漢灘病毒糖蛋白與人溶酶體相關(guān)膜蛋白重組真核表達載體的構(gòu)建表達鑒定及作為基因疫苗的免疫安全性評價

張錦鵬，張冠文，宣國云，孟 強，謝文宇，高 宏，姜東伯，楊 琨

(第四軍醫(yī)大學(xué):1基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研室，2學(xué)員旅，陜西西安710032)

漢灘病毒糖蛋白與人溶酶體相關(guān)膜蛋白重組真核表達載體的構(gòu)建表達鑒定及作為基因疫苗的免疫安全性評價

張錦鵬1，2，張冠文1，2，宣國云1，2，孟 強1，2，謝文宇1，2，高 宏1，2，姜東伯1，楊 琨1

(第四軍醫(yī)大學(xué):1基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研室，2學(xué)員旅，陜西西安710032)

目的:利用pVAX1真核表達載體構(gòu)建漢灘病毒糖蛋白Gn及Gc與人溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP分子的重組真核表達載體，鑒定其在人真核細胞系HeLa中的表達．大量抽提去內(nèi)毒素質(zhì)粒，皮下注射Balb/c小鼠后初步對目標載體作為基因疫苗進行安全性評價．方法:利用PCR的方法分別以漢灘病毒編碼糖蛋白M片段的cDNA為模板，擴增目的基因Gn和Gc，構(gòu)建重組真核表達載體pVAX-Gn、pVAX-LAMP/Gn、pVAX-Gc和pVAX-LAMP/Gc，并進行酶切鑒定和Sanger測序．同時構(gòu)建帶有EGFP標簽的四種重組質(zhì)粒，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，通過熒光顯微鏡觀察結(jié)合免疫熒光檢測目的蛋白的表達．抽提高純度去內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒，采用皮下注射免疫小鼠，并取重要臟器進行組織學(xué)分析．結(jié)果:雙酶切鑒定和測序結(jié)果證實目的基因Gn、LAMP/Gn、Gc和LAMP/Gc成功克隆入真核載體pVAX 1，基因與原序列一致．熒光顯微鏡觀察連有EGFP的表達載體轉(zhuǎn)染的HeLa細胞，可見明顯的綠色熒光，瞬時轉(zhuǎn)染后特異性抗體免疫熒光檢測到目的蛋白的表達．安全性評價結(jié)果顯示Balb/c小鼠耐受性良好，多次注射后無明顯組織形態(tài)學(xué)改變．結(jié)論:成功構(gòu)建了重組嵌合載體pVAX-Gn、pVAX-LAMP/Gn、pVAX-Gc和pVAX-LAMP/Gc，并在真核細胞系中表達出目的蛋白，免疫小鼠顯示了良好的安全性，為后期對漢灘病毒的靶向基因疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)．

漢灘病毒包膜蛋白;LAMP分子;載體構(gòu)建;蛋白表達鑒定;安全性評價

0 引言

腎綜合征出血熱(haemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由漢灘病毒引起的以發(fā)熱、出血、急性腎功能損傷為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，亦稱流行性出血熱．全球每年約有10萬人發(fā)病，死亡率達5%～15%［1］．我國是世界上發(fā)病最為嚴重的國家，占總發(fā)病人數(shù)的90%以上，嚴重威脅我國居民的生命健康與安全．而目前臨床上尚無針對HFRS的特異性治療藥物，因此疫苗被認為是控制該疾病最為行之有效的辦法．目前我國臨床上用于預(yù)防HFRS的疫苗是雙價滅活疫苗，它可以誘導(dǎo)產(chǎn)生一定滴度的中和抗體，對機體產(chǎn)生較為有效的保護作用［2－3］．然而，該疫苗在誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答和長期記憶免疫應(yīng)答方面存在不足，大大降低了它在公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域中的推廣價值［4－5］．現(xiàn)如今基因疫苗因能夠模擬病原體自然感染來激活體內(nèi)免疫應(yīng)答，并在生產(chǎn)、儲存、運輸方面具有優(yōu)勢而成為疫苗研制領(lǐng)域中的熱點．

漢灘病毒是布尼亞病毒科的一種單股負性RNA，其基因組分為三個片段，分別為大(L)、中(M)、小(S)．其中M片段全長僅有一個開放閱讀框編碼包膜糖蛋白復(fù)合體，該前體蛋白在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被切割加工成Gn與Gc兩個糖蛋白［6－7］．Gn與Gc構(gòu)成病毒吸附蛋白，可識別結(jié)合細胞表面病毒受體［8］，并可以刺激機體產(chǎn)生中和抗體．在病毒對機體細胞的侵襲與感染過程中發(fā)揮重要作用．相關(guān)文獻報道，人在自然感染漢灘病毒時，Gn與Gc可誘導(dǎo)機體的特異性免疫應(yīng)答，生成一定量的血清中和抗體［5］．中和抗體在清除體內(nèi)病毒這一過程中扮演重要角色，提示漢灘病毒的Gn與Gc在建立機體對抗病毒感染發(fā)病的特異性免疫保護機制中發(fā)揮重要作用，可做為DNA疫苗的研究靶點［9］．

溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosome-associated membrane protein，LAMP)是位于溶酶體膜上的Ⅰ型穿膜蛋白，由N端溶酶體內(nèi)腔部分、疏水穿膜部分及C末端短胞漿尾構(gòu)成［10］．LAMP分子合成后，其保守的短胞漿尾通過穿膜-胞漿區(qū)定向地結(jié)合亞細胞結(jié)構(gòu)——內(nèi)吞體/溶酶體，主要發(fā)揮靶向轉(zhuǎn)運至溶酶體的重要功能．當編碼目的抗原的基因插入到LAMP分子編碼溶酶體內(nèi)腔部分和胞漿尾的基因之間構(gòu)成嵌合蛋白時，利用LAMP分子的導(dǎo)向作用，可將LAMP融合蛋白中目的抗原直接攜帶進入主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子器室(MHC classⅡ compartment，MIIC)，從而可實現(xiàn)DNA疫苗所表達蛋白從內(nèi)源性抗原的MHC-Ⅰ類加工途徑向外源性抗原的MHC-Ⅱ類加工提呈途徑的轉(zhuǎn)化［11－12］．本研究利用漢灘病毒漢灘型(Hantaan virus，HTNV)包膜糖蛋白Gn和Gc聯(lián)合LAMP靶向作用，構(gòu)建了新型重組嵌合表達載體，在真核細胞系中成功表達并顯示了良好的安全性，為進一步研究新型出血熱基因疫苗奠定了基礎(chǔ)．

1 材料和方法

1．1 材料 pVAX-LAMP為本實驗室前期構(gòu)建保存，含有LAMP分子全長序列的P43-LAMP載體為美國約翰·霍普金斯大學(xué)饋贈．pVAX 1真核表達載體、LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司．引物合成委托北京奧科生物技術(shù)有限責任公司完成．DNA測序委托生工生物技術(shù)(上海)有限公司完成．限制性核酸內(nèi)切酶、PCR試劑均購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒、小量抽提質(zhì)粒試劑盒購自生工生物技術(shù)(上海)有限公司，去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自北京天根生物有限公司，新生牛血清購自杭州四季青責任有限公司，細胞培養(yǎng)基1640為本實驗室配制．HeLa細胞株為本實驗室保存．全長HTNV M片段cDNA、Gn蛋白單克隆抗體由本校微生物教研室提供．三級實驗動物Balb/c小鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心．文中百分比所指代的除化學(xué)藥物的溶液配置為質(zhì)量分數(shù)外，其余均為體積比．

1．2 方法

1．2．1 目的基因的獲取 參考HTNV M片段cDNA基因全序列，使用Primer5．0設(shè)計引物，并送北京奧科公司合成．以HTNV M片段cDNA為模板，在Gn、Gc，上游5'端引入核酸酶切位點KpnI/EcoRI，下游3'端引入Xbal I/Xhol I，擴增Gn、Gc．反應(yīng)體系參照TaKaRa公司rTaq酶操作流程，總體系50 μL;反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1．5 min，重復(fù)30個循環(huán);最后72℃延伸7 min．相關(guān)擴增引物見表1，酶切位點及載體構(gòu)建策略見表1．

1．2．2 重組載體的構(gòu)建與鑒定 將上述PCR方法得到的Gn、Gc基因、pVAX載體、pVAX-LAMP分別以Kpn I、Xba I和Xho I、EcoR I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收目的基因和線性載體，經(jīng)T4DNA連接酶定向連接．構(gòu)建pVAX-Gn、pVAX-LAMP/Gn、pVAXGc和pVAX-LAMP/Gc表達載體．同時構(gòu)建pVAXGc-EGFP和pVAX-LAMP/Gc-EGFP用于檢測目的蛋白的表達(圖1)．轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌經(jīng)卡那霉素篩選陽性克隆，小提質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒行雙酶切鑒定，并送至生工生物(上海)生物技術(shù)公司測序．

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所需引物

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

1．2．3 真核細胞轉(zhuǎn)染 按轉(zhuǎn)染試劑說明書于轉(zhuǎn)染前一天取對數(shù)期Hela細胞1×106接種于六孔板，37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)于含 10%新生牛血清的 PRMI1640培養(yǎng)基中，待細胞融合達70%時，將提取的去內(nèi)毒素質(zhì)粒采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染前1 h換用無血清不完全PRMI1640使細胞同步化，后各取4 μg重組質(zhì)粒pVAX-Gn、pVAX-LAMP/Gn、pVAX-Gc和pVAX-LAMP/Gc與10 μL LipofectamineTM2000脂質(zhì)體混勻后緩慢加入細胞中，6～8 h后換用10%新生牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別取培養(yǎng)上清、細胞裂解上清待檢目的蛋白的表達，另設(shè)兩個對照組細胞:轉(zhuǎn)染pVAX-LAMP質(zhì)粒的陽性對照組及不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的陰性對照組．此外將pVAX-Gc-EGFP和pVAX-LAMP/Gc-EGFP以同樣的方法轉(zhuǎn)染Hela細胞后，熒光顯微鏡觀察融合蛋白表達．

1．2．4 免疫熒光 ①取出重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細胞爬片放在24孔板中，棄去懸浮液，冷 PBS浸泡三遍．②固定:4%冷的多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗三遍．③打孔通透:0．5%Triton通透15 min，PBS洗三遍．④封閉:與3%BSA-PBS室溫封閉30 min，PBS洗三遍．⑤一抗孵育:用鼠單克隆抗體作為一抗過夜，PBS洗三遍．⑥二抗孵育:用FITC標記的山羊抗小鼠抗體作為二抗，室溫10 min(避光)，PBS洗三遍．蒸餾水洗掉PBS．⑦用DAPI室溫復(fù)染細胞核10 min， PBS洗三遍，然后熒光共聚焦顯微鏡直接照熒光片．

1．2．5 安全性分析 20只成年雌性Balb/c小鼠，按照6、7、7分成三組，分別對應(yīng)安慰劑、pVAX-LAMP/ Gc、pVAX-LAMP/Gc，采取尾根部皮下接種的策略，按50 μg/只/次的劑量給藥，第三次接種兩周后取各組小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器組織進行HE染色，觀察有無病理性改變．自第一次皮下接種連續(xù)三個月內(nèi)對實驗對象進行體質(zhì)量監(jiān)測，比較各組間是否存在差異．

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 體質(zhì)量檢測數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差(mean±SD)的呈現(xiàn)方法，與正常安慰劑組的比較選擇student-t檢驗方法．

2 結(jié)果

2．1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 雙酶切結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pVAX-Gn、pVAX-Gc、pVAX-LAMP/Gn、pVAXLAMP/Gc分別經(jīng)Kpn I、Xba I和Xho I、EcoR I雙酶切后，10 g/L瓊脂糖電泳分別可得到約1600 bp、1500 bp的條帶，大小與預(yù)期一致，測序結(jié)果顯示序列完全正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)．

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2．2 EGFP標簽鑒定Gc相關(guān)融合蛋白的表達 將連有EGFP的重組質(zhì)粒pVAX-Gc-EGFP和pVAXLAMP/Gc-EGFP以采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染Hela細胞48 h后，在熒光顯微鏡下，觀察到明顯的綠色熒光，說明該重組質(zhì)粒在真核細胞中有明顯的蛋白表達(圖3)．

圖3 熒光顯微鏡觀察Gc-EGFP和LAMP/Gc-EGFP融合蛋白在HeLa細胞中的表達，倒置相差熒光顯微鏡40倍拍攝

2．3 免疫熒光檢測Gn相關(guān)蛋白的表達 重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，Gn特異性小鼠單克隆抗體和FITC標記的山羊抗小鼠的抗體進行染色后，通過熒光共聚焦顯微鏡觀察到pVAX-Gn、pVAX-LAMP/Gn在真核細胞系中成功表達(圖4)．

圖4 免疫熒光顯微鏡觀察Gn和LAMP/Gn的表達

2．4 安全性分析 疫苗接種組小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦等組織在HE染色后，各重要器官未見病理性改變(圖5)．為期三個月的體質(zhì)量監(jiān)測結(jié)果顯示，皮下接種兩種重組質(zhì)粒對小鼠體質(zhì)量沒有影響(表2、圖6)．

表2 免疫接種前后小鼠體質(zhì)量變化(g，x ±SD)

圖5 安全性評價小鼠重要臟器組織病理學(xué)分析

圖6 免疫接種后三個月小鼠體質(zhì)量變化

3 討論

我國是世界上漢灘病毒引起腎綜合征出血熱最嚴重的國家，現(xiàn)臨床使用的滅活疫苗雖能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生一定量的中和抗體［2－3］，但仍存在免疫原性低，難獲得特異性細胞免疫應(yīng)答和長效免疫記憶能力的問題．現(xiàn)國內(nèi)外研究主要集中于其基因疫苗的研制，并獲得了一定進展［13－14］，但也遇到傳統(tǒng)基因疫苗表達內(nèi)源性抗原，只能通過MHC I類途徑活化CD8+T細胞，不能有效活化CD4+T細胞，缺乏長效記憶免疫等問題［15］．

前期的研究證實，將編碼抗原的基因插入到LAMP分子編碼溶酶體內(nèi)腔部分和胞漿尾基因之間構(gòu)成嵌合體時，利用LAMP分子的靶向作用，可使抗原蛋白直接進入MIIC，實現(xiàn)MHC I類途徑向MHC II類途徑轉(zhuǎn)化，克服傳統(tǒng)DNA疫苗表達內(nèi)源性蛋白單純活化MHC I類抗原提成加工途徑、單純誘導(dǎo)特異性細胞免疫應(yīng)答這一缺陷［16］，同時活化CD4+T細胞高表達CD40L，作為B細胞活化的第二信號使之分化為漿細胞分泌抗體，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，此外活化的CD4+T細胞可以分泌大量的細胞因子來刺激其他免疫細胞活化、增殖、分化，從而也可獲得長效記憶免疫效應(yīng)，提高對疾病的預(yù)防和治療效果［17－18］．

本研究通過分子克隆手段，利用漢灘病毒糖蛋白cDNA成功構(gòu)建重組真核表達載體pVAX-LAMP/Gn、pVAX-LAMP/Gc，瞬時轉(zhuǎn)染真核細胞檢測到目的融合蛋白成功表達．值得注意的是，在鑒定目的蛋白表達的策略選擇上，本課題通過倒置相差熒光顯微鏡對EGFP標簽蛋白表達的直接觀察法確認糖蛋白Gc相關(guān)載體的表達，而在糖蛋白Gn相關(guān)分子的表達鑒定中改用免疫熒光的方法，這是因為漢灘病毒屬于布尼亞病毒屬，目前發(fā)現(xiàn)該屬中絕大多數(shù)病毒的糖蛋白Gn可以激活宿主細胞內(nèi)部的自噬機制，使得具有該分子的融合蛋白無法在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在，從而很難通過熒光標簽蛋白的觀察或粗提蛋白的印跡實驗檢測到目的蛋白的表達［19－20］．目前該領(lǐng)域?qū)n的表達鑒定方法公認為免疫熒光法［21］，因此本研究通過單克隆抗體制備方法獲得Gn特異性的小鼠來源的IgG，采取免疫熒光法成功鑒定了單純和LAMP融合Gn蛋白在真核細胞中的表達．結(jié)合初步安全性評價的良好結(jié)果，該研究為后續(xù)新型漢灘病毒基因疫苗的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)．

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Construction， identification and immune safety of recombinant eukaryotic expression vector through fusing Hantavirus glycoproteinswith lysosome-associated membrane protein

ZHANG Jin-Peng1，2，ZHANG Guan-Wen1，2，XUAN Guo-Yun1，2，MENG Qiang1，2，XIE Wen-Yu1，2，GAO Hong1，2，JIANG Dong-Bo1，YANG Kun1

1Department of Immunology，2Brigade of Cadet，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China

AIM:To construct recombinant eukaryotic expression vector of pVAX-Gn、pVAX-LAMP/Gn、pVAX-Gc and pVAXLAMP/Gc through pVAX1，identify the expression of chimeric protein in Hela cells and evaluate the safety of targeting vector．METHODS:The whole Gn and Gc gene were amplified from the HTNV cDNA by polymerase chain reaction．And then Gn，Gc and LAMP1 chimeric constructs were constructed and termed pVAX-Gn，pVAX-LAMP/Gn，pVAX-Gc and pVAX-LAMP/Gc．Then，the restriction enzyme analysis and Sanger sequencing were performed．The recombinant vectors were transiently transfected into HeLa cells with LipofectamineTM2000 transfection reagent．The expression of chimeric protein was detected through immunofluorescence assay．Meanwhile，pVAX-Gc-EGFP and pVAX-LAMP/Gc-EGFP recombinant plasmids were constructed and transfected into HeLa cells by liposome．The expression of the target protein was observed by fluorescence microscopy．The mice were immunized with the recombinant plasmids，which were extracted endotoxin free．Pathological analysis was performed on the important organs of mice．RESULTS:According to the double restriction enzyme digestion and sequence analysis，the target gene Gn，LAMP/Gn，Gc and LAMP/Gc were successfully cloned into vector pVAX1 and they were consistent with the original sequence．Immunofluorescence showed target protein was expressed in transiently transfected HeLa cells．The transfected HeLa cells were observed by fluorescence microscopy，and the expression vector containing EGFP showed green fluorescence．Balb/c mice were used as animal models to evaluate the safety of the vaccine．The results showed that the mice were well tolerated and there was no pathological change after repeated injections．CONCLUSION:The recombinant chimeric vectors were successfully constructed and expressed in eukaryotic cells，showing good safety．It lays foundation for the further study of Hantavirus targeted gene vaccine．

Hantavirus envelope glycoprotein;molecule LAMP; vector construction;protein expression identification;safety evaluation

R392．12

A

2095-6894(2017)08-36-05

2017－04－11;接受日期:2017－04－26

國家自然科學(xué)基金面上項目(81171977)

張錦鵬．E-mail:418110759@qq．com 張冠文(共同第一作者)．E-mail:1104639827@qq．com 宣國云(共同第一作者)．E-mail:1648924456@qq．com

楊 琨．教授．研究方向:病毒疫苗，腫瘤治療，生物信息學(xué)．E-mail:yangkunkun@fmmu．edu．cn 姜東伯(共同通訊作者)．碩士生．研究方向:病毒疫苗，生物信息學(xué)．E-mail:superjames1991@foxmail．com