海珠益肝加味方對免疫性肝損傷小鼠細胞因子的影響

徐建良張云城盛國光黃育華△

1.湖北省中醫(yī)院肝病科（湖北 武漢，430061） 2.湖北省中醫(yī)藥研究院 3.深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院

海珠益肝加味方對免疫性肝損傷小鼠細胞因子的影響

徐建良1，2張云城2盛國光1，2黃育華1，2△

1.湖北省中醫(yī)院肝病科（湖北 武漢，430061） 2.湖北省中醫(yī)藥研究院 3.深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院

目的：觀察海珠益肝加味方對刀豆球蛋白A（Con A）誘導建立的免疫性肝損傷小鼠細胞因子IL-4、IL-6、INF-γ、TNF-a的影響，探討其作用機制。方法：將40只昆明小鼠隨機分為正常組、模型組、醋酸強的松組、海珠益肝加味方組，采用尾靜脈注射Con A建立免疫性肝損傷小鼠模型，眼球取血，檢測小鼠血清IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平。結果：與正常組比較，模型組小鼠外周血IL-4、IL-6水平明顯降低（P＜0.01），IFN-γ、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，醋酸強的松組、海珠益肝加味方組小鼠外周血IL-4、IL-6的水平明顯升高（P＜0.01），IFN-γ、TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）。結論：海珠益肝加味方能升高免疫性肝損傷小鼠細胞因子IL-6、IL-4的分泌水平，降低IFN-γ、TNF-α的水平，恢復Th1/Th2細胞之間的平衡，具有保護肝細胞的作用，可能是其作用機制之一。

海珠益肝加味方；刀豆蛋白A；免疫性肝損傷；細胞因子

慢性乙型肝炎（CHB）是由HBV感染引起的免疫性疾病，導致肝臟損傷的發(fā)病機制至今仍未完全清楚。Con A誘導的免疫性肝損傷小鼠模型具有肝臟特異性、劑量依賴性和制作簡便快捷的特點［1］，被認為是最適合研究人類病毒性肝炎病理機制的研究模型。海珠益肝加味方是盛國光教授治療CHB的經(jīng)驗方，在前期的臨床及實驗研究中，發(fā)現(xiàn)其具有抑制乙肝病毒復制、恢復肝功能、抗肝纖維化等作用［2，3］。我們從免疫性肝損傷的角度，觀察海珠益肝加味方對免疫性肝損傷小鼠細胞因子的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明小鼠40只，清潔級，5周齡，雄性，體重18～22g，購自湖北省實驗動物研究所。

1.2 主要藥物及試劑 海珠益肝加味方藥物組成：葉下珠、海藻、太子參、枸杞子、白花蛇舌草各15g，茯苓12g，白芥子10g，莪術6g，均購自湖北省中藥材公司。按處方加水煎煮兩次，混合藥液，沉淀過濾，水浴濃縮為含生藥1g/ml的藥液，分裝、滅菌、低溫保存，由湖北省中醫(yī)院制劑室提供。醋酸強的松片由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)（批準文號：H33021207），以生理鹽水溶解成0.78mg/ml溶液；Con A購自Sigma公司（批號80M7680V）；IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-a試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 純水儀（AJC-0501-P），微型旋渦混合器（WH-2），水浴鍋（TL-420D），酶標儀（RT-2100C）等。

1.4 動物分組及處理 將40只昆明小鼠隨機分為正常對照組、模型組、醋酸強的松組、海珠益肝加味方組，每組10只。各組小鼠適應性飼養(yǎng)兩天后，除正常對照組外，其余組小鼠于實驗第1天尾靜脈注射Con A 20mg/kg（0.9%的生理鹽水稀釋，濃度為2mg/ml）。并于第1天開始灌胃給藥，醋酸強的松組以醋酸強的松7.8mg/kg灌胃、海珠益肝加味方組以海珠益肝加味方13.4ml/kg灌胃，正常組、模型組以蒸餾水0.2m l/10g灌胃，每天1次，連續(xù)3天。末次灌胃給藥后4h，模型組、醋酸強的松組、海珠益肝加味方組一次性尾靜脈注射Con A20mg/kg［4，5］。8h后，摘眼球取血，室溫靜置2h，低溫離心留取血清。

1.5 IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α含量的測定。采用ELISA法檢測小鼠外周血血清中IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的含量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均以（±s）表示，計量資料組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有顯著性意義。

2 結果

2.1 各組小鼠外周血血清IL－4、IL－6的水平 見表1。

表1 各組小鼠外周血血清IL－4、IL－6水平（±s）

表1 各組小鼠外周血血清IL－4、IL－6水平（±s）

與正常組比較，**P＜0.01；與模型比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 n IL－4（pg/ml） IL－6（pg/ml ）10 66.74±8.73 29.25±9.78模型組 10 55.54±5.81** 11.25±7.54**強的松組 10 62.74±6.17▲▲ 50.25±11.23▲▲海珠益肝加味方組 10 63.42±6.33▲ 25.13±11.33正常組▲

2.2 各組小鼠外周血血清IFN-γ、TNF-a的水平 見表2。

表2 各組小鼠外周血血清IFN－γ、TNF－α水平（±s）

表2 各組小鼠外周血血清IFN－γ、TNF－α水平（±s）

與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 n IFN－γ（pg/ml） TNF－a（pg/ml ）10 2.98±0.99 68.38±8.82模型組 10 4.43±0.79** 81.25±6.15**強的松組 10 3.07±0.49▲▲ 68.13±14.80▲海珠益肝加味方組 10 2.88±1.64▲ 58.00±3.05正常組▲▲

3 討論

在免疫應答過程中，經(jīng)典的T細胞為輔助性T細胞，它的功能是有效控制免疫反應的發(fā)生，盡可能地降低機體的損害，不同的細胞因子環(huán)境導致Th0分化不同。IFN-γ、TNF-α誘導Th0向Th1分化，IL-4、IL-6、IL-10誘導Th0向Th2分化，細胞因子（CK）在其中發(fā)揮了重大作用。Th1型CK如干擾素-γ（IFN-γ）通過激活效應細胞的細胞毒及吞噬功能發(fā)揮作用。Th2型CK如白細胞介素-4（IL-4、IL-6、IL-10），主要輔助B細胞產(chǎn)生抗體，并決定產(chǎn)生抗體的同種型。Th1/Th2極化是免疫應答調節(jié)中的關鍵環(huán)節(jié)。Th1/Th2之間失去平衡會引起細胞免疫功能紊亂，從而導致疾病的發(fā)生。

辛永寧等［6］發(fā)現(xiàn)Th1型細胞因子上調與乙型肝炎病毒感染時肝臟的炎癥活動密切相關，在病情的急性期和慢性活動期，Th1型細胞因子分泌是明顯占優(yōu)勢的，IL-2、IFN-γ分泌增多，促進細胞免疫，有利于病毒清除，但同時可加重肝臟損傷；在慢性攜帶狀態(tài)和穩(wěn)定期，Th2型細胞因子分泌為主，IL-4、IL-6、IL-10分泌增多，Th1型細胞免疫應答相對低下，導致HBV長期持續(xù)感染，病情進展成慢性化。

IL-4是一種由活化的T細胞產(chǎn)生的細胞因子，以往稱為B細胞生長因子，同時也活化細胞毒性T細胞，被認為是典型的由Th2細胞產(chǎn)生的細胞因子，對炎癥性細胞因子的釋放和這些細胞的殺菌活性有明顯抑制作用［7］。IL-6為多效的細胞因子，生理功能復雜，既有促炎作用，又有抗凋亡作用。Sun R［8］研究表明IL－6對各種肝損傷包括T細胞介導的肝炎有保護作用，其保護機制可能是IL－6能誘導抗凋亡蛋白的產(chǎn)生。IFN-γ被認為是Th1反應因子，可增加單核細胞的吞噬和吞飲作用，刺激細胞釋放氧化因子和TNF-α，殺滅腫瘤細胞或受病毒感染的靶細胞。TNF-α能誘導多種蛋白質的表達，如TNF-α活化巨噬細胞，能誘導IFN-γ等細胞因子產(chǎn)生，而IFN-γ能增強TNF-α的活性。

海珠益肝方由葉下珠、海藻、茯苓等六味中藥組成，前期研究提示對免疫性肝損傷小鼠神經(jīng)－內分泌－免疫網(wǎng)絡有干預作用［9］。海珠益肝加味方在海珠益肝方基礎上加用太子參、枸杞子組成，是盛國光教授治療CHB的經(jīng)驗方，具有解毒、化痰、消瘀、補虛的功效［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，海珠益肝加味方可降低血清中TNF-α的水平，提示該藥對Con A引起小鼠肝損傷的保護作用與抑制促炎細胞因子表達密切相關。同時觀察到，模型組小鼠注射Con A后IFN-γ水平明顯上升，IL-4、IL-6水平明顯下降，引起細胞免疫功能亢進，體液免疫功能低下。海珠益肝加味方組IFN-γ明顯下降，同時IL-4、IL-6明顯上升，提示海珠益肝加味方可以恢復Th1/Th2細胞比例的平衡，穩(wěn)定免疫功能，預防、減輕免疫性肝損傷，具有保護肝細胞的作用。

［1]曲建慧，張修禮.ConA性小鼠肝損傷模型的研究及應用［J］.肝臟，2001，6（3）：180－181.

［2]盛國光，黃育華，張建軍，等.海珠益肝膠囊治療慢性乙型肝炎近期療效觀察［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2002，22（2）：136－137.

［3]譚大琦，李秋華，竺稽能，等.海珠益肝膠囊對免疫性肝損傷的影響［J］.中西醫(yī)結合肝病雜志，2002，12（2）：36－38.

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［10]盛國光，黃育華，李曉東，等.慢性乙型肝炎中醫(yī)辨治規(guī)律探討［J］，中西醫(yī)結合肝病雜志，2012，22（6）：382.

Effect of Haizhu Yigan Jiawei formula on Cell Factor in Immunity Hepatic lnjury m ice

XU Jian-liang1，ZHANG Yun-cheng2，HUANG Yu-hua△，etal.Department of Liver Diseases，Hubei Hospital of TCM（Wuhan Hubei，430061）China

Objective：To observe the effectof Haizhu Yigan Jiawei formula on cell factor of IL-4，IL-6，INF-γ，TNF-αin immunity hepatic injurymice.M ethods：Forty kun mingmice were random ly divided into normal control group，model group，prednisone group，HZYGJWF group，by Con A tail vein injectionsmade immune liver injurymodel.after taking blood through eye sockets，measuring the level of IL-4，IL-6，INF-｜γ，TNF-α.Results：Compared with normal control group，the level of IL-4 and IL-6 in Model group mice were decreased（P＜0.01），the level of IFN-γand TNF-a inmodel group micewere increased（P＜0.05）；Compared withmodel group，the level of IL-｜4 and IL-6 in prednisone group，HZYGJWF group mice were obviousiy heightened（P＜0.01），the level of IFN-｜γand TNF-a in model group mice were obviousiy reduced（P＜0.05）.Conclusion：Haizhu Yigan Jiawei formula can heighten the level of IL-4 and IL-6 in Immunity Hepatic lnjury Mice，reducethe level of IFN-γand TNF-a，and can adjust the balance between Th1/Th2，can protect liver，may be one of themechanisms

Haizhu Yigan Jiawei formula；Con A；Immunity Hepatic lnjury；Cell factor

2016－10－16 編輯：黃育華）

10.3969/j.issn.1005－0264.2017.03.015

△通訊作者