妊娠合并糖尿病與母胎缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的關(guān)系

連亞婉吳青顏建英

1.福建省惠安縣醫(yī)院婦產(chǎn)科 362100；2.福建省立醫(yī)院婦產(chǎn)科 350001；3.福建省婦幼保健院婦產(chǎn)科 350001

妊娠合并糖尿病與母胎缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的關(guān)系

連亞婉1吳青2顏建英3*

1.福建省惠安縣醫(yī)院婦產(chǎn)科 362100；2.福建省立醫(yī)院婦產(chǎn)科 350001；3.福建省婦幼保健院婦產(chǎn)科 350001

目的：探討母血清HIF-1α、胎盤HIF-1α mRNA與妊娠合并糖尿病血糖控制情況的關(guān)系。方法：收集37ˉ40周孕產(chǎn)婦共75人，其中糖尿病合并妊娠組（n=15人），妊娠期糖尿病組（n=30人）和正常妊娠孕婦（n=30人），ELISA方法測(cè)定母血清HIF-1 α，RT-PCR法檢測(cè)胎盤HIF-1α mRNA水平。結(jié)果：3組患者年齡、孕周的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。糖尿病合并妊娠組血清HIF-1α、胎盤HIF-1α mRNA為78.42±11.85pg/L、0.43±0.12，明顯大于妊娠期糖尿病組（58.68±18.10 pg/L，P=0.000、0.23±0.06，P=0.000）和正常糖耐量組（47.96±12.79 pg/L，P=0.000、0.19±0.08，P=0.000）。妊娠期糖尿病組血清HIF-1α、胎盤HIF-1α mRNA大于正常妊娠組，P值分別為0.01、0.021，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：糖尿病合并妊娠組血糖控制差，血清HIF-1α、胎盤HIF-1α mRNA最高，母血清HIF-1α能反映妊娠合并糖尿病的嚴(yán)重程度。

糖尿病合并妊娠；妊娠期糖尿??；缺氧誘導(dǎo)因子

妊娠合并糖尿病，包括糖尿病合并妊娠（Pregestational diabetes mellitus，PGDM）和妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus，GDM），前者為已有糖尿病的患者妊娠，而妊娠期糖尿病是指在妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的對(duì)葡萄糖的不耐受，其特征為高血糖，對(duì)母兒的危害程度與血糖水平密切相關(guān)[1]。

高血糖導(dǎo)致葡萄糖氧化及氧耗增加，進(jìn)而導(dǎo)致胎兒體內(nèi)血氧消耗過(guò)度而缺氧[2]。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）是統(tǒng)屬bHLH.PAS家族，分為HIF-1、HIF-2、HIF-3，HIF-1是當(dāng)前唯一發(fā)現(xiàn)在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的敏感的轉(zhuǎn)錄因子，它與靶基因結(jié)合，如促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血紅素加氧酶-1等基因，通過(guò)促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與機(jī)體對(duì)缺氧的反應(yīng)，引起多種病理生理反應(yīng)[3，4]。

本文旨在研究母血清HIF-1α、胎盤HIF-1α mRNA與妊娠合并糖尿病血糖控制情況的關(guān)系，初探母血清HIF-1α能否反映妊娠合并糖尿病的嚴(yán)重程度，并為妊娠合并糖尿病的機(jī)制研究做鋪墊。

1.資料與方法

1.1 收集2014年6月至2015年3月到惠安縣醫(yī)院婦產(chǎn)科、福建

省立醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的 37～40周孕產(chǎn)婦。所有研究對(duì)象孕周計(jì)算無(wú)誤。分組如下：

A組：糖尿病合并妊娠組（n=15人），孕前或早孕期診斷糖尿病，孕期未監(jiān)控血糖者或者血糖控制不良者。

B組：妊娠期糖尿病組（n=30人），孕24-28周，糖耐量試驗(yàn)診斷妊娠期糖尿病的患者；孕期嚴(yán)格監(jiān)控血糖，血糖控制良好者。C組：正常妊娠孕婦（n=30人），正常糖耐量組。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

①全部對(duì)象都是單胎自然妊娠。

②妊娠期糖尿病、糖尿病合并妊娠的診斷必須符合標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病合并妊娠的診斷：早孕期或孕前行FPG檢查，禁食8-12小時(shí)，最后查空腹血糖如FPG≥7.0 mmol/L，或HbA1C≥6.5，或任意血糖≥11.1mmol/L，且有糖尿病癥狀。妊娠期糖尿病的診斷：孕24-28周，禁食8-12小時(shí)，次日晨在5分鐘內(nèi)口服75 g葡萄糖，OGTT診斷界值為空腹、服糖后1h和2h的血糖值分別為5.1mmol/L，10.0mmol/L和8.5mmol/L。

③入院患者簽署知情同意書，遵循知情和自愿的原則。

④排除孕婦同時(shí)存在妊娠期或分娩期的并發(fā)癥，例如前置胎盤、胎盤早剝、胎兒窘迫等疾病。

⑤排除孕婦同時(shí)合并有外科的或內(nèi)科其他疾病，如原發(fā)性高血壓、心臟病、腎炎、肝炎、貧血等。

1.3 血糖控制的評(píng)價(jià)

①血糖控制良好標(biāo)準(zhǔn)：孕28周以后監(jiān)測(cè)血糖輪廓（三餐后2小時(shí)、睡前），血糖正常次數(shù)達(dá) 80%以上血糖控制標(biāo)準(zhǔn)：餐前血糖＜5.6mmol/L，餐后2小時(shí)血糖＜6.7mmol/L。

②血糖控制不良標(biāo)準(zhǔn)：在孕28周以后每周血糖輪廓（三餐后2小時(shí)、睡前）正常次數(shù)少于 80%；或孕期未監(jiān)測(cè)血糖，入院時(shí)查監(jiān)測(cè)血糖正常次數(shù)少于80%。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

①血清 HIF-1α檢測(cè) 所有患者均于清晨空腹抽取外周靜脈血5ml，3000r/min，離心5min，取上層血清于試管中，-70℃保存。采用ELISA方法測(cè)定母血清 HIF-1α，試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物工程有限公司，嚴(yán)格按操作說(shuō)明書測(cè)定。

②胎盤 HIF-1α mRNA檢測(cè) 從胎盤母體面臍帶對(duì)側(cè)取約100mg胎盤組織，采用RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，USA），并且檢測(cè)RNA的完整性及純度。構(gòu)建熒光PCR反應(yīng)體系25μL，含2×Power SYBR? Green PCR Master Mix 12.5μL、上游引物 F（10pmol/ μL）0.5μL、下游引物 R（10pmol/μL）0.5μL（和HIF-1α引物：5 ’ CCATTAGAAAGCAGTTCCGC3 ’ ， 5 ’TGGGTAGGAGATGGAGATGC3’；產(chǎn)物194bp；β-actin引物：5’TTCCAGCCTTCCTTCCTGG3’，5’TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT3’產(chǎn)物224 bp）（引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）、cDNA模板2μL、ddH2O 9.5μL。反應(yīng)條件為：95℃3分鐘，然后 94℃50秒，55℃45 秒，72℃1分鐘共 45 循環(huán)。采用BIO-RAD全定量PCR儀檢測(cè)。以β-actin基因作為內(nèi)參照，分析各反應(yīng)的熒光強(qiáng)度得出CT值，并繪制β-actin 基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出目的基因的相對(duì)反應(yīng)起始拷貝數(shù)。陰性對(duì)照以蒸餾水加入擴(kuò)增體系，以β-actin基因作為內(nèi)參照進(jìn)行 PCR，用分析各反應(yīng)的熒光強(qiáng)度得出CT值，并繪制 β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出目的基因的相對(duì)反應(yīng)起始拷貝數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以 x ± s表示，糖尿病合并妊娠組、妊娠期糖尿病組和正常糖耐量組兩兩比較用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.結(jié)果

3組患者年齡、孕周的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。糖尿病合并妊娠組血清HIF-1α、胎盤HIF-1α mRNA為78.42±11.85pg/L、0.43±0.12，明顯大于妊娠期糖尿病組（58.68±18.10 pg/L，P=0.000、0.23±0.06，P=0.000）和正常糖耐量組（47.96±12.79 pg/L，P=0.000、0.19±0.08，P=0.000）。妊娠期糖尿病組血清 HIF-1α、胎盤 HIF-1 α mRNA大于正常糖耐量組，P值分別為0.01、0.021，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 3組一般資料及血清HIF-1α、胎盤HIF-1α mRNA的比較

3.討論

妊娠期糖尿病孕婦發(fā)生死胎風(fēng)險(xiǎn)是正常孕婦的 4-6倍，新生兒死亡的風(fēng)險(xiǎn)是正常孕婦的 2-4倍。大多數(shù)圍生兒死亡的原因不明，臨床及實(shí)驗(yàn)研究均認(rèn)為高胰島素、高血糖導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)缺氧，可能是妊娠期糖尿病不良圍生結(jié)局的原因[5，6]。

對(duì)于宮內(nèi)缺氧狀況的評(píng)估有多種方法，胎盤組織缺氧病理改變、EPO、HIF-1α，VEGF等均被認(rèn)為是胎盤胎兒宮內(nèi)缺氧的標(biāo)志物或方法，但是沒(méi)有統(tǒng)一的金標(biāo)準(zhǔn)。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）是統(tǒng)屬 bHLH.PAS家族，根據(jù)不同的亞單位結(jié)構(gòu)分為HIF-1、HIF-2、HIF-3，目前 HIF-1是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。HIF-1是當(dāng)前唯一發(fā)現(xiàn)在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的敏感的轉(zhuǎn)錄因子，因此其較EPO具有更高的研究?jī)r(jià)值；其廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物及人體各種組織細(xì)胞，妊娠期滋養(yǎng)細(xì)胞和胎盤也存在 HIF-1表達(dá)和分泌。HIF-1由α亞基和β亞基組成，HIF-1α是主要活性調(diào)節(jié)因子，它與靶基因結(jié)合，如促紅細(xì)胞生成素（EPO）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血紅素加氧酶（HO）-1等基因，通過(guò)促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與機(jī)體對(duì)缺氧的反應(yīng)，引起多種病理生理反應(yīng)[3，4]。

HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種基因的表達(dá)，進(jìn)而參與多項(xiàng)生理過(guò)程包括EPO的生成、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、血管生成（VEGF的表達(dá)）和糖代謝等等，HIF是胚胎發(fā)育的重要調(diào)控因子。妊娠期母體高血糖狀態(tài)導(dǎo)致氧耗增加，胎兒高血糖、高胰島素狀態(tài)，使葡萄糖氧化代謝增多，ROS相應(yīng)增多，進(jìn)而觸發(fā)HIF的產(chǎn)生[7，8]。所以，高血糖、高胰島素血癥導(dǎo)致缺氧狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)胎兒產(chǎn)生一系列圍生期的多臟器影響，而HIF可能是這些病理生理改變的重要路徑。

本實(shí)驗(yàn)糖尿病合并妊娠組血清 HIF-1α、胎盤 HIF-1α mRNA為明顯大于妊娠期糖尿病組和正常糖耐量組。妊娠期糖尿病組血清HIF-1α、胎盤 HIF-1α mRNA大于正常糖耐量組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢?jiàn)糖尿病合并妊娠組血糖控制最差，其血清HIF-1α、胎盤HIF-1α mRNA最高，母血清HIF-1α能反映妊娠合并糖尿病的嚴(yán)重程度，且與胎盤HIF-1α mRNA具有較好的一致性。

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