核苷（酸）類似物治療停藥后復(fù)發(fā)的慢性乙肝患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變分析

李全雙++++++鄧演超++++++程星++++++裴蘊(yùn)鋒++++++周靜++++++沈紅艷++++++徐湛

[摘要] 目的 研究核苷（酸）類似物（Nas）治療停藥后復(fù)發(fā)的慢性乙肝患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變情況。 方法 收集2014年1月～2016年1月在徐州市中心醫(yī)院就診的慢性乙肝患者110例，患者既往服用Nas時(shí)間6個(gè)月以上，因各種原因停藥后病情復(fù)發(fā)。用PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)HBV耐藥突變位點(diǎn)及基因型。 結(jié)果 在110例血清標(biāo)本中有耐藥突變位點(diǎn)產(chǎn)生的62例，檢出率是56.36%，其中rtL180M，rtM204V，rtM204I，rtA181V檢出率較高，檢出例數(shù)（檢出率）分別是36例（32.73%）、24例（21.82%）、24例（21.82%）、14 例（12.73%）；在110例患者中對(duì)Nas耐藥的有58例（52.73%），主要耐藥突變模式是rtL180M+M204I/V、rtM204I和rtA181V?；颊邔?duì)拉米夫定（LMV）、替比夫定（LDT）、阿德福韋酯（ADV）耐藥比例分別是52.73%，22.73%，14.55%；有43例患者存在恩替卡韋（ETV）耐藥風(fēng)險(xiǎn)（39.09%）。24例患者對(duì)LMV和LDT耐藥，比例是21.82 %；14例（12.73%）對(duì)LMV和ADV耐藥；2例（1.82%）對(duì)LMV、LDT、ADV耐藥。HBV RT區(qū)發(fā)生耐藥突變與患者的年齡、性別、基因型無關(guān)（P > 0.05）。 結(jié)論 Nas治療慢性乙肝停藥復(fù)發(fā)患者的耐藥突變發(fā)生率較高；停藥復(fù)發(fā)患者有必要檢測(cè)HBV耐藥突變，為繼續(xù)治療提供重要依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 慢性乙肝；乙肝病毒；停藥；復(fù)發(fā)；耐藥；突變

[中圖分類號(hào)] R512.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）08（b）-0107-04

[Abstract] Objective To investigate the mutation of hepatitis B viurs DNA reverse transcriptase in chronic hepatitis B patients with relapse after nucleot（s）ide analogues withdrawal. Methods From January 2014 to January 2016， in Xuzhou Central Hospital， 110 serum samples of patients with chronic hepatitis B were collected. Patients took nucleoside （acid） drugs for more than 6 months； due to various reasons， patients after withdrawal of the disease recurrence. HBV resistance mutation sites and genotypes were detected by PCR- reverse dot blot hybridization. Results There were 62 drug resistant mutations， the detection rate was 56.36%； including 36 cases of rtL180M （32.73%）， 24 cases of rtM204I （21.82%）， 24 cases of rtM204V （21.82%）， 14 cases of rtA181V （12.73%）； the number of patients with drug resistance was 58 cases （52.73%）， and the main patterns of mutation were L180M+M204I/V， M204I， A181V. Drug resistance rates of Lamivudine （LMV）， telbivudine （LDT）， adefovir dipivoxil （ADV） was 52.73%， 22.73%， 14.55% respectively； there were 43 patients with entecavir resistance risk （39.09%） among them. 24 patients were resistant to LMV and LDT， the ratio was 21.82%； 14 patients were resistant to LMV and ADV， the ratio was 12.73%； 2 patients were resistant to LMV， LDT， ADV， the ratio was 1.82%. Mutations in the HBV RT region were independent of age， sex， genotype （P > 0.05）. Conclusion The incidence of drug resistance mutation in chronic hepatitis B patients with relapse after withdrawal was higher； it is necessary to detect the mutations in chronic hepatitis B patients with relapse after withdrawal， so as to provide basis for clinical treatment.

[Key words] Chronic hepatitis B； Hepatitis B viurs； Withdrawal； Relapse； Drug resistant； Mutationendprint

核苷（酸）類似物[nucleot（s）ide analogues，NAs]在臨床上廣泛用于慢性乙肝（CHB）的抗病毒治療，該類藥物通過直接靶向抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的活性來發(fā)揮抗病毒的作用，但對(duì)HBV復(fù)制的原始模板共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）沒有直接抑制作用，所以需要長期用藥。然而CHB患者長期治療費(fèi)用高，依從性差等原因，會(huì)造成不規(guī)范停藥；由于核苷（酸）類似物不能直接清除cccDNA，因此停藥后，部分患者體內(nèi)HBV可重新啟動(dòng)復(fù)制，造成肝炎復(fù)發(fā)，需要繼續(xù)用藥治療[1]。但是由于HBV的復(fù)制極其活躍及其RT又缺乏校正功能，所以HBV變異率比其他DNA病毒相對(duì)高數(shù)倍，因而具有高度變異的特性[2]。所以在NAs治療HBV過程中，HBV 易發(fā)生耐藥突變，是治療失敗的主要原因[3]。因此有必要研究核苷（酸）類似物治療慢性乙肝停藥復(fù)發(fā)患者的HBV耐藥突變情況，本研究對(duì)此類患者進(jìn)行了HBV 耐藥突變檢測(cè)，為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月～2016年1月徐州市中心醫(yī)院就診的CHB患者的血清標(biāo)本110 例，其中男91例，女19例，年齡21～67歲，平均（40.3±11.8）歲。所有患者均經(jīng)核苷（酸）類似物治療后，因各種原因停藥后病情復(fù)發(fā)，患者血清HBV DNA定量標(biāo)準(zhǔn)>1×103 copies/mL的陽性標(biāo)本；CHB的診斷和復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[4]；排除其他肝炎疾病如HCV、HDV、HIV等混合感染。

1.2 試劑、儀器及檢測(cè)方法

HBV耐藥突變檢測(cè)試劑盒和HBV DNA提取試劑盒購自亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司。儀器有深圳亞能分子雜交儀（YN-H16），上海宏石SLAN-96S全自PCR儀。使用 PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè) HBV耐藥突變位點(diǎn)與基因型[2]，該法檢測(cè)HBV耐藥突變位點(diǎn)（rt180、rt204、rt207、rt181、rt236）和基因型（B、C、D）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集和處理 采集患者靜脈血 3 mL，注入真空采血管，室溫靜置30～60 min，然后 2000 r/min離心10 min。如果不能當(dāng)天及時(shí)檢測(cè)，吸取上層血清轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，保存于2～8℃不超過48 h、-20℃下不超過半年完成實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 HBV DNA 的提取 在1.5 mL離心管中加入200 μL HBV DNA 提取液I及待測(cè)血清，13 000 r/min離心5 min。吸棄上清液，加入50 μL HBV DNA提取液Ⅱ，震蕩混勻至沉淀完全溶解，沸水浴10 min。加入5 μL三氯甲烷，混勻，13 000 r/min離心5 min。取上清1.5 μL作為PCR反應(yīng)模板。陰、陽性制品與血清標(biāo)本的處理方式相同，同步處理。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 取1.5 μL樣品DNA加入反應(yīng)液管，同時(shí)做陰陽性質(zhì)控品。擴(kuò)增條件：50℃ 2 min；95℃ 10 min；94℃ 60 s，68℃ 90 s，30 Cycles；94℃ 30 s，54℃ 30s，72℃ 30s，30 Cycles；72 ℃ 5 min 。以1.4℃/s 的速度設(shè)置升降溫。

1.3.4 雜交、洗膜及顯色 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與A液雜交1.5 h。由B液、C液洗膜，最后在顯色液中顯色，觀察結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在110 例CHB患者中檢出HBV C型101例（91.82%），B型5例（4.55%），BC型2例（1.82），BD型1例（0.91%），D型未檢出，其中有1例檢出野生型位點(diǎn)，但未檢出基因型。在C型的標(biāo)本中檢出耐藥突變位點(diǎn)58例，其中有4例僅檢出耐藥突變位點(diǎn)rtLl80M；在B型的標(biāo)本中檢出耐藥突變位點(diǎn)3例，BC型有1例。在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)（RT區(qū)）耐藥突變位點(diǎn)分別檢出rtLl80M，rtM204V，rtM204I，rtAl81V，rtN236T，rtM207I，檢出例數(shù)分別是36例、24例、24例、14例、3例、2例，檢出率分別是32.73 %、21.82%、21.82%、12.73 %、2.72 %、1.82 %。

58例耐藥標(biāo)本HBV RT區(qū)耐藥突變模式與對(duì)應(yīng)的核苷（酸）類似物耐藥情況，詳見表1。

將患者的年齡、性別、基因型作為耐藥突變相關(guān)因素進(jìn)行分析，HBV RT區(qū)發(fā)生耐藥突變與患者的年齡、性別、基因型無關(guān)（P > 0.05）。見表2。

3 討論

HBV基因組P區(qū)編碼多種功能蛋白，包括DNA聚合酶[5]。此酶既有以RNA為模板合成DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶功能，又有催化合成DNA的多聚酶功能。目前，NAs均以HBV逆轉(zhuǎn)錄酶作為靶點(diǎn)，發(fā)揮抑制病毒復(fù)制的作用。有研究結(jié)果顯示，即使嚴(yán)格按照指南推薦的停藥標(biāo)準(zhǔn)，仍有44.0%～61.4%的患者在1年內(nèi)復(fù)發(fā)[6-7]。由于HBV易發(fā)生基因耐藥突變，病情復(fù)發(fā)的CHB患者若繼續(xù)治療，會(huì)有耐藥風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致治療失敗[8]。

本研究檢測(cè)HBV RT區(qū)耐藥突變，分析核苷（酸）類似物耐藥情況。結(jié)果顯示，發(fā)生率較高的突變位點(diǎn)是rtLl80M，rtM204V，rtM204I，rtAl81V檢出率分別是32.73%、21.82%、21.82%、12.73%，而rtN236T，rtM207I檢出率相對(duì)較低，分別是2.72%、1.82%。110例患者中HBV RT區(qū)發(fā)生基因耐藥突變的有62例，其中有4例單獨(dú)出現(xiàn)rtLl80M變異，產(chǎn)生耐藥的有58例，總耐藥率為52.73%。在58例耐藥的患者中有 32例發(fā)生了rt180M+rt204I/V混合位點(diǎn)突變，占55.17%，12例（20.69%）獨(dú)立發(fā)生了rt204I位點(diǎn)突變，11例（18.97%）獨(dú)立發(fā)生了rt181V位點(diǎn)突變，提示rt180M+rt204I/V混合位點(diǎn)突變?cè)诨颊咧休^為普遍，這與戚應(yīng)杰等[9]報(bào)道相似。他們研究的rt180M+rt204I/V混合位點(diǎn)突變占總耐藥例數(shù)41.9%，該研究的比例比他們略高，這可能與研究的人群不同有關(guān)。由此可見，經(jīng)核苷（酸）類似物治療CHB，停藥后復(fù)發(fā)的患者耐藥突變發(fā)生率較高。在本研究中，患者發(fā)生耐藥的比例高低依次是LMV（52.73%），LDT（22.73%），ADV（14.55%），這與戴明佳等[10]報(bào)道基本一致。徐州地區(qū)的汪莉萍等[11]研究了抗病毒治療前的自然耐藥變異，100例CHB患者中發(fā)生自然耐藥的有21例，發(fā)生率為21%，其中ADV 12例（12%），LMV 7例（7%），ETV 2例（2%）。本研究對(duì)象是經(jīng)抗病毒藥物治療后停藥復(fù)發(fā)的人群，LAM和LDT的耐藥比例上升很明顯，ADV略有升高。以上結(jié)果均提示在抗病毒藥物的選擇壓力作用下，使得HBV基因組RT區(qū)的變異頻率大大增強(qiáng)。24例患者對(duì)LMV和LDT耐藥，比例是21.82%；14例對(duì)LMV和ADV雙重耐藥，比例是12.73%；2例對(duì)LMV、LDT、ADV多重耐藥，比例是1.82%。LMV的耐藥突變位點(diǎn)臨床多見的主要是rtL180M+rtM204V/I，其中 rtM204V/I又稱為YMDD變異，以rtM204I更為多見。如應(yīng)用拉米夫定治療1、2、3、4年后，YMDD變異率在分別為14%、38%、49%、66%。拉米夫定是我國最早和應(yīng)用較廣泛的核苷類抗乙肝病毒藥物，rt204M發(fā)生YMDD變異而引起病毒學(xué)突破和生化指標(biāo)反彈，導(dǎo)致其抗病毒治療失敗。此外，有4例患者單獨(dú)出現(xiàn)了rtL180M突變，未出現(xiàn)rtM204V/I變異，而有1例單獨(dú)出現(xiàn)rtM204V變異，這與蔣貝等[3]研究不同，他們報(bào)道的是LAM耐藥突變類型中，所有的rtM204V會(huì)聯(lián)合rtLl80M共同發(fā)生突變。這也許說明了YMDD變異患者除在rtM204發(fā)生變異外，rtL180M有原發(fā)性和補(bǔ)償性變異[12]，這些變異與HBV復(fù)制及藥物耐藥的關(guān)系究竟如何有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。ETV具有高耐藥基因屏障，至少需要3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變方可構(gòu)成耐藥。其耐藥機(jī)制通過二次打擊發(fā)生，即在rtM204I/V（±rtL180M）基礎(chǔ)上，加上以下一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)包括B區(qū)rtI169T或rtT184S/G、C區(qū)rtS202I/G和E區(qū)rtM250V[13]。已證實(shí)rtM204V/I會(huì)降低HBV對(duì)ETV的敏感性[10]。ETV在NA初治患者中的耐藥發(fā)生率很低，最初只在對(duì) LAM耐藥的患者中出現(xiàn)，有研究顯示應(yīng)用 ETV 3 年累積耐藥率僅為1.7%～3.3%，但有LAM治療失敗史的患者其耐藥發(fā)生率明顯增高[9]。本研究共檢出43例存在ETV耐藥風(fēng)險(xiǎn)的患者，檢出率39.09%，其都伴隨LAM耐藥，變異組合模式主要為rt180M+rt204V、rt204I、rt180M+rt204I。rt181 位點(diǎn)單一氨基酸改變即可能導(dǎo)致LAM 和 ADV 交叉耐藥，本文檢出11例rtA181V 獨(dú)立突變。endprint

本研究進(jìn)行了影響HBV RT區(qū)基因耐藥突變的因素分析，結(jié)果顯示年齡、性別、基因型與HBV發(fā)生耐藥突變無關(guān)（P > 0.05）。戴明佳等[10]也研究了195例患者既往有明確的應(yīng)用NA史，B、C基因型間耐藥發(fā)生率無明顯差（P > 0.05）。

HBV可分為A～J 10種基因型[5]，基因型具有明顯的地理分布特點(diǎn)，我國南方以B型多見，北方以C型為主，少數(shù)民族地區(qū)可見到一定比例的A型和D型[5，14-15]。在本研究中基因型檢出情況與本地區(qū)的戴明佳等[10]報(bào)道相似，他們檢出C型93.92%，表明在本地區(qū)經(jīng)診療的CHB患者HBV基因型以C型為主，主要是單基因型HBV感染，這與已有報(bào)道結(jié)果基本一致[16]。研究報(bào)道[17-19]，感染HBV C基因型患者比感染B基因型更容易出現(xiàn)嚴(yán)重的肝臟疾病，發(fā)生肝硬化和肝細(xì)胞癌的概率較高，且臨床預(yù)后較差。

綜上所述，經(jīng)核苷（酸）類藥物治療的CHB患者停藥復(fù)發(fā)后，盡早檢測(cè)耐藥變異，依據(jù)世界衛(wèi)生組織指南[20]及時(shí)調(diào)整治療方案，這對(duì)控制病情進(jìn)展，減少病毒突破乃至反彈對(duì)機(jī)體造成的再次打擊相當(dāng)重要。

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