進行計算，結(jié)果用來評價此方法的重復(fù)性。

（5）回收率試驗選取已知黃芪甲苷含量的同一蒙古黃芪樣品（編號 HS-08，3年生），精密稱取藥材樣品6份，每份2 g，分別精密加入濃度為300μg/mL的黃芪甲苷對照品溶液各1mL，按“1.2.2”項下確定的方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項下確定的色譜條件進行進樣，計算測定結(jié)果的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.2.5 試樣中黃芪甲苷成分含量的測定按照不同的生長年限，分別精密稱取蒙古黃芪藥材0.25g，供試品溶液的制備按照“1.2.2”項下確定的方法進行，進樣的色譜條件按照“1.2.3”項下確定的進行，計算峰面積，根據(jù)“1.2.4.1”線性關(guān)系考察中建立的回歸方程，計算得到蒙古黃芪樣品中黃芪甲苷的準(zhǔn)確含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照品和供試品色譜分析結(jié)果

對照品和供試品色譜圖見圖1。由圖中可知，按“1.2.3”項下確定的色譜條件，對照品和供試品均能達到較好的基線分離效果。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系圖2顯示，以X（對照品進樣量的自然對數(shù)）為橫坐標(biāo)，以Y（對照品峰面積的自然對數(shù)）為縱坐標(biāo)，根據(jù)測定結(jié)果得出線性回歸方程為Y=1.56123X+4.6983，r=0.9996，黃芪甲苷對照品的進樣量在1.19～6.44μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗測得黃芪甲苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.29%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗供試品溶液（編號 HS-07）中黃芪甲苷峰面積的RSD=2.42%。表明該供試品溶液能夠在24h內(nèi)保持基本穩(wěn)定，符合試驗要求。

2.2.4 重復(fù)性試驗測得黃芪甲苷峰面積的RSD=2.01%，表明該測定方法的重復(fù)性良好。

2.2.5 回收率試驗由表1可知，黃芪甲苷的平均回收率=98.21%，RSD=1.05%，表明方法準(zhǔn)確、可靠，符合分析要求。

2.3 樣品中黃芪甲苷含量

由表2可知，生長年限為1年的蒙古黃芪中黃芪甲苷的含量范圍在0.051%～0.092%之間，生長年限為2年的蒙古黃芪中黃芪甲苷含量在0.091%～0.133%之間，生長年限為3年的蒙古黃芪中黃芪甲苷含量在在0.109%～0.212%之間，生長年限為4年的蒙古黃芪中黃芪甲苷含量在在0.112%～0.193%之間，生長年限為5年的蒙古黃芪中黃芪甲苷含量在在0.093%～0.192%之間。生長年限為6年的蒙古黃芪中黃芪甲苷含量在0.087%～0.186%之間。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

從試驗結(jié)果看，不同生長年限的蒙古黃芪中黃芪甲苷含量發(fā)生明顯變化，隨著生長年限的增長，藥材中黃芪甲苷含量基本呈上升趨勢，該成分在1、2年生蒙古黃芪中含量較低，且2年生含量略微高于1年生的含量；3、4年生蒙古黃芪中含量出現(xiàn)明顯升高的趨勢，尤其是4年生含量急劇上升，幅度最大。5、6年生藥材中其含量變化不大，且有微弱的下降趨勢。確定中藥材最佳采收年限需從其產(chǎn)量和質(zhì)量方面綜合評估。因此，在綜合考慮了最佳采收年限、產(chǎn)量質(zhì)量和資源保護三方面的基礎(chǔ)上，得出了以4年生采收最為適宜。此外，要確定人工栽培種植藥材確切的生長年齡，在工作中有一定困難，在下一步的研究中，將對規(guī)范化種植后的藥材進行采樣，然后再使用該方法研究藥材的最佳采收期，預(yù)期將會得出更為準(zhǔn)確、可靠的結(jié)論，為黃芪資源的進一步開發(fā)與利用提供參考。

3.2 討論

制備供試品溶液的方法選擇 在預(yù)試驗中分別測試了3種提取方法，分別是超聲波提取、加熱回流和索氏提取，對3種方法的提取效果進行比較后發(fā)現(xiàn)索氏提取法的提取效率最高。在選取索氏提取法后，又對溶劑（甲醇、氯仿、乙醇和石油醚等）、提取次數(shù)、提取時間及萃取次數(shù)等因數(shù)的提取效果進行了比較，試驗結(jié)果表明，取甲醇作為提取溶劑，提取2次，正丁醇振蕩提取3次，可將蒙古黃芪中的黃芪甲苷基本提取完全。從出峰時間和分離情況等因素綜合分析，選擇乙腈-水（35∶65）等強度洗脫時，保留時間最為適宜、易出對稱峰且分離度良好（R>1.5）。

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