澤蘭中迷迭香酸含量測(cè)定方法學(xué)研究△

相婷，吳麗真，王紹青，鄭璐

(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司 國(guó)家中醫(yī)藥管理局 中藥質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225321)

·基礎(chǔ)研究·

澤蘭中迷迭香酸含量測(cè)定方法學(xué)研究△

相婷，吳麗真，王紹青，鄭璐*

(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司 國(guó)家中醫(yī)藥管理局 中藥質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225321)

目的：建立澤蘭中迷迭香酸的含量測(cè)定方法，為《歐洲藥典》澤蘭專論的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供研究數(shù)據(jù)。方法：采用高效液相色譜法?；跇悠诽崛『蜕V條件的優(yōu)化結(jié)果建立迷迭香酸的分析方法，同時(shí)對(duì)該方法進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，包括采用單變量分析(OVAT)進(jìn)行方法的耐用性研究及按照《歐洲藥典》的方法測(cè)定該色譜系統(tǒng)的滯留體積。結(jié)果：迷迭香酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為5.02～60.30 μg·mL-1(r=0.999 9)；加樣回收率為95.5%～101.6%，RSD=2.1%(n=9)；重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性及耐用性試驗(yàn)的RSD均小于3.0%；該色譜系統(tǒng)滯留體積為 2.4 mL。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性、準(zhǔn)確度及耐用性良好，可作為澤蘭中迷迭香酸的含量測(cè)定方法列入《歐洲藥典》澤蘭專論的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。

高效液相色譜法；澤蘭；迷迭香酸；方法學(xué)；歐洲藥典

澤蘭為唇形科植物毛葉地瓜兒苗LycopuslucidusTurcz.var.hirtusRegel.的干燥地上部分，臨床上主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、痛經(jīng)、產(chǎn)后出血腹痛及水腫。文獻(xiàn)表明，澤蘭的主要化學(xué)成分包括黃酮類、酚酸類、萜類和甾體類等[1]。迷迭香酸是澤蘭中的主要活性成分之一，表現(xiàn)出多種生物活性，如抗氧化[2]、抗炎[3]、抑制疼痛[4]、抗血栓和抗血小板凝集[5]、心肌保護(hù)[6]、抗抑郁[7]、神經(jīng)保護(hù)[8]及抗腫瘤[9]等。因此，本研究選取迷迭香酸作為特征性成分，建立其在澤蘭中的含量測(cè)定方法，用于澤蘭藥材的質(zhì)量控制；同時(shí)為歐洲藥典澤蘭專論的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供研究數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀，包括四元泵(G1311C)、柱溫箱(G1316A)、自動(dòng)進(jìn)樣器(G1329B)、DAD紫外檢測(cè)器(G1315D)和Openlab色譜工作站(美國(guó)安捷倫公司)；XS-205DU型十萬分之一天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 藥材與試劑

澤蘭藥材共8批次,產(chǎn)地分雖為河南、山東、天津、江蘇，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李會(huì)軍教授鑒定為正品；迷迭香酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111871-201404，純度：98.6%)；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：月旭Ultimate XB-C18(250 mm×4.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：磷酸-乙腈-水(1∶19∶80，V/V/V)，流動(dòng)相B：磷酸-甲醇-乙腈(1∶40∶59，V/V/V)；梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～20 min，100%A→70%A，20～25 min，70%A→0%A，25～30 min，0%A→100%A；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶液 70%甲醇水溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液 取迷迭香酸對(duì)照品10.0 mg，精密稱定，置于20 mL容量瓶中，用70%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液1 mL，70%甲醇水溶液稀釋定容至25 mL，即得。

2.2.3 供試品溶液 取澤蘭藥材粉末(過50目篩)約1.00 g，精密稱定，置于具塞容量瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇水溶液后稱重，然后在92 ℃條件下加熱回流30 min，冷卻后補(bǔ)足損失的重量，搖勻，過濾，收集續(xù)濾液，精密量取上述續(xù)濾液2 mL，70%甲醇水溶液稀釋定容至10 mL，進(jìn)樣前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.2.4 空白供試品溶液 不加入澤蘭藥材，按照2.2.3方法制備，即得。

2.2.5 混合溶液 分別量取適量的2.2.2和2.2.3項(xiàng)下溶液，以1∶1體積等量混合，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按照2.2方法分別制備得到空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜，見圖1。結(jié)果顯示對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣5針，峰面積的RSD=0.27%，對(duì)照品和供試品溶液中迷迭香酸色譜峰的對(duì)稱因子在0.95～1.05，理論塔板數(shù)均不小于50 000，迷迭香酸色譜峰與前后雜質(zhì)峰分離度均大于1.50，提示該色譜系統(tǒng)系統(tǒng)適用性良好。

注：A.空白溶液；B.迷迭香酸對(duì)照品；C.供試品溶液。圖1 澤蘭及其對(duì)照品高效液相色譜圖

2.4 專屬性試驗(yàn)

按照2.2方法分別制備得到空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白供試品溶液和對(duì)照品供試品混合溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果顯示空白溶液和空白供試品溶液對(duì)主色譜峰無干擾，對(duì)照品供試品混合溶液中主色譜峰無裂分現(xiàn)象，提示該方法專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察

2.5.1對(duì)照品線性關(guān)系考察 取迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加入70%甲醇水溶解并定容，作為母液。分別精密量取適量上述母液，稀釋配制成濃度為5.02、10.05、20.10、25.12、50.25、60.30 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得回歸方程Y=62.678 8X-3.463 9(r=0.999 9)。結(jié)果表明，迷迭香酸在5.02～60.30 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.5.2供試品線性關(guān)系考察 分別取澤蘭藥材粉末(過50目篩)約0.20 g、0.40 g、0.80 g、1.00 g、1.50 g和2.00 g，精密稱定，按照2.2.3方法制備得到一系列不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件分別對(duì)以上供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X，%)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得回歸方程Y=12.456 1X+29.790 1(r=0.999 8)。結(jié)果表明，供試品質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20.47%～200.96%線性關(guān)系良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取澤蘭藥材粉末(過50目篩)約0.50、1.00、1.50 g(相當(dāng)于50%、100%和150%3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平)各3份樣品，精密稱定。按照2.2.3方法制備得到9份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果迷迭香酸含量在低、中、高3個(gè)質(zhì)量百分比濃度水平下RSD值分別為0.76%、0.31%和0.70%，提示該方法重復(fù)性良好。

2.7 中間精密度試驗(yàn)

另外一名操作者取澤蘭藥材粉末(過50目篩)約1.00 g，平行6份樣品，精密稱定。按照2.2.3方法制備得到6份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件用另外一臺(tái)高效液相色譜儀Agilent 1200進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果兩名操作者在不同儀器上測(cè)得迷迭香酸含量的RSD=2.2%，提示該方法中間精密度良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的澤蘭藥材粉末(過50目篩)約0.50 g，平行9份樣品，分為3組，分別加入3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平(50%、100%和150%)的迷迭香酸對(duì)照品。按照2.2.3項(xiàng)下溶液制備方法制備得到9份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取2.2.2和2.2.3項(xiàng)下對(duì)照品和供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、18、24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果對(duì)照品和供試品峰面積的RSD值分別為0.12%和0.27%，提示對(duì)照品和供試品在70%甲醇溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 耐用性試驗(yàn)

本研究中耐用性試驗(yàn)是通過單變量分析法(OVAT)微調(diào)測(cè)試條件中的單個(gè)變量觀察結(jié)果的不受影響程度，改變的測(cè)試變量包括提取條件變量(提取溶劑比例)和色譜條件變量(流速、波長(zhǎng)和色譜柱)，結(jié)果表明該方法耐用性良好，具體數(shù)據(jù)見表2和表3。

表1 澤蘭中迷迭香酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 提取條件耐用性結(jié)果

表3 色譜條件耐用性結(jié)果

2.11 滯留體積的測(cè)定

按照《歐洲藥典》EP8.0“2.2.46”項(xiàng)下規(guī)定方法進(jìn)行測(cè)定[10]。

2.11.1 測(cè)定條件 peek管：1.35 m×0.18 mm；流動(dòng)相：水(A)-0.1%丙酮(B)；洗脫程序：0～20 min，100% A→0% A；20～30 min，0%A；流速：2.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm。

2.11.2 計(jì)算結(jié)果 滯留體積VD=tD×F(tD=t0.5-0.5tG，tG=20 min，F(xiàn)=2 mL·min-1，t0.5=11.2 min)=2.4 mL。

2.12 樣品含量測(cè)定

取8批次澤蘭樣品適量，按照2.2.3方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，雙樣雙針，記錄色譜并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 澤蘭樣品中迷迭香酸含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化

本研究考察了4種不同比例的提取溶劑(30%、50%、70%甲醇水溶液和100%甲醇)進(jìn)行提取，同時(shí)考察了不同提取方式(超聲、回流和振搖)、不同溶劑量(15、25、50 mL)和不同提取時(shí)間(15、30、45 min)對(duì)迷迭香酸含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取溶劑和提取方式對(duì)結(jié)果有較顯著的影響，而溶劑量和提取時(shí)間對(duì)含量結(jié)果影響較小，因此最終確定最佳提取條件為25 mL 70%甲醇水溶液、回流提取30 min。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水為流動(dòng)相時(shí)對(duì)色譜峰分離的效果，結(jié)果峰形均未達(dá)到要求，后又篩選出甲醇-乙腈-檸檬酸水作為流動(dòng)相，峰形能到得到較好改善，然而又出現(xiàn)保留時(shí)間過長(zhǎng)的問題。最終本文參考《歐洲藥典》香蜂草專論中迷迭香酸的色譜條件[10]，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化得到最佳色譜條件。

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性、準(zhǔn)確度及耐用性良好，可作為澤蘭中迷迭香酸的含量測(cè)定方法列入歐洲藥典澤蘭專論的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。

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ValidationofHPLCMethodforDeterminationofRosmarinicAcidinLycopiHerba

XIANGTing，WULizhen，WANGShaoqing，ZHENGLu*

[YangtzeRiverPharmaceutical(Group)Co.，Ltd.，TheNationalKeyInstituteofTCMQualityControl，
StateAdministrationofTraditionalChineseMedicineoftheP.R.China(NKI-TCM)，Taizhou，225321,China]

Objective：To establish a method for determination of rosmarinic acid in Lycopi Herba and provide research data for Lycopi Herba monograph recommended to European Pharmacopeia(EP).Methods：An HPLC method was established by optimizing different extraction and chromatographic conditions and totally validated.Meanwhile，One-variable-at-a-time(OVAT)method was applied in the robustness test，and dwell volume of the HPLC system was determined following the described method in EP.Results：It was shown that the method kept good linearity(r=0.999 9)in the concentration range of 5.02-60.30 μg·mL-1for rosmarinic acid.The recovery was in the range of 95.5%-101.6% with RSD value of 2.1%.RSDs of repeatability，intermediate precision，stability and robustness test were less than 3.0%，and the dwell volume was determined as 2.4 mL for the HPLC system.Conclusion：The method is simple，accurate and reliable with good repeatability and robustness，which could be selected as determination method of rosmarinic acid for the draft of Lycopi Herba monograph recommended to EP.

HPLC；Lycopi Herba；rosmarinic acid；methodology；European Pharmacopeia

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201307002)

] 鄭璐，高級(jí)工程師，研究方向：中藥歐盟質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究；Tel：(021)68128999，E-mail：zhenglu@yangzijiang.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.009

2016-06-23)

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