Sensititre YeastOne顯色藥敏板與微量肉湯稀釋法檢測(cè)阿薩希毛孢子菌體外藥物敏感性比較研究

郭莉娜 于淑穎 王賀 徐英春

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730)

·論著·

Sensititre YeastOne顯色藥敏板與微量肉湯稀釋法檢測(cè)阿薩希毛孢子菌體外藥物敏感性比較研究

郭莉娜 于淑穎 王賀 徐英春

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730)

目的 以CLSI微量肉湯稀釋法為參考方法，探討商品化顯色藥敏板 (Sensititre YeastOne)檢測(cè)阿薩希毛孢子菌體外藥物敏感性的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 分別用微量肉湯稀釋法和Sensititre YeastOne同時(shí)檢測(cè)62株阿薩希毛孢子菌對(duì)臨床常用7種抗真菌藥物的體外敏感性，MIC值讀取時(shí)間分別為24 h和48 h。結(jié)果 微量肉湯稀釋法結(jié)果顯示卡泊芬凈和米卡芬凈對(duì)阿薩希毛孢子菌無體外活性，二者M(jìn)IC90均為16 μg/mL；唑類藥物對(duì)阿薩希毛孢子菌體外活性較好，培養(yǎng)24 h MIC90分別為氟康唑8 μg/mL、伏立康唑0.125 μg/mL、伊曲康唑0.5 μg/mL；4.8% (3/62)阿薩希毛孢子菌對(duì)兩性霉素B有高M(jìn)IC值 (4 μg/mL)；經(jīng)24 h培養(yǎng)，Sensititre YeastOne與微量肉湯稀釋法檢測(cè)阿薩希毛孢子菌對(duì)7種抗真菌藥物的體外MIC一致率 (essential agreement,EA)分別為氟康唑93.5%，伏立康唑98.4%，伊曲康唑98.4%，兩性霉素B 98.4%，5-氟胞嘧啶88.7%，卡泊芬凈100%，米卡芬凈100%；培養(yǎng)48 h后，二者檢測(cè)兩性霉素B和5-氟胞嘧啶MIC一致率有所下降，分別為83.9%和67.7%；對(duì)微量肉湯稀釋法而言，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)兩性霉素B和5-氟胞嘧啶MIC值影響較大，24 h和48 h MIC一致率分別為69.4%和53.2%，對(duì)Sensititre YeastOne，MIC值明顯受培養(yǎng)時(shí)間影響的藥物僅見于5-氟胞嘧啶，24 h和48 h MIC一致率為11.3%，其余藥物不同MIC讀取時(shí)間一致率非常好。結(jié)論 唑類藥物對(duì)阿薩希毛孢子菌體外抗菌活性較好，Sensititre YeastOne和微量肉湯稀釋法檢測(cè)阿薩希毛孢子菌體外MIC值一致率較高，用于臨床阿薩希毛孢子菌體外藥物敏感性檢測(cè)具有一定的實(shí)用價(jià)值。

阿薩希毛孢子菌；藥敏試驗(yàn)；微量肉湯稀釋法；Sensititre YeastOne

毛孢子菌屬 (Trichosporon)廣泛存在于自然界中，引起人類感染的毛孢子菌有幾十種，其中阿薩希毛孢子菌最多見。阿薩希毛孢子菌不僅引起淺部感染，如毛發(fā)、指甲、皮膚的白毛結(jié)節(jié)病，還導(dǎo)致免疫受損人群系統(tǒng)性感染。毛孢子菌血流感染已成為血液腫瘤患者真菌血癥的第2位非念珠菌酵母菌，其中導(dǎo)管相關(guān)性菌血癥最常見，臨床診斷中易與念珠菌型菌血癥相混淆[1-2]。毛孢子菌血流感染嚴(yán)重威脅患者生命，死亡率高達(dá)43%～76%[2]，感染早期選擇合適的抗真菌藥物對(duì)提高患者生存率至關(guān)重要。毛孢子菌野生株對(duì)唑類抗真菌藥物一般是敏感的，部分菌株對(duì)兩性霉素B體外MIC值偏高[3]。近年來隨著抗真菌藥物大范圍預(yù)防應(yīng)用，在藥物選擇性壓力下，毛孢子菌唑類耐藥性及泛耐藥菌株的報(bào)道在增多[4-6]，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室積極開展抗真菌藥物體外敏感性檢測(cè)，對(duì)臨床醫(yī)生合理使用抗真菌藥物并進(jìn)行有效治療具有重要指導(dǎo)意義。

目前，真菌體外藥物敏感性試驗(yàn)方法有多種，包括微量肉湯稀釋法、紙片擴(kuò)散法及多種商品化試劑盒，如ATB fungus 3，Etest試條等，其中美國(guó)國(guó)家臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì) (CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，存在的主要問題是操作繁瑣，耗時(shí)耗力，臨床實(shí)踐應(yīng)用中有一定的局限性。本研究采用商品化的藥敏板條Sensititre YeastOne和CLSI推薦的微量肉湯稀釋法同時(shí)測(cè)定62株阿薩希毛孢子菌對(duì)7種抗真菌藥物的體外MIC值，以微量肉湯稀釋法為參考方法，探討Sensititre YeastOne對(duì)阿薩希毛孢子菌體外藥物敏感性的檢測(cè)能力。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究所用62株阿薩希毛孢子菌來自中國(guó)侵襲性真菌監(jiān)測(cè)網(wǎng) (CHIF-NET2010～2014)和北京地區(qū)侵襲性真菌監(jiān)測(cè)網(wǎng) (BJIF-NET2012～2013)，其中分離自血液標(biāo)本26株，腹水10株，導(dǎo)管10株，腦脊液4株，支氣管肺泡灌洗液2株，膿液4株，關(guān)節(jié)液2株，胸水2株，傷口分泌物2株，質(zhì)控菌株ATCC22019近平滑念珠菌和ATCC6258克柔念珠菌。

1.2 材料與儀器

氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、5-氟胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品 (中國(guó)食品藥品檢定研究院)；注射用兩性霉素B (華北制藥股份有限公司);注射用醋酸卡泊芬凈 (默沙東公司)；注射用米卡芬凈鈉 (安斯泰來制藥中國(guó)有限公司)；科瑪嘉顯色培養(yǎng)基 (法國(guó)科瑪嘉公司)；沙堡弱培養(yǎng)基 (英國(guó)OXOID公司);RPMI 1640培養(yǎng)基，含谷氨酰胺不含碳酸氫鹽并以酚紅為指示劑，使用0.165 mol/L MOPS緩沖液調(diào)pH7.0±0.1 (德國(guó)sigma-aldrich公司)；無菌U型96孔板 (江蘇省海門盛泰實(shí)驗(yàn)器材廠)；Sensititre YeastOne藥敏板及接種肉湯 (賽默飛世爾科技公司)；全自動(dòng)加樣儀器Sensititre AIM○R(賽默飛世爾科技公司)。

1.3 方法

菌種鑒定 所有菌株純培養(yǎng)物采用核糖體rDNA IGS1區(qū)序列分析的方法準(zhǔn)確定種，引物序列見文獻(xiàn)[7]。

微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn) 參考方法操作嚴(yán)格按照CLSI M27-A3[8]進(jìn)行，結(jié)果讀取時(shí)間分別為24 h和48 h。

Sensititre YeastOne藥敏試驗(yàn) 試驗(yàn)方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，從經(jīng)24 h分離純化培養(yǎng)的沙氏培養(yǎng)基 (SDA)上挑取若干單個(gè)菌落至無菌生理鹽水中，使用標(biāo)準(zhǔn)比濁管將菌懸液調(diào)節(jié)至 (1～5)×106CFU/mL (即0.5 McF arland)；取20 μL上述菌懸液接種至11 mL YeastOne接種肉湯，得到終濃度為 (1.5～8)×103CFU/mL的菌懸液；使用全自動(dòng)加樣儀器Sensititre AIM○R，向Sensititre YeastOne藥敏板每孔加上述菌懸液100 μL；菌落計(jì)數(shù)質(zhì)控，取10 μL陽性對(duì)照孔內(nèi)的菌液接種至SDA上進(jìn)行培養(yǎng)，正常的接種應(yīng)得10～80菌落數(shù)；用黏性封膜密封所有孔，置35℃的空氣孵育箱中孵育24 h和48 h；結(jié)果讀取，酵母菌生長(zhǎng)可通過反應(yīng)孔明顯顏色變化進(jìn)行識(shí)別，通常由藍(lán)色 (陰性)變成紅色 (陽性)，與生長(zhǎng)對(duì)照孔相比第1個(gè)出現(xiàn)明顯顏色變化的孔的藥物濃度判讀為MIC值。

質(zhì)量控制 質(zhì)控菌株ATCC22019近平滑念珠菌和ATCC6258克柔念珠菌隨試驗(yàn)菌株平行操作，微量肉湯稀釋法和Sensititre YeastOne所測(cè)得的MIC結(jié)果均應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)。

結(jié)果分析 按照文獻(xiàn)[9]報(bào)道的方法，總一致率 (Essential Agreement,EA)：實(shí)驗(yàn)方法與參考方法MIC值差異不超過兩個(gè)稀釋度 (包含)的菌株占總測(cè)定株數(shù)的比例，并將兩種方法檢測(cè)所得的MIC50、MIC90進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)控結(jié)果

菌落計(jì)數(shù) Sensititre YeastOne藥敏試驗(yàn)中隨機(jī)抽取5塊藥敏板陽性對(duì)照孔內(nèi)的菌懸液10 μL接種到SDA平皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)均介于10～80。

質(zhì)控結(jié)果 7種抗真菌藥物對(duì)質(zhì)控菌株ATCC22019近平滑念珠菌和ATCC6258克柔念珠菌的MIC檢測(cè)結(jié)果及允許范圍見表1。

2.2 體外藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果

62株阿薩希毛孢子菌對(duì)7種抗真菌藥物體外藥物敏感性結(jié)果見表2。微量肉湯稀釋法結(jié)果顯示：卡泊芬凈和米卡芬凈對(duì)阿薩希毛孢子菌無體外抗菌活性，二者M(jìn)IC90均為16 μg/mL；唑類藥物對(duì)阿薩希毛孢子菌體外活性較好，培養(yǎng)24 h MIC90分別為氟康唑8 μg/mL、伏立康唑0.125 μg/mL、伊曲康唑0.5 μg/mL；兩性霉素B和5-氟胞嘧啶MIC90分別為2 μg/mL和4 μg/mL，其中3株阿薩希毛孢子菌對(duì)兩性霉素B有高M(jìn)IC值 (4 μg/mL)，由于目前阿薩希毛孢子菌無可參考體外藥物敏感性判定折點(diǎn)，故而無法判定敏感和耐藥。經(jīng)24 h培養(yǎng)，兩種方法檢測(cè)一致率非常好，分別為卡泊芬凈100%、米卡芬凈100%、氟康唑93.5%、伏立康唑98.4%、伊曲康唑98.4%、兩性霉素B 98.4%及5-氟胞嘧啶88.7%；對(duì)氟康唑和伏立康唑，Sensititre YeastOne檢測(cè)MIC50/MIC90均2倍于微量肉湯稀釋法，對(duì)伊曲康唑，結(jié)果正好相反。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種方法檢測(cè)檢測(cè)阿薩希毛孢子菌MIC一致率有部分降低，主要見于兩性霉素B (83.9%)和5-氟胞嘧啶(67.7%)。

表1 質(zhì)控菌株MIC允許范圍及檢測(cè)結(jié)果-24 h (μg/mL)

2.3 同一種檢測(cè)方法24 h和48 h MIC值一致率

不同培養(yǎng)時(shí)間部分抗真菌藥物對(duì)阿薩希毛孢子菌MIC值變化較大 (見表3)。本研究中，對(duì)于微量肉湯稀釋法，兩性霉素B和5-氟胞嘧啶培養(yǎng)24 h和48 h MIC值一致率較低，分別為69.4%和53.2%，48 h MIC904～8倍于24 h MIC90值，其余5種抗真菌藥物MIC值受培養(yǎng)時(shí)間影響較??；對(duì)于Sensititre YeastOne，大多數(shù)藥物培養(yǎng)24 h和48 h MIC值一致率非常高 (96.8%～100%)，僅5-氟胞嘧啶一致率為11.3%，48 h MIC9016倍于24 hMIC90值。

表2 Sensititre YeastOne與微量肉湯稀釋法檢測(cè)62株阿薩希毛孢子菌體外藥物敏感性比較-24 h/48 h

Tab.2 MIC distribution and essential agreements of 62T.asahiiisolates determined by Sensititre YeastOne and broth microdilution method at 24/48 h

抗真菌藥物藥敏方法MIC(μg/mL)-24hMIC(μg/mL)-48h50%90%Range50%90%RangeEA(24/48h)氟康唑YST8161-328162～3293.5/93.5BMD480.5～16480.5～32伏立康唑YST0.1250.250.032～10.250.50.064～198.4/98.4BMD0.0640.1250.016～0.50.1250.250.016～0.25伊曲康唑YST0.250.250.125～10.50.50.125～198.4/100BMD0.50.50.125～10.510.125～1兩性霉素BYST220.5～41161～1698.4/83.9BMD120.125～44161～325-氟胞嘧啶YST441～12832640.5～12888.7/67.7BMD240.25～168161～32卡泊芬凈YST16168～16161616～16100/100BMD16164～1616168～16米卡芬凈YST161616～16161616～16100/100BMD161616～16161616～16

表3 同一方法檢測(cè)阿薩希毛孢子菌體外藥物敏感性24 h和48 h MIC值一致率 (EA)

3 討 論

毛孢子菌病，特別是侵襲性毛孢子菌感染發(fā)生率雖低于念珠菌及曲霉菌感染，但近年來有增多的趨勢(shì)。毛孢子菌感染實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴于真菌培養(yǎng)及血培養(yǎng)，鑒定中存在的問題是在顯色培養(yǎng)基上易與白念珠菌或熱帶念珠菌混淆，生化鑒定方法API 20C和Vitek 2 compact對(duì)阿薩希毛孢子菌鑒定正確率分別為91.7%和75%，核糖體rRNA IGS序列分析可將阿薩希毛孢子菌準(zhǔn)確鑒定到種[10]。血清1,3-beta-D-葡聚糖 (BDG)檢測(cè)對(duì)毛孢子菌感染診斷價(jià)值較小，Kei Suzuki等[2]研究顯示，25例毛孢子菌血流感染，只有48% (12/25)血清BDG值升高，而先于血培養(yǎng)報(bào)警的只有16% (4/25)。

早期及時(shí)選擇敏感的抗真菌藥物對(duì)毛孢子菌感染預(yù)后有積極影響，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室積極開展毛孢子菌體外藥物敏感性檢測(cè)有利于臨床抗真菌治療。本研究所評(píng)估商品化藥敏板Sensititre YeastOne，抗真菌藥物包埋于96孔板底，只需室溫保存，每塊板獨(dú)立包裝，隨用隨取，既免除稱量抗真菌藥物、配制梯度濃度的藥液、手工制作藥敏板的系列復(fù)雜操作，降低錯(cuò)誤概率，又節(jié)省了勞動(dòng)力，相對(duì)于微量肉湯稀釋法有明顯優(yōu)勢(shì)。另外，Sensititre YeastOne終點(diǎn)判讀是根據(jù)反應(yīng)孔顏色改變來識(shí)別，結(jié)果判讀更為客觀，可以很大程度降低假耐藥或假敏感情況發(fā)生，為臨床提供準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果，而微量肉湯稀釋法結(jié)果讀取對(duì)操作者經(jīng)驗(yàn)要求很高，更適用于科研機(jī)構(gòu)或大型三甲醫(yī)院，對(duì)于三級(jí)以下醫(yī)院實(shí)用性不強(qiáng)。

目前CLSI無專門針對(duì)毛孢子菌體外藥物敏感性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)文件，現(xiàn)有操作多參照念珠菌屬，敏感性判定折點(diǎn)無可參考標(biāo)準(zhǔn)，故無法計(jì)算敏感率等指標(biāo)。從本研究MIC值分布來看，卡泊芬凈和米卡芬凈無體外抗菌活性，MIC50/MIC90均為16 μg/mL,這與國(guó)外報(bào)道一致[2,11]，體內(nèi)療效亦不佳，Kei Suzuki等[2]回顧了日本33例血液腫瘤患者毛孢子菌血流感染，發(fā)現(xiàn)一半以上患者毛孢子菌血流感染之前曾使用米卡芬凈預(yù)防或經(jīng)驗(yàn)性治療，米卡芬凈抑制了其他敏感性真菌，而對(duì)米卡芬凈耐藥的毛孢子菌被篩選出來，繼而發(fā)生侵襲性血流感染。

經(jīng)24 h孵育，Sensititre YeastOne和微量肉湯稀釋法分別有82.3% (51/62)和27.4% (17/62)阿薩希毛孢子菌對(duì)兩性霉素B有高M(jìn)IC值 (≥2 μg/mL)，其中9.7%和4.8%的菌株MIC為4 μg/mL，臺(tái)灣、日本等也有類似報(bào)道[2-4]。本研究中唑類藥物對(duì)阿薩希毛孢子菌顯示了較好的體外抗菌活性，特別是伏立康唑和伊曲康唑，Sensititre YeastOne和微量肉湯稀釋法檢測(cè)的MIC90分別為0.25/0.125 μg/mL和0.25/0.5 μg/mL，Kei Suzuki等[2]比較了使用唑類和兩性霉素B治療毛孢子菌血流感染的臨床療效，6例單獨(dú)使用兩性霉素B治愈率為0，聯(lián)合兩性霉素B和三唑類14例治愈率為35.7%，單獨(dú)使用唑類8例，治愈率為37.5%，可見三唑類藥物對(duì)治療毛孢子菌感染的重要地位。

本研究顯示，Sensititre YeastOne檢測(cè)結(jié)果與微量肉湯稀釋法相比總體一致率較好，介于88.7%～100%，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)5-氟胞嘧啶MIC影響較多，培養(yǎng)48 h后MIC值更高，但由于缺乏相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，毛孢子菌體外藥物敏感性檢測(cè)讀取MIC值最佳時(shí)間仍然未知。不同于念珠菌屬，阿薩希毛孢子菌對(duì)唑類藥物敏感性試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)明顯拖尾現(xiàn)象，24 h和48 h的MIC值一致率非常高。Sensititre YeastOne用于念珠菌體外藥物敏感性檢測(cè)的報(bào)道非常多，其檢測(cè)的便捷性和準(zhǔn)確性已得到廣泛的認(rèn)可[12-13]，但專門用于毛孢子菌藥敏檢測(cè)的報(bào)道并不多見[14]，因此本研究對(duì)闡述Sensititre YeastOne應(yīng)用于阿薩希毛孢子菌體外藥物敏感性檢測(cè)的價(jià)值具有一定的實(shí)用性。

綜上所述，Sensititre YeastOne檢測(cè)阿薩希毛孢子菌體外藥物敏感性與標(biāo)準(zhǔn)化微量肉湯稀釋法一致性較好，操作簡(jiǎn)便、結(jié)果易于判讀，可望用于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)。

致謝：非常感謝所有參加CHIF-NET2010-2014和首發(fā)專項(xiàng)2012-2013的單位和老師們。

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[本文編輯] 王 飛

Comparative evaluation of Sensititre YeastOne colorimetric panel with broth microdilution methods for antifungal susceptibility testing ofTrichosporonasahiiisolates

GUO Li-na,YU Shu-Ying,WANG He,XU Ying-chun

(ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollegeHospital,DepartmentofClinicalLaboratory,Beijing100730)

Objective To assess the utility of a commercially prepared,colorimetric microdilution panel (Sensititre YeastOne) for testingT.asahiiisolates.Methods A total of 62T.asahiiisolates against seven antifungal agents were detected simultaneously by both Sensititre YeastOne and broth microdilution method.The broth microdilution method was adopted as reference method.MIC endpoints were read after 24 h and 48 h of incubation.Results Susceptibility results by broth microdilution method:caspofungin and micafungin showed noinvitroantifungal activities againstT.asahii,both of their MIC90s were 16 μg/mL.Azoles had good antifungal activities againstT.asahiiisolates,MIC90were fluconazole (8 μg/mL),voriconazole (0.125 μg/mL) and itraconazole (0.5 μg/mL) at 24 h incubation.Three isolates (4.8%,3/62) ofT.asahiihad high MICs (4 μg/mL) against amphotericin B.After 24 h incubation,essential agreement (EA) between broth microdilution method and Sensititre YeastOne in seven agents were fluconazole (93.5%)，voriconazole (98.4%)，itraconazole (98.4%)，amphotericin B (98.4%)，5-flucytosine (88.7%)，caspofungin(100%)，micafungin(100%),respectively;EA between the two methods decreased to 83.9% (amphotericin B) and 67.7% (flucytosine) when MICs were determined at 48 h incubation.For broth microdilution method,poor agreement was observed mainly for amphotericin B (69.4%) and flucytosine (53.2%),while for Sensititre YeastOne,the overall EA of 24 h and 48 h MICs were excellent except for flucytosine (11.3%).Conclusions Azoles had goodinvitroantifungal activities againstT.asahiiisolates.The Sensititre YeastOne appeared to be comparable to the CLSI broth microdilution method in testingT.asahiiisolates and could be used as an alternative for susceptibility testing ofT.asahiiisolates in clinical laboratories.

T.asahii；antifungal susceptibility;broth microdilution;Sensititre YeastOne

198-202]

R 379.9

A

1673-3827(2017)12-0198-05

2016-11-28