青藤堿對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎組織Fas/FasL蛋白表達(dá)水平影響的探討

呂興華，冷玉芳，楊艷妮，蘇玉潔，王朋，鄭貫崢

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅蘭州730000）

青藤堿對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎組織Fas/FasL蛋白表達(dá)水平影響的探討

呂興華，冷玉芳*，楊艷妮，蘇玉潔，王朋，鄭貫崢

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅蘭州730000）

目的探討青藤堿對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎組織Fas、FasL蛋白表達(dá)水平的影響。方法選取健康雄性Wistar大鼠72只，體重180～220 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組）、空白給藥組（SS組）、腎缺血再灌注損傷模型組（I/R組）、青藤堿組（SIN組），每組18只。I/R組、SIN組游離雙側(cè)腎蒂，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎腎蒂，使左腎缺血，45分鐘后松開(kāi)動(dòng)脈夾再灌注，并即刻切除右腎，建立腎缺血再灌注損傷模型。S組、SS組僅游離雙側(cè)腎蒂，不夾閉左腎腎蒂。SIN組、SS組于缺血后15分鐘（即再灌注前30分鐘）向腹腔注射青藤堿注射液60mg/kg，I/R組、S組于同一時(shí)間向腹腔注射等量生理鹽水。再灌注后6小時(shí)（T1）、12小時(shí)（T2）、24小時(shí)（T3）穿刺心臟采血，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清Cr、BUN濃度；摘除左腎，光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化，用免疫組化法檢測(cè)腎組織Fas、FasL蛋白表達(dá)水平，用TUNEL法檢測(cè)并計(jì)算腎小管上皮細(xì)胞凋亡率。結(jié)果S組與SS組大鼠在T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度，F(xiàn)as、FasL蛋白表達(dá)水平，腎小管上皮細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組、SIN組T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度升高（P＜0．05），腎組織病理?yè)p傷加重，腎組織Fas、FasL蛋白表達(dá)水平升高（P＜0．05），腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度降低（P＜0．05），腎組織病理?yè)p傷減輕，腎組織Fas、FasL蛋白表達(dá)水平下降（P＜0．05），腎小管上皮細(xì)胞凋亡率下降（P＜0．05）；與T2比較，I/R組和SIN組T3的Fas蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．05）。結(jié)論青藤堿可顯著降低大鼠腎I/R病理過(guò)程中Fas、FasL蛋白的表達(dá)水平，從而減少腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，有助于減輕I/R時(shí)腎臟的損傷。

青藤堿；腎臟；缺血再灌注損傷；Fas蛋白；FasL蛋白

腎臟是機(jī)體的高灌注器官，對(duì)缺血缺氧十分敏感，休克、創(chuàng)傷、腎移植等均可導(dǎo)致腎缺血再灌注損傷（I/R）。研究發(fā)現(xiàn)，I/R的發(fā)生發(fā)展與凋亡、炎癥、自由基生成等機(jī)制密切相關(guān)[1－2]。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，是促進(jìn)凋亡和抑制凋亡相互平衡的結(jié)果。而Fas/FasL被認(rèn)為是參與細(xì)胞凋亡的重要因子[3－4]。研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿（SIN）對(duì)大鼠I/R具有保護(hù)作用[5－6]，但SIN能否通過(guò)抑制Fas/FasL的表達(dá)從而抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以大鼠腎I/R模型為基礎(chǔ)，以青藤堿（SIN）作為干預(yù)手段，測(cè)定腎臟組織中Fas、FasL蛋白表達(dá)水平的變化，現(xiàn)介紹如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇健康雄性Wistar大鼠72只（由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供），體重180～220 g，飼養(yǎng)溫度23℃～25℃，相對(duì)濕度55%～60%，自由進(jìn)食水。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（S組）、空白給藥組（SS組）、腎缺血再灌注損傷模型組（I/R組）、青藤堿組（SIN組），每組18只。

1.2 方法

本研究參照Basile DP、姚愛(ài)軍等[7－8]的實(shí)驗(yàn)方法制備大鼠腎缺血再灌注損傷模型。向I/R組及SIN組大鼠腹腔注射10%水合氯醛350mg/kg麻醉，俯臥位固定，備皮、消毒，于脊柱旁1．0 cm、肋緣下0．5 cm取約1．5 cm的切口，游離雙側(cè)腎蒂，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎腎蒂，腎臟由紅色變?yōu)榘岛稚硎救毖晒?，缺?5分鐘后松開(kāi)左腎動(dòng)脈夾并立即切除右腎，左腎由暗褐色轉(zhuǎn)為紅色表示再灌注成功。S組及SS組大鼠僅游離雙側(cè)腎蒂，用生理鹽水紗布覆蓋切口，45分鐘后切除右腎。4組切除右腎后均行碘伏消毒，逐層縫合切口，敷以青霉素粉預(yù)防感染。SIN組、SS組于缺血后15分鐘（即再灌注前30分鐘）向腹腔注射青藤堿注射液（規(guī)格：2 ml：50 mg；批號(hào)：1312417－019；湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)）60mg/kg，S組、I/R組于同一時(shí)間向腹腔注射等量生理鹽水。

各組分別于再灌注6小時(shí)（T1）、12小時(shí)（T2）、24小時(shí)（T3）隨機(jī)選取大鼠6只，向腹腔注射10%水合氯醛350mg/kg，麻醉后打開(kāi)腹腔，穿刺心臟采血3～5m l，并摘除左腎。血標(biāo)本3 000r/min離心10分鐘，取上清液，用全自動(dòng)生化分析儀（LX20，Beckman Coulter）測(cè)定血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）濃度。腎臟標(biāo)本用10%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片（3μm）。隨機(jī)選取每個(gè)腎臟標(biāo)本的切片2張用于HE染色，光鏡（×400，Olympus）下觀察大鼠腎臟病理變化。

采用非生物素二步免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腎臟Fas、FasL蛋白表達(dá)水平。切片脫蠟至水，檸檬酸鈉抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加Fas、FasL兔抗大鼠多克隆抗體（批號(hào)分別為：BA0484、BA0049，濃度分別為1∶400、1∶50，武漢博士德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），4℃分別孵育16小時(shí)、18小時(shí)，滴加山羊抗兔二抗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染、返藍(lán)，脫水、二甲苯透明、樹(shù)脂封片。光鏡下觀察胞漿出現(xiàn)棕黃色顆?；虬它S染表示陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，采用Image－Pro Plus 6．0圖像分析處理軟件（Media Cybernetics公司生產(chǎn)）測(cè)定Fas、FasL的積分光密度（IOD），取其平均值。

采用TUNEL檢測(cè)試劑盒（Promega公司生產(chǎn)，美國(guó)）測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。石蠟切片脫蠟至水，用蛋白酶K消化，于37℃濕盒中孵育30分鐘，將Equilibration Buffer 98μl、Biotinylated Nucleotide Mix 1μl混合液覆蓋于樣本反應(yīng)區(qū)域，于37℃濕盒中孵育60分鐘。玻片放入20×SSC溶液的染色缸中終止反應(yīng)，室溫放置15分鐘，滴加3%H2O2，30分鐘后加入稀釋的抗生物素蛋白鏈菌素辣根過(guò)氧化物酶溶液，室溫反應(yīng)30分鐘，DAB顯色，封片。在光學(xué)顯微鏡（×400，Olympus公司生產(chǎn)，日本）下觀察、拍照，棕黃色為陽(yáng)性。采用Image－Pro Plus 6．0圖像分析處理軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5張切片，每張切片隨機(jī)選取腎皮質(zhì)部5個(gè)不同視野，取其平均值，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)× 100%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清Cr、BUN濃度

S組與SS組大鼠T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組、SIN組大鼠T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組大鼠T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度降低（P＜0．05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清Cr、BUN濃度比較

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清Cr、BUN濃度比較

注：與S組比較，bP＜0．05；與I/R組比較，cP＜0．05

42．4±5．1 42．4±6．9 187．0±24．5b160．7±33．6bc9．5±1．3 9．2±2．2 36．7±8．6b27．4±4．7bc指標(biāo)Cr（μmol/L）組別T1T2T3BUN（mmol/L）S組SS組I/R組SIN組S組SS組I/R組SIN組43．5±4．8 44．5±4．0 123．3±18．5b106．8±17．0bc9．2±0．8 9．5±0．8 21．5±2．8b17．8±5．8bc43．5±5．2 41．6±4．2 137．6±26．3b113．9±23．3bc9．3±1．1 9．3±0．8 28．6±8．6b22．5±4．0bc

2.2 病理變化

S組、SS組大鼠T1、T2、T3僅見(jiàn)少許腎小管上皮細(xì)胞水腫、小管擴(kuò)張，腎小球毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張充血。I/R組大鼠T1、T2、T3部分腎小球囊腔擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落至管腔，管腔內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型，腎小管上皮細(xì)胞核固縮、濃染、碎裂，凋亡小體形成；胞漿變性，間質(zhì)充血、水腫明顯，并有散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。SIN組大鼠T1、T2、T3腎小管上皮細(xì)胞壞死較I/R組輕，少許管腔可見(jiàn)蛋白管型，間質(zhì)充血、水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。各組大鼠腎臟組織HE染色圖片見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色圖片

2.3 Fas、FasL蛋白表達(dá)水平

S組與SS組大鼠T1、T2、T3的Fas、FasL蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組、SIN組大鼠T1、T2、T3的Fas、FasL蛋白表達(dá)水平升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組大鼠T1、T2、T3的Fas、FasL蛋白表達(dá)水平降低（P＜0．05）；I/R組和SIN組T3的Fas蛋白表達(dá)水平高于T2（P＜0．05），見(jiàn)表2。各組大鼠腎臟Fas、FasL蛋白表達(dá)免疫組化圖片見(jiàn)圖2～3。

表2 各組大鼠腎臟不同時(shí)間點(diǎn)Fas、FasL蛋白表達(dá)水平比較

表2 各組大鼠腎臟不同時(shí)間點(diǎn)Fas、FasL蛋白表達(dá)水平比較

注：與S組比較，bP＜0．05；與I/R組比較，cP＜0．05；與T2比較，dP＜0．05

61．3±15．1 64．6±13．8 1940．1±727．2bd1369．7±445．8bcd49．2±11．9 48．0±12．2 1186．8±263．2b969．7±220．8bc指標(biāo)Fas T1T2T3FasL組別S組SS組I/R組SIN組S組SS組I/R組SIN組52．7±11．1 61．2±14．6 1 054．8±169．8b877．7±167．7bc44．3±10．7 49．2±10．8 988．1±218．9b811．0±158．9bc62．6±20．9 52．6±14．4 1202．1±299．2b975．6±184．7bc48．6±13．0 44．2±8．4 1018．8±130．2b900．1±88．6bc

圖2 各組大鼠腎臟Fas蛋白表達(dá)免疫組化圖片

圖3 各組大鼠腎臟FasL蛋白表達(dá)免疫組化圖片

2.4 腎小管上皮細(xì)胞凋亡率

S組與SS組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組和SIN組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率降低（P＜0．05）；與T2比較，I/R組和SIN組T3的細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．05），見(jiàn)表3。各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)圖4。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的比較

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的比較

注：與S組比較，bP＜0．05；與I/R組比較，cP＜0．05；與T2比較，dP＜0．05

3．5±0．9 3．9±1．2 27．5±1．7bd15．9±2．1bcd組別S組SS組I/R組SIN組T1T2T33．0±0．5 2．9±0．9 9．8±0．6b7．1±0．4bc3．3±1．2 3．8±1．6 15．7±0．8b9．8±0．6bc

圖4 各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況

3 討論

本研究采用左腎缺血期間保留右腎，左腎再灌注時(shí)即刻切除右腎以避免右腎代償?shù)姆椒ㄖ苽浯笫竽I缺血再灌注損傷模型。結(jié)果表明，I/R組大鼠在再灌注6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)的血清Cr、BUN濃度升高，病理?yè)p傷明顯，說(shuō)明腎缺血再灌注損傷模型制備成功。本研究參考文獻(xiàn)[9]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇腎缺血后15分鐘（即再灌注前30分鐘）向腹腔注射青藤堿60 mg/kg進(jìn)行研究。

腎臟I/R的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制涉及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡、自由基生成等機(jī)制，并有眾多炎性介質(zhì)和免疫因子的參與[1－2]。Fas蛋白是神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（NGFR）和腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族成員之一，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，膜外是富含絲氨酸的功能域，膜內(nèi)是傳遞凋亡信號(hào)所必需的死亡結(jié)構(gòu)域（DD），因此Fas又被稱(chēng)為死亡分子；FasL屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族，是一種分子量為40 KD的Ⅱ型跨膜蛋白[10]。Fas與其配體FasL結(jié)合形成同源三聚體，并與其他具有死亡結(jié)構(gòu)域（DD）同源區(qū)的周?chē)鞍踪|(zhì)結(jié)合形成死亡起始信號(hào)復(fù)合體（DISC），通過(guò)一系列途徑激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，同時(shí)降解DNA損傷修復(fù)酶及細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白[11]，并激活Caspase酶聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞骨架破壞、DNA斷裂，致使細(xì)胞凋亡[12－14]。

青藤堿是從防己科植物毛青藤的干燥藤莖中提取的異喹啉類(lèi)生物堿單體，具有免疫抑制、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[5，15－16]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠腎臟I/R為基礎(chǔ)，以青藤堿為干預(yù)治療措施，觀察到以下情況：（1）用青藤堿處理后，與S組相比，SS組大鼠血清Cr及BUN濃度無(wú)明顯變化（P＞0．05），說(shuō)明該劑量青藤堿對(duì)正常大鼠腎功能無(wú)明顯影響；而SIN組大鼠T1、T2、T3的腎小管上皮細(xì)胞壞死較I/R組輕，少許管腔可見(jiàn)蛋白管型，間質(zhì)充血、水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，說(shuō)明青藤堿對(duì)大鼠腎臟具有保護(hù)作用。研究顯示，青藤堿可通過(guò)調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞Caspase－3、Bcl－2、Bax蛋白的表達(dá)，抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡[17]。（2）S組與SS組大鼠Fas、FasL蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），而I/R組大鼠Fas、FasL蛋白表達(dá)水平與S組比較，明顯增多（P＜0．05），且I/R組再灌注24小時(shí)的Fas蛋白表達(dá)水平比再灌注12小時(shí)高（P＜0．05），說(shuō)明當(dāng)腎臟組織發(fā)生缺血再灌注時(shí)，F(xiàn)as、FasL蛋白表達(dá)水平明顯升高，其參與了I/R的發(fā)生。（3）用青藤堿處理后，與I/R組相比，SIN組再灌注6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)大鼠Fas、FasL蛋白表達(dá)水平下降（P＜0．05），腎小管上皮細(xì)胞凋亡率下降（P＜0．05），說(shuō)明青藤堿可抑制大鼠腎臟Fas、FasL蛋白的表達(dá)，減少死亡起始信號(hào)復(fù)合體（DISC）的合成，抑制了一系列細(xì)胞凋亡的激活途徑，減輕腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。有關(guān)青藤堿下調(diào)Fas、FasL蛋白表達(dá)水平的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，青藤堿可通過(guò)抑制大鼠腎I/R過(guò)程中Fas、FasL蛋白的表達(dá)，從而降低腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，減輕了I/R時(shí)腎臟的損傷。

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（*通訊作者：冷玉芳）

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1671－1246（2017）18－0157－03