陜北白絨山羊10月齡母羊發(fā)情周期血清激素分泌規(guī)律的研究

朱蓉慧，陳玉林，馬 承，杜明陽，張莞煜，屈 雷*

（1.榆林學(xué)院，陜西省陜北絨山羊工程技術(shù)研究中心，陜西榆林 719000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.定邊縣白泥井鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，陜西榆林 719000）

陜北白絨山羊10月齡母羊發(fā)情周期血清激素分泌規(guī)律的研究

朱蓉慧1,2,3，陳玉林2，馬 承1，杜明陽1，張莞煜1，屈 雷1*

（1.榆林學(xué)院，陜西省陜北絨山羊工程技術(shù)研究中心，陜西榆林 719000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.定邊縣白泥井鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，陜西榆林 719000）

本實驗旨在分析陜北白絨山羊10月齡母羊發(fā)情周期內(nèi)卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）和孕酮（P4）的含量變化規(guī)律，為研究幼齡陜北白絨山羊母羊的繁殖性能和生殖激素的調(diào)控提供理論依據(jù)。在一個發(fā)情周期內(nèi)，連續(xù)20 d每天對8只10月齡陜北白絨山羊母羊進(jìn)行頸靜脈采血（母羊出現(xiàn)發(fā)情表現(xiàn)記為發(fā)情第0天）；在發(fā)情期當(dāng)天和發(fā)情間期第5天，從08:00開始，每間隔15 min連續(xù)采血3 h，分離血清，用酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）測定發(fā)情期、間情期和發(fā)情周期血清中FSH、LH、E2和P4的含量。結(jié)果表明：在發(fā)情期和間情期連續(xù)3 h內(nèi)，F(xiàn)SH、LH、E2和P4均呈波動式分泌，F(xiàn)SH發(fā)情期比間情期波動頻率快。LH發(fā)情期較間情期的波動頻率低；在發(fā)情期血清內(nèi)E2含量較間情期高（P＞0.05）；間情期血清內(nèi)P4含量顯著高于發(fā)情期（P＜0.05）；在測定的20 d內(nèi)，F(xiàn)SH、LH、E2血清中濃度值差異不顯著（P＞0.05），而P4濃度在發(fā)情當(dāng)日和發(fā)情次日低于發(fā)情間期（P＜0.05）。

陜北白絨山羊；卵泡刺激素；黃體生成素；雌二醇；孕酮

陜北白絨山羊是根據(jù)陜北地區(qū)的自然經(jīng)濟(jì)條件及市場需求，以遼寧白絨山羊為父本，陜北黑山羊為母本，采用簡單育成的雜交方式，在后代中選擇理想型個體橫交固定，自群繁育，經(jīng)過20多年培育而形成的絨肉兼用型絨山羊新品種[1]。隨著養(yǎng)殖方式由散養(yǎng)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯犸曃桂B(yǎng)，陜北白絨山羊開始常年發(fā)情。在舍飼條件下，陜北白絨山羊母羊一般在4～5月齡進(jìn)入初情期，5～6月齡達(dá)性成熟。在實際生產(chǎn)中，8月齡母羊開始配種較為常見，但結(jié)合母羊體成熟狀況和生產(chǎn)經(jīng)驗，母羊10月齡進(jìn)行配種更為適宜。為了解和掌握10月齡母羊在發(fā)情周期中主要生殖激素的變化規(guī)律，本實驗測定其血清中的促卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）和孕酮（P4），旨在為陜北白絨山羊母羊的早期利用和高效繁殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗動物 陜北白絨山羊母羊選自榆林學(xué)院陜西省陜北絨山羊工程技術(shù)研究中心實驗羊場，實行舍飼，自由采食、飲水。2014年11月初，先隨機(jī)選取9月齡的12只體況中等、健康且空懷的陜北白絨山羊母羊，跟蹤觀察2個發(fā)情周期（38～40 d）后，剔除發(fā)情周期不正常和不規(guī)律的4只母羊，最后選擇發(fā)情周期（均為19～20 d）正常，年齡處于10月齡的8只母羊作為供試羊。

1.1.2 試劑盒 測定FSH、LH、E2和P4的ELISA試劑盒購自上海邦奕生物科技有限公司（批號201601，201602）。

1.1.3 主要儀器及設(shè)備 酶標(biāo)儀（iMark型，美國Bio-Rad公司），超低溫冰箱（MDF-2136，日本SANYO公司），離心機(jī)（5424型，德國EPPENGOR），高速冷凍離心機(jī)（AVANTI J-E，國BECKMAN COULTER），Eppendorf移液器系列（德國Eppendorf公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)情鑒定 當(dāng)母羊處于發(fā)情期時，用試情公羊試情，母羊發(fā)情開始時會主動接近公羊，并強烈擺動尾部 ；發(fā)情旺期，試情公羊爬跨時母羊靜立不動，外陰流少量粘液；母羊發(fā)情結(jié)束時，拒不接受公羊爬跨。據(jù)此進(jìn)行母羊發(fā)情鑒定，一般母羊發(fā)情持續(xù)24～36 h后，進(jìn)入發(fā)情間期。

1.2.2 血樣采集 經(jīng)發(fā)情鑒定，將母羊發(fā)情表現(xiàn)明顯時，記為第0天，發(fā)情前1 d計為負(fù)第1 d。于發(fā)情開始的每天08:00—09:00采血1次，每次2 mL，連續(xù)采集至觀察到下一次發(fā)情開始為止，收集記錄發(fā)情期為19 d和20 d母羊的血清。另在發(fā)情期當(dāng)天（第0 天）、發(fā)情間期（發(fā)情后第5天）的每天08:00開始，每15 min采血1次，連續(xù)采血3 h，每次2 mL。血樣3 000 r/min離心10 min分離血清，用移液器將血清移入預(yù)先標(biāo)記好的干凈離心管中，放入-20℃冰箱內(nèi)冷存待測。

1.2.3 激素測定 根據(jù)ELISA試劑盒使用說明，采用雙抗體夾心ELISA法，用iMark型酶標(biāo)儀，在每個激素所要求的波長內(nèi)，測定吸光度OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中FSH、LH、E2和P4的血清內(nèi)激素值。以血清采集時間為橫坐標(biāo)，血清激素濃度值為縱坐標(biāo)，繪制激素不同時間內(nèi)的分泌曲線圖。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，ANOVA單因素方差分析統(tǒng)計各項指標(biāo)。P＜0.05表示差異顯著。實驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)情期與間情期FSH、LH、E2和P4的含量變化規(guī)律與特點 在測定的3 h內(nèi)，F(xiàn)SH、LH、E2和 P4在發(fā)情期和間情期均呈波動式分泌。由表1可知，發(fā)情期和間情期FSH的血清內(nèi)平均濃度分別為7.71、6.91 IU/L，發(fā)情期基礎(chǔ)濃度均高于間情期（P＞0.05）。從圖1可看出，在測定的3 h內(nèi)，發(fā)情期和間情期FSH的濃度均出現(xiàn)間隔60 min的波峰，但發(fā)情期FSH波動峰比間情期更快進(jìn)入下1次波動。

圖1 發(fā)情期和間情期血清內(nèi)FSH含量的變化

表1 陜北白絨山羊母羊發(fā)情期與間情期FSH、LH、E2和P4的血清濃度值

在發(fā)情期LH血清平均濃度顯著高于間情期（P＞0.05）。由圖2可見，在測定時間內(nèi)，分泌在發(fā)情期出現(xiàn)2個波峰，且每75 min產(chǎn)生1個波峰，而在間情期出現(xiàn)了3個波峰，每60 min產(chǎn)生1個波峰，表現(xiàn)為發(fā)情期較間情期LH的波動頻率低的特點。

在發(fā)情期E2血清平均分泌濃度顯著高于間情期（P＞0.05），也呈波動式分泌（圖3），波動峰與LH類似。但是在間情期表現(xiàn)2個持續(xù)60 min的波動峰之間，出現(xiàn)一個持續(xù)30min的小的波動峰。

間情期血清內(nèi)P4含量顯著高于發(fā)情期（P＜0.05）。由圖4可見，間情期P4分泌有波動，但沒有明顯的波動規(guī)律，發(fā)情期P4分泌基本沒有波動，且保持較低的分泌濃度。

圖 2 發(fā)情期和間情期血清內(nèi)LH含量的變化

圖3 發(fā)情期和間情期血清內(nèi)E2含量的變化

圖4 發(fā)情期和間情期血清內(nèi)P4含量的變化

2.2 發(fā)情周期血清中FSH、LH、E2和P4分泌特點與規(guī)律 陜北白絨山羊10月齡母羊在20 d的發(fā)情周期內(nèi)血清中FSH、LH、E2和P4含量變化趨勢見圖5。在發(fā)情周期內(nèi)血清中FSH、LH、E2和P4均表現(xiàn)為波動式分泌。其中FSH、LH、E2血清中濃度值在測定的20 d內(nèi)差異不顯著（P＞0.05），而P4濃度值在發(fā)情當(dāng)日和發(fā)情次日顯著低于發(fā)情間期值（P＜0.05）。

FSH在1個發(fā)情周期內(nèi)出現(xiàn)了4個分泌峰，在發(fā)情當(dāng)日出現(xiàn)1個分泌峰，且激素濃度最大，為10.82 IU/L。另外，又于發(fā)情后第7、13、18天出現(xiàn)3個分泌峰，波峰值分別為10.63、10.66、10.17 IU/L。

LH、E2濃度均在發(fā)情后第0、3、10、16天出現(xiàn)4個分泌峰，LH的波峰值分別為922.31、948.35、925.23、918.35 pg/mL，E2的波峰值分別為14.36、14.28、13.98、14.21 ng/L。

P4在發(fā)情期激素水平較低，在發(fā)情周期第0～2天血清內(nèi)P4處于發(fā)情周期內(nèi)較低水平，發(fā)情當(dāng)天為最低水平301.14 pmol/L。第4～18天（間情期）維持一較高水平波動（411.42～447.46 pmol/L），并且于第15天后激素濃度逐漸下降，一直到發(fā)情時降至最低水平。

3 討 論

圖5 發(fā)情周期中血清內(nèi)FSH、LH、E2、P4含量的變化趨勢

3.1 關(guān)于陜北白絨山羊的發(fā)情周期 陜北白絨山羊母羊的發(fā)情周期一般為18～22 d，發(fā)情持續(xù)期為30～60 h，群體中個體之間發(fā)情表現(xiàn)差異較大，有的安靜發(fā)情，有的發(fā)情表現(xiàn)明顯[2]。通過對陜北白絨山羊母羊試驗羊群2個發(fā)情周期的觀察發(fā)現(xiàn)，初情期陜北白絨山羊母羊的發(fā)情周期為19～20 d（平均19.67 d），發(fā)情持續(xù)期為26～46 h（平均32 h）。由此可以認(rèn)為，本試驗羊群的組成是合理且具有代表性的。

3.2 關(guān)于發(fā)情期、間情期FSH、LH、E2、P4的波動分泌特點與種間差異 哺乳動物卵泡發(fā)育是一個高度協(xié)調(diào)且復(fù)雜的過程，只有同時具備高振幅和高頻率才能使LH濃度升高到促進(jìn)卵泡成熟和排卵的水平[3]。鄭亦輝等[4]認(rèn)為多胎型湖羊血漿內(nèi)FSH、LH的基礎(chǔ)濃度和峰值均顯著高于單胎型的美利奴羊。陜北白絨山羊10月齡母羊血清內(nèi)FSH、LH發(fā)情期基礎(chǔ)濃度均比間情期高，這與萊蕪黑山羊[5]和濟(jì)寧青山羊[6-7]相同。血清內(nèi)FSH波動頻率在發(fā)情期較間情期高，但LH相反。本實驗單胎型的陜北白絨山羊10月齡母羊在發(fā)情期FSH和LH的分泌峰值卻顯著高于多胎型濟(jì)寧青山羊[6-7]，造成這一差異是由于種間差異、年齡、環(huán)境因素、試驗方法的不同還是試驗中血樣的采集方式不同造成，尚待進(jìn)一步研究。

陜北白絨山羊10月齡母羊與在發(fā)情期和間情期E2和P4均呈波動式分泌，此規(guī)律與萊蕪黑山羊[5]和濟(jì)寧青山羊[6-7]相似。單胎型的陜北白絨山羊10月齡母羊血清內(nèi)E2的波峰值較多胎型的濟(jì)寧青山羊低。間情期陜北白絨山羊10月齡母羊血清內(nèi)P4的基礎(chǔ)濃度、波峰與波谷均低于濟(jì)寧青山羊。在間情期維持較高濃度的P4是保證卵泡正常生長發(fā)育所必須的[8]，由此推測，在間情期單胎型羊種血清內(nèi)P4的濃度較多胎型羊種低，這樣可保證多胎型羊種有更多卵泡發(fā)育成熟并排卵。綜上所述，羊種之間繁殖率的高低與發(fā)情期和間情期血清中FSH、LH、E2、P4的分泌有密切的關(guān)系。

3.3 關(guān)于周期性波動分泌和卵泡波 大多數(shù)哺乳動物的卵泡發(fā)育都是以卵泡波的形式進(jìn)行的，在一個發(fā)情周期中往往出現(xiàn)數(shù)個卵泡波，F(xiàn)SH和LH是主導(dǎo)卵泡發(fā)育的2個主要因素。在卵泡選擇期，起決定性作用的是FSH濃度的下降和LH濃度的上升[9]，優(yōu)勢卵泡具有較多的LH受體數(shù)目[10]，同時在優(yōu)勢卵泡確立時其內(nèi)膜細(xì)胞上LH結(jié)合位點增多[11]，使得這些卵泡可獲得LH的支持而繼續(xù)發(fā)育。Menchaca等[12]研究表明，山羊每個發(fā)情周期有3～4個卵泡波。吳延光等[13]和Medan等[14]認(rèn)為，在發(fā)情周期內(nèi)每個卵泡波的出現(xiàn)都伴隨著1個FSH分泌峰。Saanen山羊每個發(fā)情周期一般有4個卵泡波，分別出現(xiàn)在排卵周期第0 d、5～6 d、10～11天 d和15 d前后[15]。萊蕪黑山羊在整個發(fā)情周期中FSH、LH均先后分別出現(xiàn)4個分泌峰，F(xiàn)SH和LH的第1個分泌峰分別出現(xiàn)在第7天和第5天，其余3個分泌峰均同時出現(xiàn)在第10、15、20天[15]。陜北白絨山羊10月齡母羊在1個發(fā)情周期內(nèi)先后出現(xiàn)了4個FSH、LH和E2分泌峰，發(fā)情當(dāng)天FSH、LH的分泌峰同時出現(xiàn)。其余3個分泌峰FSH出現(xiàn)在第7、13、18天，LH分泌峰出現(xiàn)在第3、10、16天。在發(fā)情間期，LH峰早于FSH出現(xiàn)且與E2同時波動，推測此時LH主要與E2存在互作效應(yīng)。Ginther[16]認(rèn)為，大卵泡產(chǎn)生大量E2對FSH具有負(fù)反饋的作用，抑制FSH的分泌，造成FSH下降，同時卵泡的顆粒細(xì)胞獲得LH受體，從而發(fā)育為優(yōu)勢卵泡?，F(xiàn)知成熟的卵泡分泌大量的E2，在排卵前達(dá)到高峰，可激發(fā)LH大量釋放（高峰狀），誘發(fā)LH峰的閾值。此LH和FSH的峰狀分泌將激發(fā)成熟卵泡排卵，因此兩者的峰狀分泌稱排卵峰（LH更重要），所以LH分泌波動與E2分泌波動峰谷基本同步。陜北白絨山羊10月齡母羊除發(fā)情當(dāng)天外，E2出現(xiàn)峰值時FSH均為較低值，反之亦然。這與Baird等[17]對綿羊的報道相似。發(fā)情當(dāng)天，陜北白絨山羊10月齡母羊P4濃度最低到發(fā)情后的第5天保持較大濃度值一直到第15天開始下降的規(guī)律，說明發(fā)情行為與P4的濃度有很大關(guān)系。優(yōu)勢卵泡產(chǎn)生大量E2并在少量的P4協(xié)同作用下引起動物發(fā)情。

4 小 結(jié)

羊種之間繁殖率的高低與發(fā)情期和間情期血清中FSH、LH、E2、P4的分泌有密切的關(guān)系。本實驗中陜北白絨山羊10月齡母羊有4個FSH峰值，即有4個卵泡波；優(yōu)勢卵泡產(chǎn)生大量E2并在少量的P4協(xié)同作用下引起動物發(fā)情；E2、FSH、LH第1個分泌峰值均出現(xiàn)于發(fā)情當(dāng)天，此LH、FSH的峰狀分泌將激發(fā)成熟卵泡排卵。

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The Secretion Characteristics of FSH, LH, E2and P4in Serum during the Oestrus Cycle of 10-month-old Female Shanbei Cashmere Goats

ZHU Rong‐hui1,2,3, CHEN Yu‐lin2, MA Cheng1, DU Ming‐yang1, ZHANG Wan‐yu1, QU Lei1*

(1.Yulin University Shaanxi Province Engineering&Technology Research Center of Cashmere Goat,Shaanxi Yulin 719000, China;2.college of animal science and technology ,Northwest A&F University,Shaanxi Yangling 712100, China;3.Bai Ni‐jing Zhen Dingbian County Animal Husbandry and Veterinary Station, Shaanxi Yulin 719000,China)

The objective of this study was to analysis the variation of follicle‐stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH), estradiol‐2 (E2) and progesterone (P4) in serum during the oestrus cycle of 10‐month‐old female Shanbei Cashmere Goats , to provide theoretical basis for the regulation of reproductive performance and reproductive hormones of young female Shanbei Cashmere Goats. Blood sample from 8 10‐month‐old female Shanbei Cashmere Goats was obtained via jugular vein every day during the estrous cycle (The day when female goat appeared oestrus was signed as day 0). Serum was collected at 15 min intervals for consecutive 3 h everyday in oestrus and diestrus. The contents of FSH, LH, E2 and P4 in serum during the oestrus, anoestrus and oestrus cycle were detected by enzyme‐linked immunoassay(ELISA). The secretion of FSH, LH, E2and P4for consecutive 3 hours during the oestrus and anoestrus were all wavelike and the FSH expressed the higher wavelike frequency during the oestrus. While the wavelike frequency of LH was lower during oestrus. The E2level was higher during oestrus, but there was no signif i cant dif f erence (P＞0.05). In the meanwhile, the P4level was signif i cantly higher during anoestrus than during oestrus (P＜0.05). For the entire oestrus cycle, the FSH, LH and E2levels in the serum didn’t show any signif i cant dif f erences, but the P4levels on the day 0 and day 1 were signif i cantly lower than that during anoestrus(P＜0.05).

Shanbei cashmere goat; Follicle Stimulating Hormone; Luteinizing Hormone;Estradiol‐2; Progesterone

S827.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-09-061

2017-06-04；

2017-06-29

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2014KTDZ02-01)

朱蓉慧（1989-），女，陜西榆林人，助理畜牧師，碩士研究生，主要從事畜牧生產(chǎn)與推廣的研究，E-mail: 2633219 23@qq.com

* 通訊作者：屈雷，E-mail: 273790687@qq.com