大腸桿菌可溶性表達(dá)人鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原的制備及應(yīng)用

陳春野劉劍朱瑞李姝璇葉江輝王瑋潘德全徐飛海程通夏寧邵

（1. 廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門 361102；2. 廈門萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，廈門 361003）

大腸桿菌可溶性表達(dá)人鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原的制備及應(yīng)用

陳春野1劉劍1朱瑞1李姝璇1葉江輝1王瑋1潘德全1徐飛海2程通1夏寧邵1

（1. 廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門 361102；2. 廈門萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，廈門 361003）

旨在建立基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高效可溶性表達(dá)人鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（SCCAg）方法，獲得具有較好活性的重組SCCAg抗原并應(yīng)用于建立抗原檢測(cè)方法?；趐GEX-6P-1載體和大腸桿菌E. coli ER2566菌株開展重組SCCAg抗原可溶性表達(dá)純化方法研究，評(píng)價(jià)純化抗原活性，篩選特異性單克隆抗體，初步建立并評(píng)價(jià)SCCAg抗原檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，pGEX-6P-1載體和E. coli ER2566菌株可用于建立較高效的可溶性表達(dá)和純化SCCAg抗原的方法，獲得了具有較高純度和活性的重組SCCAg抗原，篩選獲得特異性單克隆抗體并初步建立了SCCAg管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。建立了有效的基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的可溶性表達(dá)和純化SCCAg的方法。

人鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原；大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)；可溶性表達(dá)；單克隆抗體

鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（Squamous cell carcinoma antigen，SCCAg）最早發(fā)現(xiàn)于子宮頸癌組織，包括兩種同源分子SCCA1和SCCA2，二者具有92%的氨基酸同源性和高度相似的抗原表位特征，均屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族［1-4］。研究顯示，SCCAg是一種重要的腫瘤標(biāo)記物，與多種器官的鱗狀上皮細(xì)胞癌有較密切關(guān)系［5-8］。血清SCCAg水平可用于有效輔助宮頸癌、頭頸部癌、肺非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌等多種鱗狀上皮細(xì)胞癌的臨床診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)防判斷［5-13］。獲得較高純度和活性的SCCAg抗原是建立臨床檢測(cè)方法及開展相關(guān)基礎(chǔ)研究的重要基礎(chǔ)。

目前，SCCAg抗原主要通過(guò)天然提取和重組表達(dá)兩種方式獲得。天然提取方法是從人源組織中進(jìn)行分離和純化，該方法需要使用較大量的人源樣品，有倫理限制，成本高，難于獲得較大量的抗原。重組表達(dá)方法目前較多使用真核表達(dá)系統(tǒng)，盡管真核表達(dá)系統(tǒng)解決了倫理限制和部分降低了生產(chǎn)成本，但存在表達(dá)量偏低、耗時(shí)長(zhǎng)、表達(dá)和純化方法較為復(fù)雜等特點(diǎn)［14-15］。大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便和表達(dá)量較高的優(yōu)點(diǎn)，在基因工程中具有突出優(yōu)勢(shì)。目前，雖然已有應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)開展SCCAg抗原表達(dá)的研究，但多以包涵體的表達(dá)形式為主，缺乏可溶性表達(dá)的報(bào)道［16-17］。研究顯示，包涵體是一種錯(cuò)誤折疊的蛋白形式，重組抗原可溶性表達(dá)可更有利于保持抗原的天然構(gòu)象。因此，本研究擬探索建立基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的SCCAg抗原可溶性表達(dá)和純化方法。選擇有利于目標(biāo)抗原可溶性表達(dá)的表達(dá)載體和表達(dá)菌株是探索實(shí)現(xiàn)重組抗原可溶性表達(dá)的重要方法。多項(xiàng)研究已顯示，攜帶GST（谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶）融合表達(dá)標(biāo)簽的pGEX-6P-1載體與E. coli ER2566菌株在重組抗原可溶性表達(dá)方面具有較好的表現(xiàn)［18-24］，但尚沒有研究將兩者聯(lián)合應(yīng)用于SCCAg抗原表達(dá)。為此，本研究即探索將pGEX-6P-1載體和E. coli ER2566菌株應(yīng)用于建立重組SCCAg抗原可溶性表達(dá)和純化方法的可行性，開展抗原活性比較及篩選檢測(cè)抗體并應(yīng)用于建立SCCAg管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶和pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。弗式完全佐劑和不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司。胎牛血清（FBS）購(gòu)自PAA公司。表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-6P-1、大腸桿菌表達(dá)菌株E.coli DH5α和E. coli ER2566為本實(shí)驗(yàn)室保存，小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0亦為本實(shí)驗(yàn)室保存。SPF級(jí)BABL/c小鼠和F1小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。其他常規(guī)藥品試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。分別攜帶有全長(zhǎng)SCCA1與SCCA2基因序列的pFB質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存［25］。美國(guó)雅培公司的SCCAg抗原檢測(cè)試劑（批號(hào)：62111LP06）、人源SCCAg抗原標(biāo)準(zhǔn)品和SCCAg陽(yáng)性血清盤由廈門萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司提供?？笻IS標(biāo)簽的鼠單克隆抗體（HT501-02）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組SCCAg抗原表達(dá)載體構(gòu)建 分別以攜帶有全長(zhǎng)SCCA1與SCCA2基因序列的pFB質(zhì)粒為模板，以引物（pGEX-SCCAg-SalI-F：5'-ACGCGTCG ACAATTCACTCAGTGAAGCCAAC-3'；PGEX-SCCAg-XhoI-HIS-R：5' -ATACCGTCTAAGAGTAGGGGCGTG GTAGTAGTAGTAGTAATTGAGCTCGCC-3'）分別擴(kuò)增獲得SCCA1與SCCA2全長(zhǎng)基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后分別連接pMD18-T載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sal I/ Xho I處理后連接到已經(jīng)用相同限制性內(nèi)切酶處理的pGEX-6P-1載體中，經(jīng)測(cè)序鑒定后，分別獲得SCCA1和SCCA2抗原的重組表達(dá)載體pGEX-SCCA1和pGEX-SCCA2。

1.2.2 重組SCCAg抗原的表達(dá)與純化 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli ER2566感受態(tài)菌株，37℃擴(kuò)增至OD600為1.5，之后將培養(yǎng)溫度降至特定溫度并添加IPTG（0.2-0.6 mmol/L）進(jìn)行5-8 h的誘導(dǎo)表達(dá)。離心（7 000×g，10 min）收集菌體，以緩沖液（30 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris）重懸菌體，在冰水浴條件下使用超聲破碎儀對(duì)菌體進(jìn)行破碎。破碎后的菌液離心（25 000×g，20 min）取上清。利用Ni+親和層析柱對(duì)超聲上清進(jìn)行親和層析純化（平衡緩沖液：30 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris；核酸沖洗液：1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris；洗脫液：250 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris），收集洗脫峰并透析至PBS中。使用PreScission蛋白酶切掉重組抗原上的GST標(biāo)簽，過(guò)GST親和層析柱，收集穿透峰并透析至PBS中。純化抗原經(jīng)SDS-PAGE鑒定后保存于-20℃中。

1.2.3 單克隆抗體制備 將純化的重組SCCA1和SCCA2抗原以1∶1質(zhì)量比例混合，以弗式完全佐劑乳化后采用皮下多點(diǎn)注射方式免疫6-8周齡的SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠5只（總劑量100 μg/只），分別于第2、4周進(jìn)行加強(qiáng)免疫。初次免疫采用完全弗氏佐劑，加強(qiáng)免疫采用不完全弗氏佐劑。每次免疫前和免疫全部完成后2周采集血清用間接ELISA方法檢測(cè)抗體滴度。應(yīng)用常規(guī)的小鼠雜交瘤制備單克隆抗體技術(shù)，以PEG 4000為融合劑，將小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按5∶1比例融合，在含HAT的1640選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以純化的重組SCCAg抗原作為包被抗原，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠抗體為二抗，應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)融合細(xì)胞培養(yǎng)上清。通過(guò)有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性克隆孔進(jìn)行多輪克隆化。將單克隆抗體細(xì)胞注射入F1小鼠腹腔誘導(dǎo)腹水，使用硫酸銨鹽析法和Protein A親和層析法對(duì)小鼠腹水進(jìn)行純化。純化后的單克隆抗體測(cè)定濃度后保存于-20℃。

1.2.4 間接ELISA方法 將重組SCCAg用CB緩沖液（pH9.6）進(jìn)行稀釋，按100 ng/孔包被在96孔微孔板上，放置于37℃溫箱中孵育2 h；每孔加入200 μL含有2%明膠的PB緩沖液并放置于37℃溫箱中孵育2 h，甩干后真空密封保存?zhèn)溆?。檢測(cè)時(shí)每孔加入50 μL雜交瘤細(xì)胞上清，放置于37℃溫箱中孵育30 min，經(jīng)1×PBST清洗5次，吸干多余的液體后加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體（1∶5 000）作為二抗并放置于37℃中孵育，30 min后用1×PBST清洗5次，吸干多余的液體后加入100 μL顯色液于37℃溫箱中孵育15 min，加入50 μL終止液后在微孔酶標(biāo)儀上讀值。

1.2.5 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法（CLIA） 按照文獻(xiàn)報(bào)道方法將單克隆抗體分別標(biāo)記磁珠和吖啶酯［26］。將50 μL的檢測(cè)樣品和50 μL標(biāo)記了抗體的磁珠緩沖液加入U(xiǎn)型微孔板中，貼上封板膜并放至37℃恒溫箱內(nèi)孵育15 min，之后用磁力板架吸附微孔板中的磁珠，PBST清洗3遍后加入吖啶酯標(biāo)記的抗體緩沖液50 μL，37℃孵育10 min后用PBST清洗3遍，將磁珠轉(zhuǎn)移至發(fā)光管中并加入100 μL的激發(fā)液A，加入100 μL激發(fā)液B后上機(jī)（全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀）檢測(cè)發(fā)光值。

1.2.6 配對(duì)實(shí)驗(yàn) 將單克隆抗體標(biāo)記辣根過(guò)氧化酶（HRP），同時(shí)將單克隆抗體包被到96孔ELISA微孔板上，人源SCCAg稀釋至濃度為1 ng/mL。單克隆抗體兩兩配對(duì)對(duì)稀釋好的人源SCCAg抗原進(jìn)行檢測(cè)，將OD讀值大于1的單克隆抗體配對(duì)組合定為高反應(yīng)配對(duì)，將OD讀值介于0.1和1之間的單克隆抗體配對(duì)組合定為中等反應(yīng)配對(duì)，將OD讀值小于0.1的單克隆抗體配對(duì)組合定義為低反應(yīng)配對(duì)。

1.2.7 檢測(cè)靈敏度的分析 依照《體外診斷試劑分析性能評(píng)估系列指導(dǎo)原則》中的方法對(duì)檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)靈敏度分析。檢測(cè)試劑對(duì)梯度稀釋的SCCAg標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)并繪制劑量反應(yīng)曲線，對(duì)0水平校準(zhǔn)品進(jìn)行20次重復(fù)測(cè)定計(jì)算檢測(cè)靈敏度。

1.2.8 SDS-PAGE方法 配制12%的聚丙烯酰胺凝膠，凝固后放入電泳槽中加滿電泳液，取50 μL的樣品加入10 μL的6×含有還原劑的樣品緩沖液，沸水浴10 min后上樣，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色液染色15-30 min，經(jīng)KCl溶液脫色后進(jìn)行樣品分析。

1.2.9 Western-blot方法 取50 μL樣品進(jìn)行SDSPAGE分析，電泳結(jié)束后通過(guò)電轉(zhuǎn)儀將重組抗原轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶封閉2 h后加入抗HIS標(biāo)簽的鼠抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，TNT漂洗5遍后加入GAM-HRP（1∶5 000）作為二抗，室溫孵育45 min后用TNT漂洗5遍并進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。

2 結(jié)果

2.1 重組SCCAg抗原可溶性表達(dá)與純化方法建立

將SCCA1和SCCA2全長(zhǎng)基因分別克隆入pGEX-6P-1載體構(gòu)建獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGEXSCCA1和pGEX-SCCA2。將重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E. coli ER2566感受態(tài)菌株，并分別在不同的溫度條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE顯示，在不同誘導(dǎo)溫度條件下SCCA1和SCCA2的表達(dá)菌株在75 kD的位置均有目的表達(dá)條帶，其分子量與預(yù)期的融合有GST標(biāo)簽的SCCAg抗原的大小相符，并且均能夠以可溶性形式存在于超聲裂解上清中，不同誘導(dǎo)溫度的抗原表達(dá)量無(wú)顯著差異。該結(jié)果說(shuō)明，采用pGEX-6P-1載體和E. coli ER2566菌株可實(shí)現(xiàn)SCCA1和SCCA2抗原的可溶性表達(dá)。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化IPTG溶度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間，本研究獲得了較優(yōu)的誘導(dǎo)可溶性表達(dá)SCCA1和SCCA2抗原的條件為0.2 mmol/L IPTG和37℃下誘導(dǎo)表達(dá)8 h。本研究應(yīng)用親和層析純化方法獲得了純化的SCCA1和SCCA2重組抗原，SDS-PAGE和Western blot分析（圖1）顯示，純化的SCCA1和SCCA2重組抗原具有較好的純度，其分子量約為48 kD，與預(yù)期大小相符。

圖1 重組SCCAg的SDS-PAGE和Western Blot分析

2.2 重組SCCAg抗原的活性評(píng)價(jià)

本研究應(yīng)用目前臨床上主要使用的SCCAg檢測(cè)試劑對(duì)比了本研究表達(dá)純化獲得重組抗原與人源SCCAg抗原的反應(yīng)活性，分別將表達(dá)純化獲得SCCA1抗原、SCCA2抗原和人源SCCAg抗原進(jìn)行系列梯度稀釋，用SCCAg檢測(cè)試劑分別檢測(cè)其反應(yīng)活性。結(jié)果（圖2）顯示，本研究獲得的重組SCCA1抗原、SCCA2抗原與對(duì)照的人源SCCAg抗原均具有良好的反應(yīng)性，檢測(cè)試劑對(duì)其的檢測(cè)靈敏度分別為2.14 ng/mL、1.06 ng/mL和1.40 ng/mL。本研究獲得的重組SCCAg抗原具有與人源抗原相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)活性。

圖2 雅培試劑檢測(cè)SCCAg標(biāo)準(zhǔn)品和重組SCCAg

2.3 重組SCCAg抗原應(yīng)用于單克隆抗體制備

本研究利用純化的重組SCCA1和SCCA2抗原免疫免疫BALB/c小鼠5只，并進(jìn)一步制備了抗SCCAg的特異性單克隆抗體。應(yīng)用間接ELISA方法分別檢測(cè)免疫后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠多抗血清與重組SCCA1和SCCA2抗原的反應(yīng)活性。結(jié)果（圖3）顯示，小鼠血清對(duì)重組SCCA1和SCCA2抗原均具有較好的反應(yīng)活性，免疫程序完成后血清的反應(yīng)活性均在1∶50 000以上。該結(jié)果顯示了本研究獲得的重組SCCAg抗原具有良好的免疫原性。本研究進(jìn)一步篩選獲得了80株同時(shí)對(duì)SCCA1和SCCA2抗原具有反應(yīng)活性的單克隆抗體。

圖3 SCCAg免疫小鼠多抗血清監(jiān)測(cè)

2.4 SCCAg管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的初步建立

通過(guò)配對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人源SCCAg抗原獲得29組OD值讀值較高的單克隆抗體配對(duì)組合（圖4-A），其中兩組單克隆抗體配對(duì)（7F10/4H8-HRP和12F6/7E2-HRP）的檢測(cè)靈敏度較優(yōu)（圖4-B）。進(jìn)一步應(yīng)用17份確證陽(yáng)性人血清標(biāo)本對(duì)上述兩種配對(duì)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果（圖4-C）顯示，單克隆抗體7F10與SAE標(biāo)記的單克隆抗體4H8的組合具有更優(yōu)的檢測(cè)性能。本研究即以之為基礎(chǔ)初步建立了SCCAg抗原的管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。

2.5 SCCAg管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的初步評(píng)價(jià)

對(duì)新建立的檢測(cè)方法的性能進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。結(jié)果（圖5-A）顯示，該檢測(cè)方法對(duì)人源SCCAg抗原的檢測(cè)靈敏度為0.15 ng/mL，達(dá)到現(xiàn)有臨床主流SCCAg檢測(cè)試劑水平；對(duì)20份確證陰性人血清標(biāo)本均檢出陰性，特異性為100%。本研究同時(shí)應(yīng)用該方法與對(duì)照試劑平行對(duì)30份確證陽(yáng)性人血清標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果（圖5-B）所示，上述兩種檢測(cè)方法獲得的檢測(cè)結(jié)果具有良好的相關(guān)性（R2=0.9953）。上述結(jié)果說(shuō)明，本研究建立的SCCAg檢測(cè)方法性能較好，與對(duì)照主流試劑相當(dāng)。

圖4 SCCAg管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的建立

圖5 SCCAg管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的初步評(píng)價(jià)

3 討論

本研究以pGEX-6P-1載體和E. coli ER2566菌株為基礎(chǔ)建立了重組SCCAg抗原的原核表達(dá)純化方法，該方法可實(shí)現(xiàn)重組SCCAg在原核表達(dá)系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)，且制備獲得的重組SCCAg抗原具有較好的純度和活性。在已報(bào)道的應(yīng)用原核系統(tǒng)表達(dá)SCCAg抗原的研究中，SCCAg抗原主要以包涵體形式表達(dá)［16，17］。對(duì)比分析顯示，本研究方法與已報(bào)道方法在目標(biāo)抗原基因序列和總體表達(dá)策略上并無(wú)顯著差別，較主要的差別在于表達(dá)菌株和表達(dá)載體。此前研究中使用的菌株均為E. coli BL21，表達(dá)載體包括pGEX-4T-1［16］、pET-32a［16］和pET-28b［17］；本研究采用的菌株為E. coli ER2566，表達(dá)載體為pGEX-6P-1。其中，pET-32a為6×His-Trx（6組氨酸-硫氧還蛋白）標(biāo)簽，pET-28b為6×His標(biāo)簽，pGEX-4T-1與本研究使用的pGEX-6P-1類似均為GST標(biāo)簽，但此前研究顯示pGEX-4T-1載體在E. coli BL21中也未能實(shí)現(xiàn)SCCAg抗原的可溶性表達(dá)［16］。因此分析顯示，采用GST為融合表達(dá)標(biāo)簽并以E. coli ER2566為表達(dá)菌株是本研究實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)SCCAg抗原的重要特征。其詳細(xì)機(jī)制有待后續(xù)研究進(jìn)一步揭示。本研究建立的SCCAg抗原原核表達(dá)方法有利于避免天然提取抗原方法存在的人組織來(lái)源問(wèn)題，進(jìn)而降低原料制備成本。同時(shí)原核表達(dá)系統(tǒng)具有擴(kuò)增速度快、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，因此相比真核表達(dá)系統(tǒng)和天然提取抗原，使用原核表達(dá)系統(tǒng)制備重組SCCAg可較方便、快捷地獲取大量抗原，從而為SCCAg檢測(cè)試劑的研發(fā)奠定良好基礎(chǔ)。

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)具有檢測(cè)范圍廣、檢測(cè)靈敏度高、無(wú)放射性廢物以及容易自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于常規(guī)的臨床檢測(cè)以及醫(yī)療和生化研究中。目前使用的主流SCCAg化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑多為雅培、羅氏等進(jìn)口試劑，因此研制具有自主產(chǎn)權(quán)的SCCAg化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑對(duì)于降低國(guó)民醫(yī)療費(fèi)用，提高診斷試劑的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有較為重要的意義。本研究從6 400組單克隆抗體配對(duì)組合中篩選獲得了一組對(duì)血清SCCAg具有良好檢測(cè)性能的單克隆抗體配對(duì)7F10和4H8。該配對(duì)的檢測(cè)靈敏度與目前臨床上應(yīng)用較廣的雅培SCCAg檢測(cè)試劑相當(dāng)，且二者檢測(cè)結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

4 結(jié)論

本研究首次將pGEX-6P-1載體和E. coli ER2566菌株聯(lián)合應(yīng)用重組SCCAg抗原的表達(dá)與純化，應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了全長(zhǎng)、可溶的重組SCCAg抗原，經(jīng)驗(yàn)證其具有純度較高、活性較好的優(yōu)點(diǎn)，并應(yīng)用于SCCAg診斷試劑研發(fā)獲得了檢測(cè)性能與國(guó)外試劑盒水平相當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w配對(duì)。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Preparation and Application of Soluble Human Squamous Cell Carcinoma Antigen Expressed by Escherichia coli

CHEN Chun-ye1LIU Jian1ZHU Rui1LI Shu-xuan1YE Jiang-hui1WANG Wei1PAN De-quan1XU Fei-hai2CHENG Tong1XIA Ning-shao1
（1. State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics，National Institute of Diagnostics and Vaccine Development of Infectious Disease，School of Life Science，Xiamen University，Xiamen 361102；2. Xiamen WANTAI Inndox Biotechnology Co.，Ltd.，Xiamen 361003）

The aims of this study are to establish a method for efficient soluble expression of human squamous cell carcinoma antigen（SCCAg）based on Escherichia coli expression system and obtain the recombinant SCCAg antigen in fine activity，then apply it in the detection method establishment of antigen. The study on the method of soluble expression and purification of recombinant SCCAg antigen was conducted based on pGEX-6P-1 vector and E. coli ER2566 strain. The activity of the purified antigen was evaluated by Abbott Kit and the specific monoclonal antibody was screened by indirect ELISA. It was proved that PGEX-6P-1 vector and E. coli strain ER2566 could be used to establish efficient soluble expression and purification method for recombinant SCCAg antigen. Moreover，the recombinant SCCAg antigen was proved to be in high purity and activity. Thus，the SCCAg detection method of chemical luminous tube was established with the specific monoclonal antibodies. In conclusion，an effective method for the expression and purification of SCCAg，which is based on the E. coli expression system，is established.

human squamous cell carcinoma antigen；Escherichia coli expression system；soluble expression；monoclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0228

2017-03-22

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）（2011AA02A101）

陳春野，男，碩士研究生，研究方向：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)；E-mail：80911843@qq.com

夏寧邵，男，研究方向：分子病毒學(xué)；E-mail：nsxia@xmu.edu.cn