菌絲霉素MP1106融合蛋白的復(fù)性及純化方法

王鵬舉 譚煥波 蘇文成 張文宇 鄒培建

（中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

菌絲霉素MP1106融合蛋白的復(fù)性及純化方法

王鵬舉 譚煥波 蘇文成 張文宇 鄒培建

（中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

旨在建立高效、快捷的菌絲霉素衍生物MP1106大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)基因融合的方式構(gòu)建生物表面活性劑-菌絲霉素衍生物（DAMP4-MP1106）融合蛋白表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)；并對(duì)目的蛋白MP1106進(jìn)行分離純化和分子內(nèi)二硫鍵鑒定。結(jié)果顯示，融合蛋白DAMP4-MP1106在大腸桿菌中以包涵體的形式成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物在變性條件下經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化；經(jīng)檢測(cè)分析，搖瓶中DAMP4-MP1106的發(fā)酵產(chǎn)量為118 mg/L，純度為94.7%；采用96孔板篩選并建立復(fù)性方法，獲得水溶性融合蛋白DAMP4-MP1106；并經(jīng)TEV蛋白酶酶切以及二次Ni2+-NTA親和層析純化，可獲得純度為99%的抗菌肽MP1106 18 mg/L，回收率達(dá)到了38.4%。通過(guò)簡(jiǎn)捷方法快速鑒定分子內(nèi)的二硫鍵，初步證實(shí)了抗菌肽MP1106完成了分子內(nèi)結(jié)構(gòu)正確折疊。建立了高效快捷的菌絲霉素大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。

抗菌肽；菌絲霉素；蛋白融合；復(fù)性；蛋白純化

菌絲霉素是第一例被報(bào)道的真菌防御素，其抗菌機(jī)制清晰，藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究透徹，對(duì)人的細(xì)胞無(wú)毒害作用，且能通過(guò)微生物重組制備，還可借助已經(jīng)解析的三維結(jié)構(gòu)對(duì)其抗菌活性進(jìn)行改造提升［1-3］。鑒于此，菌絲霉素被公推為最具有臨床應(yīng)用潛力的三大抗菌肽之一［4］。

菌絲霉素與細(xì)菌細(xì)胞壁前體Lipid II以1∶1的化學(xué)計(jì)量結(jié)合，阻止病菌細(xì)胞壁的形成，從而阻止病菌繁殖。獨(dú)特的作用機(jī)制促使了菌絲霉素不易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性菌株［5］。NMR三維結(jié)構(gòu)分析顯示，G6、W8、D9、A31、K32、G33、G34、F35、V36和C37這10個(gè)殘基參與了菌絲霉素與Lipid II中的焦磷酸鹽形成氫鍵［5］。菌絲霉素的作用機(jī)制明晰，為其進(jìn)一步功能性改造優(yōu)化奠定了理論基礎(chǔ)［5］。Schneider 等［5］通過(guò)單點(diǎn)飽和突變實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了D12、Y29和G33對(duì)菌絲霉素的功能至關(guān)重要，不能更改替換；A31和K38僅能做同類氨基酸替換，即：A31-G；K38-R。有趣的是，張琪等［6］通過(guò)易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化菌絲霉素，獲得了抑菌活性增強(qiáng)的突變體A31R。Cao等［7］將菌絲霉素氨基酸序列進(jìn)行替換改造（D9-S、D11-K、Q14-H和V36-I），將正電荷氨基酸和疏水氨基酸比例提高，獲得了抗菌活力增強(qiáng)的菌絲霉素衍生物MP1106。除此之外，菌絲霉素改造后的類似物NZ2114、AgPlectasin（rAgP）和MP1102對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有較高的專一性，抗菌效果等同于甚至優(yōu)于現(xiàn)有的青霉素和萬(wàn)古霉素［8-10］。

從原始真菌中提取或化學(xué)合成菌絲霉素均面臨著工藝復(fù)雜、產(chǎn)率低或成本高等問(wèn)題。已有多個(gè)學(xué)者對(duì)構(gòu)建基因工程菌生產(chǎn)菌絲霉素進(jìn)行了研究，包括原核表達(dá)和真核表達(dá)。Wang［9，11-13］實(shí)驗(yàn)室利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)重組制備了菌絲霉素及其衍生物，產(chǎn)量達(dá)到了克級(jí)每升，為其產(chǎn)業(yè)化奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，但其穩(wěn)定性和半衰期較差，無(wú)法滿足實(shí)際應(yīng)用需求。與此同時(shí)，Zhang［14］團(tuán)隊(duì)使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，將菌絲霉素與Trx-tag融合表達(dá)，經(jīng)Factor Xa酶切，酶切效率較低，搖瓶發(fā)酵得到3.5 mg/L純菌絲霉素，產(chǎn)率僅為理論得率的20%。Chen 等［15］系統(tǒng)研究了菌絲霉素與蛋白標(biāo)簽TrxA、SUMO、Intein和GST融合表達(dá)，通過(guò)蛋白酶酶切將菌絲霉素與標(biāo)簽蛋白分離，酶切不完全，菌絲霉素產(chǎn)量較低。Chen［16］實(shí)驗(yàn)室采用大腸桿菌系統(tǒng)重組表達(dá)菌絲霉素，使用凝血酶酶切除去GST標(biāo)簽蛋白，酶切效率較低，目標(biāo)產(chǎn)物搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為1.6 mg/L。大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)室常用的表達(dá)系統(tǒng)，具有培養(yǎng)周期短，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，為了便于對(duì)菌絲霉素進(jìn)行功能性改造升級(jí)，提高目標(biāo)產(chǎn)物與標(biāo)簽蛋白的分離效率，急需建立一個(gè)針對(duì)菌絲霉素的高效的大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)。本研究首次擬將菌絲霉素衍生物MP1106與人工設(shè)計(jì)的生物表面活性劑DAMP4基因融合，使用大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)包涵體復(fù)性純化，使用本實(shí)驗(yàn)室制備的高活性煙草蝕紋病毒蛋白酶（Tobacco Etch Virus，TEV）酶切分割，純化制備出高純度抗菌肽MP1106，旨為菌絲霉素后續(xù)改造進(jìn)化實(shí)驗(yàn)建立高效、快捷的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 菌種E.coli BL21（DE3）和質(zhì)粒pET-28a均保存于中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑 卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；煙草蝕紋病毒蛋白酶由本實(shí)驗(yàn)室重組制備；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)買于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；目的基因MP1106通過(guò)中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所技術(shù)支撐平臺(tái)全基因合成；Ni2+-NTA親和層析填料購(gòu)買于美國(guó)GE公司；本實(shí)驗(yàn)所使用的其它化學(xué)試劑均為分析純。1.2 方法

1.2.1 DAMP4-MP1106融合蛋白的基因設(shè)計(jì)與合成 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［17-19］，將具有耐高溫（90℃，30 min）、溶解度高、可調(diào)控等特點(diǎn)的人工設(shè)計(jì)的生物表面活性劑DAMP4開發(fā)成重組蛋白純化制備的融合標(biāo)簽，與MP1106氨基末端融合，并在DAMP4與MP1106中間插入TEV識(shí)別位點(diǎn)序列，蛋白純化后經(jīng)TEV酶切，便可獲得抗菌肽MP1106。為了便于目的蛋白的Western-blot檢測(cè)和Ni2+-NTA純化，在DAMP4氨基末端融合了6個(gè)His殘基。最后將融合蛋白基因送至中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所技術(shù)支撐平臺(tái)按照大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化和全基因合成，并采用EcoR I/Xho I將融合蛋白基因插入pET-28a表達(dá)載體。目的蛋白基因設(shè)計(jì)圖示及序列如圖1所示。

圖1 DAMP4-MP1106融合蛋白基因的設(shè)計(jì)及序列

1.2.2 DAMP4-MP1106融合蛋白的原核表達(dá)及加熱處理 將合成的質(zhì)粒pET-28a（His6-DAMP4-TEVMP1106）轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli BL21（DE3），使用TB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)OD至0.6。TB培養(yǎng)基配方如下：1.2%（W/V）tryptone；2.4%（W/V）yeast extract；0.4%（V/V）glycero；17 mmol/L KH2PO4；72 mmol/L K2HPO4。加入IPTG，終濃度為1 mmol/L，16℃過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。使用落地離心機(jī)4℃，5 000×g離心20 min，收集菌體。按照1∶10（W/V）使用高鹽緩沖液（50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，500 mmol/L Na2SO4，pH6.0）懸浮，90℃加熱30 min。4℃，12 000×g 離心40 min，使用SDS-PAGE（NuPAGEs Novex 4-12% Bis-Trisgels）電泳檢測(cè)上清和沉淀。

1.2.3 抗菌肽MP1106純化制備工藝 鑒于DAMP4-MP1106融合蛋白以包涵體的形式在宿主體內(nèi)大量表達(dá)和積累，建立了抗菌肽MP1106的包涵體復(fù)性、純化制備工藝流程圖，如圖2所示。

圖2 抗菌肽MP1106的純化制備工藝

1.2.4 DAMP4-MP1106融合蛋白的純化制備 將離心收集到的菌體使用裂解緩沖液（50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；150 mmol/L NaCl；pH6.0）按照1∶10（W∶V）比例懸浮；使用高壓勻漿破碎儀，700 bar破碎3個(gè)循環(huán)；使用落地離心機(jī)4℃，12 000×g 離心40 min分離上清和沉淀；使用等體積的2% Trition-X-100冰水溶液懸浮、洗滌沉淀；在裂解緩沖液中加入尿素，配置終濃度依次為3-8 mol/L的變性緩沖液，按照1∶5（W∶V）比例分別懸浮、溶解沉淀，4℃攪拌30 min；12 000×g 離心40 min分離上清和沉淀。使用SDS-PAGE對(duì)上述實(shí)驗(yàn)流程中得到的樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)分析。

使用優(yōu)化出來(lái)的變性劑尿素濃度溶解包涵體，高速離心，分離收集上清；與使用同樣緩沖液平衡后的Ni2+-NTA填料混合，4℃孵育1 h；轉(zhuǎn)入重力柱分離未結(jié)合的雜蛋白，加入5倍柱體積含有30 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌；配制含有300 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液，一次一個(gè)柱體積，洗滌4次。將上述每步收集到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析，將含有DAMP4-MP1106融合蛋白且純度較高的洗脫液進(jìn)行合并混合。

配置pH1-12的系列緩沖液（氯化鉀-鹽酸緩沖液：pH1、pH2；磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：pH3、pH4、pH5、pH6、pH7；Tris-鹽酸緩沖液：pH8；甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液：pH9；碳酸鈉-氫氧化鈉緩沖液：pH10；磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液：pH 11；氯化鉀-氫氧化鈉緩沖液：pH12）。使用96孔板按照180∶20的比例使用系列pH的緩沖液10倍稀釋DAMP4-MP1106融合蛋白樣品，使用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)樣品孔中的A310值。選取渾濁度最低的緩沖液作為復(fù)性緩沖液，將DAMP4-MP1106融合蛋白進(jìn)行4℃過(guò)夜透析復(fù)性。

1.2.5 TEV酶切His6-DAMP4-TEV-MP1106融合蛋白 將45 mL DAMP4-MP1106融合蛋白水溶液與5 mL的10×TEV酶切緩沖液（500 mmol/L Tris-HCl；50 mmol/L EDTA；26 mmol/L β巰基乙醇；10 mmol/L DTT；pH8.0）混合，加入0.5 mL TEV蛋白酶，室溫酶切2 h。轉(zhuǎn)至4℃層析柜，在裂解緩沖液中透析過(guò)夜。按照上述Ni2+-NTA親和層析方法進(jìn)行二次純化，去除His6-DAMP4標(biāo)簽和TEV酶（氨基末端融合有His6標(biāo)簽），得到高純度抗菌肽MP1106。1.2.6 抗菌肽MP1106分子內(nèi)二硫鍵的鑒定 本研究通過(guò)在SDS-PAGE電泳制樣緩沖液中加入20 mmol/L DTT，破壞DAMP4-MP1106融合蛋白和抗菌肽MP1106分子內(nèi)的二硫鍵，使其分子結(jié)構(gòu)松散，SDS-PAGE電泳遷移率降低，表觀分子量變大，以此初步鑒定MP1106分子內(nèi)的二硫鍵是否正確形成。

2 結(jié)果

2.1 DAMP4-MP1106融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及加熱處理

使用SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析MP1106融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況，結(jié)果如圖3泳道3所示，25 kD和15 kD Mark條帶間有條明顯的誘導(dǎo)條帶，分子量和DAMP4-MP1106融合蛋白分子量（20.0 kD）相符。DAMP4-MP1106融合蛋白經(jīng)高鹽高溫處理后，離心分離得到的上清和沉淀，SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖3泳道4和泳道5所示，全部蛋白均存在于沉淀樣品中。

圖3 SDS-PAGE電泳檢測(cè)DAMP4-MP1106融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和加熱處理

將誘導(dǎo)后菌體進(jìn)行高壓勻漿破碎，使用SDSPAGE電泳檢測(cè)分析DAMP4-MP1106融合蛋白可溶性表達(dá)情況。結(jié)果如圖4泳道4和泳道5，DAMP4-MP1106融合蛋白全都以包涵體形式存在，經(jīng)Bio-Rad凝膠成像儀Quantify One軟件檢測(cè)分析，DAMP4-MP1106融合蛋白約占總蛋白23.3%。

2.2 DAMP4-MP1106融合蛋白包涵體洗滌和溶解

選用2%的Triton X-100溶液洗滌DAMP4-MP1106融合蛋白包涵體，結(jié)果如圖4泳道6所示，部分雜蛋白被洗滌除去。

圖4 DAMP4-MP1106融合蛋白的純化制備

使用尿素濃度依次為3-8 mol/L的變性緩沖液分別溶解等量的DAMP4-MP1106融合蛋白包涵體，SDS-PAGE電泳檢測(cè)溶解上清，結(jié)果如圖5所示。隨著變性劑尿素濃度增高，對(duì)包涵體蛋白的溶解能力也逐漸提高，其中溶解雜蛋白的能力在尿素濃度6 mol/L和7 mol/L間有大幅度地提高。選用含有6 mol/L尿素的緩沖液溶解DAMP4-MP1106融合蛋白包涵體，進(jìn)行后續(xù)純化。如圖4泳道7所示，DAMP4-MP1106融合蛋白純度提高到54.2%。

圖5 使用梯度濃度尿素變性溶解DAMP4-MP1106融合蛋白包涵體

2.3 Ni2+-NTA親和層析純化制備DAMP4-MP1106融合蛋白

按照Ni2+-NTA親和層析方法對(duì)DAMP4-MP1106融合蛋白進(jìn)行純化，圖4泳道8為未結(jié)合的雜蛋白流穿，圖4泳道9為低濃度咪唑（50 mmol/L）洗滌下來(lái)的結(jié)合不牢固或非特異性結(jié)合的雜蛋白，圖4泳道10為高濃度咪唑（500 mmol/L）洗脫下來(lái)的目的蛋白。純化后，DAMP4-MP1106融合蛋白純度達(dá)到了90.7%。

2.4 DAMP4-MP1106融合蛋白復(fù)興條件篩選

將DAMP4-MP1106融合蛋白的6 mol/L 尿素溶液使用pH1-12的緩沖液和超純水進(jìn)行10倍稀釋，測(cè)定其A310值。結(jié)果如圖6所示，pH1-5的A310值較低，對(duì)應(yīng)的DAMP4-MP1106融合蛋白的溶解度較高；pH5到pH6間A310值迅速升高，對(duì)應(yīng)著DAMP4-MP1106融合蛋白的溶解度迅速降低；超純水溶液所對(duì)應(yīng)的DAMP4-MP1106融合蛋白的溶解度也較低。鑒于此，本研究選用pH4的緩沖液透析DAMP4-MP1106融合蛋白進(jìn)行蛋白復(fù)性，結(jié)果如圖4泳道11所示，軟件檢測(cè)分析，DAMP4-MP1106融合蛋白純度提高到94.7%。

圖6 MP1106融合蛋白的溶解度與pH的關(guān)系

2.5 蛋白酶TEV酶切His6-DAMP4-TEV-MP1106融合蛋白

將純化制備得到的水溶性DAMP4-MP1106融合蛋白使用TEV蛋白酶酶切，結(jié)果如圖7所示，泳道1為TEV蛋白酶，分子量約25 kD。泳道2為TEV蛋白酶室溫酶切2 h后的DAMP4-MP1106融合蛋白樣品，可清晰的看到DAMP4標(biāo)簽蛋白（Mw約15.6 kD）和抗菌肽MP1106（Mw約4.4 kD），切割比較完全，并通過(guò)二次Ni2+-NTA親和層析純化制備抗菌肽MP1106，純度為99%。

2.6 重組抗菌肽MP1106純化小結(jié)

圖 7 TEV蛋白酶切DAMP4-MP1106融合蛋白

對(duì)整個(gè)純化過(guò)程中蛋白的純化和收率做了總結(jié)（表1），實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白含量，采用Bio-Rad凝膠成像儀Quantify One軟件檢測(cè)SDS-PAGE電泳圖，測(cè)定目的蛋白的純度。經(jīng)純化復(fù)性，1 L培養(yǎng)物可以純化得到18 mg純度約99%的抗菌肽MP1106，按照抗菌肽MP1106的理論總產(chǎn)量，收率為38.4%。

2.7 MP1106分子內(nèi)二硫鍵的鑒定

MP1106分子內(nèi)含有3對(duì)二硫鍵，使用含或不含20 mmol/L DTT的SDS-PAGE電泳制樣緩沖液對(duì)DAMP4-MP1106融合蛋白和抗菌肽MP1106進(jìn)行電泳檢測(cè)對(duì)比分析，結(jié)果如圖8所示。泳道1（未加入20 mmol/L DTT的DAMP4-MP1106融合蛋白）和泳道2（加入20 mmol/L DTT的DAMP4-MP1106融合蛋白）相比，20 mmol/L DTT僅引起DAMP4-MP1106融合蛋白電泳條帶稍微向上躍遷，差異不明顯。泳道3（未加入20 mmol/L DTT的MP1106）和泳道4（加入20 mmol/L DTT的MP1106）相比，20 mmol/L DTT引起MP1106電泳條帶明顯向上躍遷。

3 討論

前期文獻(xiàn)報(bào)道，DAMP4標(biāo)簽蛋白具有在高鹽緩沖液中耐高溫的性能，已被開發(fā)成通用的小分子量蛋白或短肽的純化工具［17-19］。本研究按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法，使用高鹽緩沖液懸浮菌體，并進(jìn)行加熱處理，離心分離上清和沉淀，SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析顯示，DAMP4-MP1106融合蛋白和其它雜蛋白在加熱過(guò)程中全部變性沉淀，未達(dá)到純化效果。經(jīng)分析推測(cè)，可能由于抗菌肽MP1106短肽對(duì)DAMP4結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生了影響，造成包涵體表達(dá)。

菌絲霉素的空間結(jié)構(gòu)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成（N-末端Loop環(huán)、兩親性α-螺旋中心、C-末端為兩條反向平行的β-折疊），形成典型的CSαβ序。其中α-螺旋通過(guò)兩對(duì)二硫鍵與β-折疊的一條鏈穩(wěn)定相連，而N-末端的Loop環(huán)則通過(guò)一對(duì)二硫鍵與β-片層的另一條鏈相連［5，20］。二硫鍵對(duì)蛋白質(zhì)分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和生物學(xué)功能至關(guān)重要。有研究表明，蛋白分子內(nèi)二硫鍵的形成，能使蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)更加緊湊嚴(yán)密，表觀分子量變小，SDS-PAGE電泳條帶向下躍遷［21，22］。本研究中加入20 mmol/L DTT后，DAMP4-MP106和MP1106電泳條帶均有上移跡象，初步證明了MP1106分子內(nèi)完成了二硫鍵的正確折疊。由于MP1106相對(duì)DAMP4分子量較小，故DAMP4-MP1106使用20 mmol/L DTT處理后，相對(duì)于MP1106電泳遷移率變化較小。

表1 MP1106純化過(guò)程中的得率和純度

圖8 MP1106分子內(nèi)二硫鍵鑒定電泳圖

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，利用微生物重組制備抗菌肽成為一種經(jīng)濟(jì)高效的方法。科學(xué)家們將菌絲霉素及其衍生物與蛋白標(biāo)簽（TrxA、GST、His6、SUMO和Intein等）基因融合，并在中間預(yù)設(shè)蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)，純化后經(jīng)工具蛋白酶（Thrombin、Enterokinase、Factor Xa、SUMO和TEV等）酶切，獲得具有生物功能活性的菌絲霉素，但其發(fā)酵產(chǎn)量較低、蛋白酶切效果差、回收率低［14-16］。國(guó)內(nèi)Wang課題組［9，11-13］利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)直接表達(dá)菌絲霉素及其衍生物多肽，發(fā)酵產(chǎn)量提高到克級(jí)每升，為其產(chǎn)業(yè)化奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。但仍面臨著一個(gè)世界性難題：菌絲霉素由于分子量小，易降解，體內(nèi)半衰期短，藥效持久性差，抗菌活性有待進(jìn)一步提高等，至今尚無(wú)產(chǎn)品入市［9，11-13］。本研究利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)DAMP4-MP1106融合蛋白，經(jīng)蛋白復(fù)性、TEV酶切獲得純度為99%的抗菌肽MP1106 18 mg/L，酶切完全，回收率達(dá)到了38.4%，和已有研究報(bào)道相比，產(chǎn)量和回收率均得到了提高。菌絲霉素作為最具有應(yīng)用前景的三大抗菌肽之一，作用機(jī)理清晰，對(duì)人體細(xì)胞無(wú)毒害作用［3］，將菌絲霉素應(yīng)用到臨床，還需對(duì)其進(jìn)行多方面功能性改造進(jìn)化。所以，建立一個(gè)高效、快捷的菌絲霉素大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其功能性改造是至關(guān)必要的。

4 結(jié)論

實(shí)現(xiàn)了融合蛋白DAMP4-MP1106在大腸桿菌中的表達(dá)，并經(jīng)蛋白復(fù)性、純化成功得到了目的蛋白抗菌肽MP1106。融合蛋白DAMP4-MP1106搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為118 mg/L，純度為94.7%。經(jīng)蛋白酶TEV酶切和二次Ni2+-NTA親和層析，可獲得純度為99%的抗菌肽MP1106 18 mg/L，回收率達(dá)到了38.4%。通過(guò)簡(jiǎn)捷快速鑒定蛋白分子內(nèi)的二硫鍵，初步證實(shí)了抗菌肽MP1106完成了分子內(nèi)結(jié)構(gòu)正確折疊。

［1］Mygind PH, Fischer RL, Schnorr KM, et al. Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus［J］. Nature, 2005, 437（7061）：975-980.

［2］Czaplewski L, Bax R, Clokie M, et al. Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review［J］. Lancet Infectious Diseases, 2016, 16（2）：239-251.

［3］Hara S, Mukae H, Sakamoto N, et al. Plectasin has antibacterial activity and no affect on cell viability or IL-8 production［J］. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2008, 374（4）：709-713.

［4］Harder, Jürgen. Antimicrobial Peptides Role in Human Health and Disease［M］. Bonn：Spriner, 2016.

［5］Schneider T, Kruse T, Wimmer R, et al. Plectasin, a fungal defensin, targets the bacterial cell wall precursor lipid II［J］. Science, 2010, 328（5982）：1168-1172.

［6］張琪, 胡又佳, 陳習(xí)平, 等. 基于易錯(cuò)PCR的菌絲霉素的定向進(jìn)化［J］. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2014, 45（6）.

［7］Cao X, Yong Z, Mao R, et al. Design and recombination expression of a novel plectasin-derived peptide MP1106 and its properties against Staphylococcus aureus［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99（6）：2649-2662.

［8］Lv LH, Luo XG, Ni M, et al. Indipendent and Tandem Expression of a novel antimicrobial peptides plectasin in Escherichia coli［C］. International Conference on Future Biomedical Information Engineering, 2011：134-138.

［9］ Zhang Y, Teng D, Mao R, et al. High expression of a plectasin-derived peptide NZ2114 in Pichia pastoris, and its pharmacodynamics, postantibiotic and synergy against Staphylococcus aureus［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98（2）：681-694.

［10］Torres MK, Draghi DC, Pillar CM, et al. Activity of NZ2114 against Staphylococcal and Streptococcal isolates, including resistant Phenotypes［J］. 中國(guó)人口資源與環(huán)境：英文版, 2008, 7（1）：30-36.

［11］Yang Y, Teng D, Zhang J, et al. Characterization of recombinant plectasin：Solubility, antimicrobial activity and factors that affect its activity［J］. Process Biochemistry, 2011, 46（5）：1050-1055.

［12］Mao R, Da T, Wang X, et al. Design, expression, and characterization of a novel targeted plectasin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97（9）：3991-4002.

［13］Mao R, Teng D, Wang X, et al. Optimization of expression conditions for a novel NZ2114-derived antimicrobial peptide-MP1102 under the control of the GAP promoter in Pichia pastoris X-33［J］. BMC Microbiology, 2015, 15（1）：389.

［14］Jing XL, Luo XG, Tian WJ, et al. High-level expression of the antimicrobial peptide plectasin in Escherichia coli［J］. Current Microbiology, 2010, 61（3）：197-202.

［15］Chen X, Shi J, Chen R, et al. Molecular chaperones（TrxA, SUMO, Intein, and GST）mediating expression, purification, and antimicrobial activity assays of plectasin in Escherichia coli［J］. Biotechnology & Applied Biochemistry, 2015, 62（5）：606-614.

［16］Chen X, Wen YA, Li L, et al. The stability, and efficacy against Penicillin-resistant Enterococcus faecium, of the plectasin peptide efficiently produced by Escherichia coli［J］. Journal of Microbiology & Biotechnology, 2015, 25（7）.

［17］Dwyer MD, Brech M, Yu L, et al. Intensified expression and purification of a recombinant biosurfactant protein［J］. Chemical Engineering Science, 2014, 105（8）：12-21.

［18］ Dexter AF, Malcolm AS, Middelberg APJ. Reversible active switching of the mechanical properties of a peptide film at a fluidfluid interface［J］. Nature Materials, 2006, 5（6）：502.

［19］Middelberg AP, Dimitrijev-Dwyer M. A Designed biosurfactant protein for switchable foam control［J］. Chemphyschem, 2011, 12（8）：1426.

［20］Mandal K, Pentelute BL, Tereshko V, et al. Racemic crystallography of synthetic protein enantiomers used to determine the X-ray structure of plectasin by direct methods［J］. Protein Science, 2009, 18（6）：1146-1154.

［21］Wu L, Zhai Y, Lu J, et al. Expression, purification and preliminary characterization of glucagon receptor extracellular domain［J］. Protein Expression & Purification, 2013, 89（2）：232.

［22］Rogers MS, Baron AJ, McPherson MJ, et al. Galactose oxidase pro-sequence cleavage and cofactor assembly are self-processing reactions［J］. Journal of the American Chemical Society, 2000, 122（5）：990-991.

（責(zé)任編輯 李楠）

Study on Refolding and Purification of Plectasin MP1106

WANG Peng-ju TAN Huan-bo SU Wen-cheng ZHANG Wen-yu ZOU Pei-jian
（National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

This work aims to establish an efficient and simple Escherichia coli expression system for the antimicrobial peptide，plectasin MP1106. The recombinant MP1106 fusion protein was obtained by genetic fusion with the artificially designed bio-surfactant，DAMP4. Then，the recombinant DAMP4-MP1106 was expressed in E. coli and the protein was isolated，moreover the formation of the disulfide bonds within the protein was identified. The results showed that the recombinant DAMP4-MP1106 was over-expressed in inclusion body. The protein was obtained by the Ni2+-NTA chromatography under the denature condition. The total yield of the fusion protein after the first chromatography was 118 mg/ L in flask and the purity was 94.7%. The refolding buffer condition was screened by 96-well plate and the soluble recombinant DAMP4-MP1106 was obtained by a refolding procedure. The soluble recombinant DAMP4-MP1106 was cleaved by TEV protease and further purified by another Ni2+-NTA column. The purity of final MP1106 was 99% and the recovery of the protein was 38.4%. The comparison of the behaviour of the plectasin derivative，MP1106 with the standard plectasin on electrophoresis indicated that the disulfide bonds in MP1106 were folded correctly. In conclusion，the established E. coli expression system for the plectasin derivative MP1106 was efficient and successful.

antimicrobial peptide；plectasin；protein fusion；refolding；protein purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0287

2017-04-10

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（14ZC2DSY00057）

王鵬舉，男，碩士，研究方向：蛋白質(zhì)工程；E-mail：wang_pj@tib.cas.cn

鄒培建，男，研究員，研究方向：蛋白質(zhì)工程；E-mail：zou_pj@tib.cas.cn