養(yǎng)肝解毒散結(jié)中藥對(duì)肝癌血管生成作用及機(jī)制*

胡 兵安紅梅王雙雙鄭佳露閆 霞黃曉偉

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科（上海，200032） 2.上海市中醫(yī)藥研究院中醫(yī)腫瘤研究所 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院科技處

養(yǎng)肝解毒散結(jié)中藥對(duì)肝癌血管生成作用及機(jī)制*

胡 兵1，2安紅梅3王雙雙1，2鄭佳露1，2閆 霞1，2黃曉偉1，2

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科（上海，200032） 2.上海市中醫(yī)藥研究院中醫(yī)腫瘤研究所 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院科技處

目的：觀察養(yǎng)肝解毒散結(jié)（YGJDSJ）中藥對(duì)肝癌血管生成的作用。方法：裸小鼠皮下移植人肝癌Bel-7402細(xì)胞，隨機(jī)分為兩組，每組10只，分別給予蒸餾水或YGJDSJ灌胃，1次/d，治療3周后，剝離腫瘤組織，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)血管生成及相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果：YGJDSJ中藥可以抑制Bel-7402人肝癌組織血管生成，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）；YGJDSJ中藥可降低肝癌組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和乏氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）；YGJDSJ中藥還可降低M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在肝癌組織的分布，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）。結(jié)論：YGJDSJ中藥可以抑制肝癌血管生成，其機(jī)制與下調(diào)VEGF、HIF-1α和M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞相關(guān)。

肝癌；養(yǎng)肝解毒散結(jié)中藥；血管生成；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；乏氧誘導(dǎo)因子-1a；M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞

中醫(yī)藥是我國(guó)重要的生物醫(yī)藥資源，在肝癌的治療中發(fā)揮了積極的作用［1］。養(yǎng)肝解毒散結(jié)中藥復(fù)方（專利號(hào)：ZL201110145109.0）是項(xiàng)目組治療肝癌臨床驗(yàn)方，由女貞子、炙鱉甲、龍葵、蛇莓、澤漆、貓爪草、郁金、虎杖等中藥組成；其中女貞子所含熊果酸可以抑制肝癌VEGF表達(dá)和血管生成［2］，龍葵、蛇莓、郁金可以抑制雞胚尿囊膜血管生成［3～5］，虎杖單體白藜蘆醇和大黃素可以抑制腫瘤血管生成［6，7］，提示養(yǎng)肝解毒散結(jié)中藥復(fù)方可能具有抑制血管生成的作用。本實(shí)驗(yàn)研究擬觀察養(yǎng)肝解毒散結(jié)中藥對(duì)肝癌血管生成的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株 BALB/C裸小鼠20只，6周齡，雌性，體重18～23g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK（滬）2012－0002，飼養(yǎng)于龍華醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。人肝癌Bel-7402細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要儀器及試劑 培養(yǎng)箱，美國(guó)NuAire公司產(chǎn)品；低溫離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，日本NIKON公司產(chǎn)品。DMEM、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。中藥由龍華醫(yī)院中藥房提供并鑒定。CD31、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、乏氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、精氨酸酶/（Arg-1）抗體購(gòu)自Santa Cruz生物技術(shù)公司。其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 中藥制備 養(yǎng)肝解毒散結(jié)（YGJDSJ）中藥由女貞子12 g，炙鱉甲30g，龍葵、蛇莓、澤漆、貓爪草、郁金、虎杖各15g等組成，按比例配方，加8倍量的水，浸漬1 h；炙鱉甲武火煮沸后文火煎煮0.5 h，加入其他中藥煮沸后文火煎煮0.5 h，濾過(guò)；濾渣再加6倍量的水煎煮0.5 h，濾過(guò)；合并濾液，濃縮至2 g/ml，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 中藥對(duì)肝癌血管生成影響圖(HE,×200)

圖3 中藥對(duì)肝癌組織HIF-1α表達(dá)影響圖(HE,×200)

圖2 中藥對(duì)肝癌組織VEGF表達(dá)影響圖(HE,×200)

圖4 中藥對(duì)肝癌組織相關(guān)巨噬細(xì)胞影響圖(HE,×200)

1.4 動(dòng)物模型制備及分組 常規(guī)培養(yǎng)Bel-7402細(xì)胞，消化并計(jì)數(shù)，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107個(gè)/ml，每只裸小鼠給予無(wú)菌皮下注射0.1 m l細(xì)胞懸液；待腫瘤生長(zhǎng)至可測(cè)量范圍后隨機(jī)分為對(duì)照組和YGJDSJ組，分別給予蒸餾水和YGJDSJ中藥灌胃，0.3 ml/次，1次/d；兩組動(dòng)物均給予飼料，自由飲用無(wú)菌水。治療3周后處死小鼠，保留腫瘤標(biāo)本備用。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 腫瘤組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片、脫蠟，3%H2O2封閉10min，PBS沖洗；檸檬酸緩沖液中（pH6.0）煮沸修復(fù)抗原，PBS洗滌；3%H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS洗滌；正常動(dòng)物血清孵育5min，PBS洗滌；加入CD31、VEGF、HIF-1α、Arg-I（濃度1∶100）4℃過(guò)夜，PBS沖洗；加入對(duì)應(yīng)二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)封片；Image Pro軟件分析蛋白表達(dá)平均光密度值（MOD），結(jié)果以對(duì)照組倍數(shù)表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以±s表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠肝癌組織血管生成性況 采用CD31作為新生血管標(biāo)志，免疫組化檢測(cè)新生血管生成情況，結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠肝癌組織有較多新生血管生成，YGJDSJ中藥可以抑制肝癌血管生成，與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.01）。見(jiàn)表1及插頁(yè)圖。

表1 兩組小鼠肝癌組織血管生成平均光密度比較（±s）

表1 兩組小鼠肝癌組織血管生成平均光密度比較（±s）

與對(duì)照組比較，**P＜0.01

組別 n血管生成（MOD）1.00±0.07 YGJDSJ組 3 0.43±0.04對(duì)照組3 **

2.2 兩組小鼠肝癌組織VECF表達(dá)情況 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝癌組織VEGF表達(dá)明顯，YGJDSJ中藥可以抑制肝癌組織VEGF表達(dá)，與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.01）。見(jiàn)表2及插頁(yè)圖1。

表2 兩組小鼠肝癌組織VEGF表達(dá)平均光密度值比較（±s）

表2 兩組小鼠肝癌組織VEGF表達(dá)平均光密度值比較（±s）

與對(duì)照組比較，**P＜0.01

組別 n VEGF（MOD）1.00±0.06 YGJDSJ組 3 0.34±0.03對(duì)照組3 **

2.3 兩組小鼠組肝癌組織HIF-1α表達(dá)情況 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠肝癌組織有較多HIF-1α表達(dá)，YGJDSJ中藥可以抑制肝癌組織HIF-1α表達(dá)，與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.01）。見(jiàn)表3及插頁(yè)圖3。

表3 兩組小鼠肝癌組織HIF-1α表達(dá)平均光密度值比較（±s）

表3 兩組小鼠肝癌組織HIF-1α表達(dá)平均光密度值比較（±s）

與對(duì)照組比較，**P＜0.01

組別 n HIF-1α（MOD）對(duì)照組3 ** 1.00±0.05 YGJDSJ組 3 0.25±0.03

2.4 兩組小鼠肝癌組織腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分布情況 采用Arg-I作為M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMS）標(biāo)志，免疫組化檢測(cè)M2TAMS在肝癌組織的分布，結(jié)果顯示對(duì)照組肝癌小鼠組織有較多M2TAMS分布，YGJDSJ中藥治療后肝癌組織M2TAMS分布顯著減少，與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.01）。見(jiàn)插頁(yè)圖4，表4。

表4 兩組小鼠肝癌組織腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分布平均光密度值比較（±s）

表4 兩組小鼠肝癌組織腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分布平均光密度值比較（±s）

與對(duì)照組比較，**P＜0.01

組別 n TAM（MOD）1.00±0.04 YGJDSJ組 3 0.31±0.03對(duì)照組3 **

3 討論

根據(jù)臨床表現(xiàn)，肝癌可以歸屬于中醫(yī)“鼓脹”、“黃疸”、“積聚”、“脅痛”、“肝積”、“肥氣”、“伏梁”等范疇。歷代醫(yī)家對(duì)相關(guān)病證有一定闡發(fā)，如《靈樞·邪氣臟腑病形篇》記載“肝脈微急為肥氣，在脅下，若覆杯”，“伏梁，在心下”?！峨y經(jīng)·五十五難·五臟攸分》記載＂肝之積名曰肥氣，在左脅下如覆杯＂，《濟(jì)生方·癓瘕積聚門(mén)》描述“肥氣之狀，在左脅下，覆大如杯，肥大而似有頭足，是為肝積”。

肝癌臨床表現(xiàn)復(fù)雜，涉及多個(gè)病理因素，屬正虛邪實(shí)之證，正虛是肝癌發(fā)病的內(nèi)因；現(xiàn)代中醫(yī)發(fā)展了癌毒的概念，癌毒是肝癌發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，抗癌是治療肝癌的重要法則，可以認(rèn)為虛、毒、瘀是肝癌的基本病機(jī)［1，8］。養(yǎng)肝解毒散結(jié)方由多味中藥組成，其中女貞子、炙鱉甲滋陰養(yǎng)肝、散結(jié)；龍葵、蛇莓解毒散結(jié)；澤漆、貓爪草化痰散結(jié)；郁金、虎杖化瘀散結(jié)；諸藥合用，共奏養(yǎng)肝解毒散結(jié)之功。

腫瘤組織由于生長(zhǎng)失控、血管紊亂，腫瘤內(nèi)部氧水平降低，促使腫瘤細(xì)胞通過(guò)無(wú)氧酵解、腫瘤血管生成等方式以適應(yīng)乏氧環(huán)境；在乏氧條件下HIF-1α蛋白水平升高，HIF-1α可直接結(jié)合VEGF啟動(dòng)子，上調(diào)VEGF表達(dá)，促腫瘤血管生成［9］。本研究結(jié)果顯示，養(yǎng)肝解毒散結(jié)中藥可以抑制肝癌組織血管生成，同時(shí)伴隨VEGF和HIF-1α表達(dá)降低，提示養(yǎng)肝解毒散結(jié)中藥對(duì)肝癌血管生成抑制作用與下調(diào)VEGF和HIF-1α表達(dá)相關(guān)。

M2型TAMS是介導(dǎo)腫瘤炎癥（Cancer-related inflammation）的主要細(xì)胞群體，低表達(dá)IL-12、IL-23，高表達(dá)IL-10和Arg-I，Arg-1是M2 TAMS的標(biāo)志基因［10］。腫瘤細(xì)胞可以分泌IL-10、CSF-1等細(xì)胞因子，促使單核細(xì)胞分化為M2 TAMS。此外，腫瘤組織因乏氧高表達(dá)的HIF-1α也可以上調(diào)CXCL8和CXCR4促M(fèi)2 TAMS分化。M2 TAMS可以抑制抗腫瘤免疫，促腫瘤轉(zhuǎn)移，也可以通過(guò)分泌VEGF促腫瘤血管生成。本研究結(jié)果顯示，養(yǎng)肝解毒散結(jié)中藥治療后肝癌組織M2 TAMS分布減少。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示：養(yǎng)肝解毒散結(jié)中藥可以抑制肝癌血管生成，其機(jī)制與下調(diào)VEGF、HIF-1α和M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞相關(guān)，值得進(jìn)一步深入研究。

［1]Hu B，Wang SS，Du Q.Traditional Chinese medicine for prevention and treatmentof hepatocarcinoma：From bench to bedside［J］.World J Hepatol，2015，7（9）：1209-1232.

［2]高福君.女貞子提取物抑制人肝癌細(xì)胞血管生長(zhǎng)因子表達(dá)作用研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（2）：139-142.

［3]許揚(yáng)，潘瑞樂(lè)，常琪，等.龍葵抑制雞胚絨毛尿囊膜血管新生的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33（5）：549-552.

［4]許揚(yáng)，潘瑞樂(lè)，常琪，等.蛇莓抑制雞胚絨毛尿囊膜血管新生作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2008，24（3）：65-67.

［5]肖淵，李娜，李海芳，等.觀察12種活血祛瘀類中藥對(duì)雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成的影響［J］.藥物分析雜志，2009，29（7）：1079-1082.

［6]Kimura Y，Okuda H.Resveratrol isolated from Polygonum cuspidatum root prevents tumor growth and metastasis to lung and tumor-induced neovascularization in Lewis lung carcinoma-bearingmice［J］.JNutr，2001，131（6）：1844-1849.

［7]Lin SZ，WeiWT，Chen H，et al.Antitumor activity of emodin against pancreatic cancer depends on its dual role：promotion of apoptosis and suppression of angiogenesis［J］.Plos One，2012，7（8）：e42146.

［8]杜琴，胡兵，沈克平.肝癌中醫(yī)病機(jī)與治法研究［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，5（9）：814-817.

［9]Masoud GN，LiW.HIF-1αpathway：role，regulation and intervention for cancer therapy［J］.Acta Pharm Sin B，2015，5（5）：378-389.

［10]Deng S，Hu Bing，Shen KP，et al.Inflammation，macrophage in cancer progression and Chinese herbal treatment［J］.JBasic Clin Pharm，2012，2（3）：269-272.

Effects and M echanism of YangGan JieDu SanJie Herbs on Angiogenesis in Hepatocellular Carcinoma*

HU Bing1，2AN Hong-Mei3，WANGShuang－Shuang1，2，etal.1.Departmentof Oncology，Longhua Hospital，ShanghaiUniversity of Traditional Chinese Medicine（Shanghai，200032）China

Objective：To observe the effects of YangGan JieDu SanJie herbs（YGJDSJ）on angiogenesis in human hepatocellular carcinoma.Methods：Nudemice subcutaneously transplanted with Bel－7402 human hepatocarcinoma cellswere random ly divided into two groups（10mice per group），and intragastric administered with distilled water or YGJDSJdaily.After threeweeks of treatment，the tumorswere dissected.Gene expression was detected by IHC（Immunohistochemistry）.Results：compared with control group，YGJDSJ could significantly inhibitangiogenesis and down－regulated VEGF（Vascular endothelialgrowth factor）and HIF-1α（Hypoxia Inducible Factor-1α）expression in Bel-7402 hepatocarcinoma（P＜0.01）.At the same time，YGJDSJalso could significantly decrease distribution of TAMs（Tumor－associated macrophages）in Bel－7402 hepatocarcinoma（P＜0.01）.Conclusion：YGJDSJ can inhibit angiogenesis in hepatocarcinoma and may relate to down-egulation of VEGF，HIF-1αand TAMs.

Hepatocellular carcinoma；angiogenesis；YangGan JieDu SangJie；VEGF；HIF－1α；Tumor－associated macrophages

2016－10－26 編輯：程良斌）

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.03.012

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81473625）；上海市中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動(dòng)計(jì)劃（No.ZY3-CCCX-3-3025）；上海市科技支撐項(xiàng)目（No.16401902500）