番石榴果實中總黃酮的提取及含量測定△

白麗麗，周紫夢，戴華

(1.海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，海南 ?？?571199)

·中藥工業(yè)·

番石榴果實中總黃酮的提取及含量測定△

白麗麗1，周紫夢1，戴華2*

(1.海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，海南 ?？?571199)

目的：采用正交試驗法優(yōu)選番石榴果實中總黃酮的提取工藝。方法：以提取的總黃酮含量為評價指標(biāo)，選擇醇的體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間和提取次數(shù)為考察因素，用正交試驗法確定黃酮的最佳提取工藝。通過分光光度法測定總黃酮的含量，檢測波長為508 nm。結(jié)果：最佳工藝為醇的體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶25，提取時間2.5 h，提取3次。蘆丁在8.24～50.42 mg·L-1具有良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為98.23%(RSD=1.36%)。總黃酮含量可達(dá)到1.54%。結(jié)論：確定的提取工藝簡單、易于操作，提取率高。建立的定量方法可用于番石榴總黃酮的測定。

番石榴；總黃酮；提取；正交試驗法

番石榴Psidium guajava L.，Guava.屬于桃金娘科番石榴屬，常綠多年生的灌木植物，在我國海南、廣東、廣西、福建等地區(qū)有栽種。番石榴葉子、果實均有藥用價值，我國傳統(tǒng)醫(yī)藥用來治療輕、中度糖尿病，已經(jīng)引起越來越多學(xué)者的關(guān)注[1-4]。番石榴葉中含有多種化學(xué)成分，具有抗糖尿病活性的主要有黃酮類、多酚和鞣質(zhì)類、萜類、甾體類等化學(xué)成分。黃酮類化合物廣泛存在于自然界，主要以黃酮苷的形式存在，具有毒性低、來源廣泛等優(yōu)點。已經(jīng)從番石榴葉中分離出的黃酮類化合物包括蘆丁、槲皮素、楊梅素、番石榴苷、槲皮素糖苷、無色花青素等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，番石榴提取物中降血糖有效成分可能是黃酮苷類及多糖類化合物，因此，對番石榴中黃酮的研究作為開發(fā)抗糖尿病的新藥將具有廣泛的前景和意義[5-8]。目前，對番石榴中黃酮的研究主要集中在葉子上，但對番石榴果實中黃酮的研究鮮有報道[9-11]。本研究探討番石榴果實中黃酮提取的影響因素，通過正交試驗篩選最優(yōu)提取工藝，為研究開發(fā)番石榴中的化學(xué)成分提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV1600型紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司)；B210S分析天平(北京賽多利斯有限公司)；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)；KQ-200KDE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試藥

蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100080-201408)；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

番石榴果實采自海南文昌，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院楊衛(wèi)麗副教授鑒定為桃金娘科番石榴屬番石榴。將其清洗，70 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩后備用。

2 方法及結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取在105 ℃條件下干燥至恒重的蘆丁對照品10.5 mg，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇適量，超聲5 min至溶解，定容，得質(zhì)量濃度為0.21 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取番石榴粉末2.0 g共5份，分別置于圓底燒瓶中，用60%乙醇溶液加熱回流2 h，過濾后于50 mL容量瓶中用60%乙醇溶液定容，搖勻，得供試品溶液。

2.1.3 檢測波長的選擇 精密量取蘆丁對照品溶液、供試品溶液以及空白溶液各4.0 mL于25 mL容量瓶中，精密加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液8 mL，然后加入60%乙醇溶液定容，搖勻，放置15 min，照分光光度法于200～600 nm進(jìn)行掃描，蘆丁與供試品溶液的最大吸收波長在508 nm處，故選用508 nm作為檢測波長。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL容量瓶中，操作同2.1.3項下方法，照分光光度法在508 nm處測定其吸光度。以濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=0.011 9X+0.027 0，r=0.999 9，表明蘆丁在8.24～50.42 mg·L-1線性關(guān)系良好。

2.1.5 穩(wěn)定性考察 精密吸取供試品溶液4 mL，操作同2.1.3項下方法，在室溫和室內(nèi)光照條件下密閉放置，分別在0、15、30、60、90、120 min測定其吸光度，RSD為2.3%(n=6)，結(jié)果表明，供試品溶液在2 h之內(nèi)較穩(wěn)定，滿足實驗的要求。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液4 mL，操作同2.1.3項下方法，連續(xù)5次測定其吸光度，RSD為0.11%(n=5)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 稱取6份番石榴果實藥材粉末，每份約5 g，精密稱定，按2.1.2項方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液，操作同2.1.3項下方法，分別測定其吸光度值，RSD為0.60%(n=6)，結(jié)果表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加標(biāo)回收試驗 精密吸取6份供試品溶液2 mL，分別加入蘆丁對照品溶液2.6 mL，操作同2.1.3項下方法，在508 nm處測定吸光度。見表1。

表1 加標(biāo)回收試驗結(jié)果(n=6)

由表1可知，平均回收率98.23%，RSD為1.36%，結(jié)果表明回收率較好，符合實驗要求。

2.2 總黃酮的提取工藝優(yōu)選

2.2.1 因素及水平考察 以提取的總黃酮含量作為評價指標(biāo)，通過單因素試驗選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、回流時間(1、1.5、2、2.5 h)、提取次數(shù)(1次、2次、3次)等因素和水平進(jìn)行試驗。確定較好的提取因素與水平：醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶25，回流2 h，提取次數(shù)為3次。然后確定醇的體積分?jǐn)?shù)為60%，選擇提取次數(shù)、料液比、提取時間3個因素，每個因素3個水平，設(shè)定因素水平表，見表2。

表2 正交試驗因素及水平表

2.2.2 正交試驗結(jié)果及分析 稱取番石榴粉末5.0 g，設(shè)計正交試驗，加入60%乙醇溶液加熱回流，過濾、濃縮，用60%乙醇定容至50 mL，采用分光光度法測定其含量，正交試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 方差分析

注：F0.05(2，2)=19.0。

對表3進(jìn)行直觀分析可知，極差大小顯示各因素的影響作用依次為A>B>C。表4表明，A因素對番石榴總黃酮的提取有顯著影響意義，B、C兩因素?zé)o顯著影響意義。為此，結(jié)合表3又做了2組加水平試驗，確定提取次數(shù)為3次，乙醇濃度為60%，見表5。結(jié)果再次驗證B、C兩因素為無顯著影響效應(yīng)。綜合直觀分析和方差分析的結(jié)果，確定番石榴果實中總黃酮的最優(yōu)提取工藝為A3B3C3，即乙醇體積濃度為60%，提取3次，料液比1∶25，回流2.5 h。

表5 加水平試驗結(jié)果

2.2.3 工藝驗證性試驗 為考察上述優(yōu)選提取工藝的穩(wěn)定性，按上述最優(yōu)工藝條件A3B3C3進(jìn)行了3次重復(fù)性試驗，番石榴果實中總黃酮的含量分別為1.54%、1.55%、1.54%，平均含量達(dá)到1.54%，表明本正交試驗設(shè)計的工藝路線穩(wěn)定，具有良好的可重復(fù)性。

3 討論

3.1 料液比和時間的確定

通過加標(biāo)試驗，當(dāng)料液比增加至30倍量時，總黃酮的提取含量反而稍有下降；當(dāng)提取時間延長至3 h后，總黃酮的含量未見明顯增加。因此，從經(jīng)濟(jì)和效率等方面考慮，確定最佳料液比為1∶25，提取時間為2.5 h。

3.2 提取次數(shù)的確定

通過正交試驗直觀分析發(fā)現(xiàn)，A因素即提取次數(shù)對總黃酮的提取影響最為顯著。當(dāng)其他水平相同的條件下，提取次數(shù)增至為3次時總黃酮的含量有明顯增加，因此確定最佳提取次數(shù)為3次。

番石榴葉中總黃酮含量因提取方法不同含量有所不同，如彭珊珊等[3]采用乙醇浸提與超聲法相結(jié)合得總黃酮1.27%；林燕如等[10]采用微波結(jié)合回流法得到總黃酮濃度高達(dá)9.91%。產(chǎn)地不同含量亦有所不同[11]。本研究通過正交試驗法對番石榴果實中總黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳提取工藝，總黃酮收率達(dá)到1.54%。結(jié)果表明，該方法工藝簡單、易于操作、提取率高，為番石榴果實中黃酮類活性成分的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供參考。

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StudyonExtractionProcessandDeterminationofTotalFlavonoidsinFruitsofPsidiumguajava

BAILili1，ZHOUZimeng1，DAIHua2

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences，HainanMedicalUniversity，Haikou571199，China； 2.SchoolofPublicHealth，HainanMedicalUniversity，Haikou571199，China)

Objective：To study the optimum extraction process of total flavonoids in fruits ofPsidiumguajava.Methods：An orthogonal experiment was designed to obtain the best extraction conditions，in which 4 factors (alcohol concentration，fruits：ethanol ratio，reflux time and extraction times)were examined，with the extraction rate of total flavonoids as the final indicator.The content of total flavonoids was determined by spectrophotometry at 508 nm.Results：The optimum extraction technology was identified as follows：extraction solvent，60 percent ethanol；fruits：ethanol ratio，1∶25；reflux time，2.5 h；extraction times，3 times.The linear ranges of the total flavonoids was 8.24-50.42 mg·mL-1(r=0.999 9).The average recovery was 98.23%(RSD=1.36%).The total flavonoids were 1.54%.Conclusion：The process proved to be simple and reasonable，with high extraction rate and feasibility.The determination method was easy and accurate which can be used for the study of total flavonoids inP.guajava.

Psidiumguajava；total flavonoids；extraction；orthogonal test

海南省自然科學(xué)基金(214033)

] 戴華，講師，研究方向：食品衛(wèi)生學(xué)研究，E-mail：daiborn@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.021

2016-04-30)

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