氯沙坦對(duì)慢性心力衰竭患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響研究

陳菊明，左 琦，宋艷玲，麥華德，紀(jì)新博，王雅純，林蕓蕓，顧申紅

·論著·

氯沙坦對(duì)慢性心力衰竭患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響研究

陳菊明1，左 琦2，宋艷玲1，麥華德1，紀(jì)新博1，王雅純1，林蕓蕓1，顧申紅1

目的探討氯沙坦對(duì)慢性心力衰竭患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的影響。方法選取2015年3月—2016年3月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科收治的慢性心力衰竭患者30例，采集患者外周血10 ml，體外培養(yǎng)EPCs。將體外培養(yǎng)的EPCs隨機(jī)分為A組，B組和C組，每組10份。A組不做任何處理，B組采用氯沙坦10 μmol/L進(jìn)行處理，C組采用氯沙坦10 μmol/L+磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑10 μmol/L進(jìn)行處理。比較3組EPCs培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、72 h 535nm波長下光密度值(OD535)，穿膜細(xì)胞數(shù)，蘇氨酸蛋白激酶(Akt)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表達(dá)量。結(jié)果時(shí)間與方法在OD535上存在交互作用(P<0.05)；時(shí)間在OD535上主效應(yīng)顯著(P<0.05)；方法在OD535上主效應(yīng)顯著(P<0.05)；B組EPCs 12 h、24 h、36 h、48 h、72 h OD535高于A組、C組(P<0.05)。B組EPCs穿膜細(xì)胞數(shù)多于A組、C組(P<0.05)。B組EPCs的Akt和eNOS蛋白表達(dá)量高于A、C組(P<0.05)。結(jié)論氯沙坦可有效促進(jìn)慢性心力衰竭患者外周血EPCs增殖和遷移，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，其可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路而發(fā)揮作用。

心力衰竭；氯沙坦；內(nèi)皮祖細(xì)胞

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)可參與血管生成，在缺血性疾病、血管創(chuàng)傷后愈合、預(yù)防血管狹窄中具有較好的應(yīng)用前景[1]。研究表明，EPCs是反映慢性心力衰竭的生物標(biāo)志物，因此提高EPCs的釋放可有效改善慢性心力衰竭患者心功能[2]。研究表明，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARBs)具有調(diào)節(jié)EPCs的作用[3]。氯沙坦是ARBs類藥物，可減輕左心室肥厚，抑制心肌細(xì)胞增生，延遲或逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)，改善左心室功能，同時(shí)可增加慢性心力衰竭患者外周血EPCs，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。近年來，臨床有關(guān)EPCs與慢性心力衰竭的關(guān)系研究報(bào)道逐漸增多[4-5]。本研究旨在探討氯沙坦對(duì)慢性心力衰竭患者外周血EPCs的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月—2016年3月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科收治的慢性心力衰竭患者30例，均符合第8版《內(nèi)科學(xué)》中的慢性心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肝、腎功能不全者；(2)存在惡性腫瘤者；(3)妊娠期或哺乳期婦女。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 藥物與實(shí)驗(yàn)試劑 氯沙坦(商品名：科素亞；生產(chǎn)廠家：杭州默沙東制藥有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：20161105；規(guī)格：50 mg/片)；PI3K抑制劑(商品名：NVP-BEZ235；生產(chǎn)廠家：美國Selleck公司；批準(zhǔn)文號(hào)：20160324)。M-199培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司；兔抗人一抗(抗蘇氨酸蛋白激酶、抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色試劑盒購自美國Santa Cruz公司；噻唑藍(lán)購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 EPCs培養(yǎng) 采集30例患者外周血10 ml，采用Ficoll密度梯度離心法收集外周血單個(gè)核細(xì)胞；將單個(gè)核細(xì)胞接種于人纖維連結(jié)蛋白包被的6孔培養(yǎng)板中，每孔加入M-199培養(yǎng)液(10%胎牛血清+100 U/ml鏈霉素+100 U/ml青霉素)1 ml；置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。

1.3.2 分組 將體外培養(yǎng)的EPCs隨機(jī)分為3組，空白組(A組，n=10)：不經(jīng)任何處理；氯沙坦組(B組，n=10)：采用氯沙坦10 μmol/L處理；磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑組(C組，n=10)：采用氯沙坦10 μmol/L+PI3K抑制劑10 μmol/L處理。

1.4 觀察指標(biāo) (1)EPCs增殖情況：將3組EPCs接種于人纖維連結(jié)蛋白包被的96孔培養(yǎng)板中，每孔加入M-199培養(yǎng)液(10%胎牛血清+100 U/ml鏈霉素+100 μg/ml青霉素)1 ml及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)50 ng/ml；置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后更換培養(yǎng)液，后每隔2 d更換1次；待EPCs鋪滿80%以上后加入噻唑藍(lán)10 μl，置于培養(yǎng)箱孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液上清，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，振搖10 min，采用美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的iMark680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀于535 nm波長下測定各孔培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、72 h光密度值(OD)。(2)EPCs遷移情況：將3組EPCs細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液200 μl，后接種于Boyden chamber，下室加入培養(yǎng)液600 μl+VEGF 50 ng/ml+基質(zhì)細(xì)胞趨化因子-1(SDF-1)100 ng/ml；培養(yǎng)24 h后取出濾膜，刮去上室未遷移細(xì)胞，用10%甲醇固定，Giemsa染色，隨機(jī)選取6個(gè)顯微視野(×200)計(jì)數(shù)遷移到底層的細(xì)胞數(shù)目。(3)EPCs蘇氨酸蛋白激酶(Akt)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表達(dá)量：采用RIPA裂解液裂解3組EPCs，離心提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度；等量總蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉1 h，加入Akt(1∶500)，eNOS(1∶500)一抗4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(1∶20 000)二抗孵育1 h，TBS-T漂洗3次，ECL顯色，使用Bio-Rad掃描分析，并計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量〔蛋白相對(duì)表達(dá)量=OD目的蛋白/OD內(nèi)參(β-actin)〕。上述檢測均進(jìn)行5次，檢測結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1EPCs增殖 時(shí)間與方法在OD535上存在交互作用(P<0.05)；時(shí)間在OD535上主效應(yīng)顯著(P<0.05)；方法在OD535上主效應(yīng)顯著(P<0.05)；B組EPCs12h、24h、36h、48h、72hOD535高于A組、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1、圖1)。

Table1ComparisonofOD535ofEPCsamongthethreegroupsatdifferenttimepoints

組別份數(shù)12h24h36h48h72hA組100.22±0.02a0.47±0.04a0.91±0.03a1.15±0.04a1.28±0.03aB組100.50±0.060.84±0.041.53±0.061.84±0.052.02±0.06C組100.25±0.03a0.57±0.05a0.88±0.06a1.26±0.05a1.37±0.05aF值F時(shí)間=69.641,F組間=41.317,F交互=23.656P值P時(shí)間<0.001,P組間<0.001,P交互<0.001

注：與B組比較，aP<0.05

注：OD=光密度值

圖1 3組EPCs不同時(shí)間點(diǎn)OD535

Figure1 OD535of EPCs of the three groups at different time points

2.2 EPCs遷移 A組EPCs穿膜細(xì)胞數(shù)為(15.5±1.7)個(gè)，B組EPCs穿膜細(xì)胞數(shù)為(33.8±2.9)個(gè)，C組EPCs穿膜細(xì)胞數(shù)為(17.5±2.0)個(gè)。3組EPCs穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=197.580，P<0.05)；B組EPCs穿膜細(xì)胞數(shù)多于A組、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為25.625、22.825，P<0.05，見圖2)。

圖2 3組EPCs穿膜情況(Giemsa染色，×200)

2.3 Akt和eNOS蛋白表達(dá)量 3組EPCs的Akt和eNOS蛋白表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組EPCs的Akt和eNOS蛋白表達(dá)量高于A、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖3)。

Table2ComparisonofproteinexpressionsofAktandeNOSproteinamongthethreegroups

組別份數(shù)AkteNOSA組100.91±0.03a0.88±0.03aB組101.37±0.081.26±0.06C組100.98±0.07a0.82±0.06aF值75.533105.432P值<0.05<0.05

注：與B組比較，aP<0.05；Akt=蘇氨酸蛋白激酶，eNOS=內(nèi)皮型一氧化氮合酶

注：Akt=蘇氨酸蛋白激酶，eNOS=內(nèi)皮型一氧化氮合酶

圖3 3組Akt和eNOS蛋白表達(dá)情況

Figure3 Protein expressions of Akt and eNOS of the three groups

3 討論

EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，可通過動(dòng)員、遷移、歸巢和分化4步驟而修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，減少氧化應(yīng)激或細(xì)胞凋亡。1997年ASAHARA等[6]證明外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，并將其命名為血管EPCs。新生血管中約25%內(nèi)皮細(xì)胞由EPCs分化而來，且其可在損傷部位黏附、聚集、增殖、分化形成新的血管內(nèi)皮細(xì)胞[7-9]。因此，EPCs具有修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化、血管再生，延緩動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用[4]。另外，EPCs還能抑制氧化應(yīng)激，促進(jìn)一氧化氮(NO)生成，可在缺血或腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活狀態(tài)下增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞功能，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞[10-11]。

慢性心力衰竭患者常伴有RAAS和內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，臨床常采用ARBs類藥物治療。研究表明，ARBs通過抑制RAAS而有效阻斷血管緊張素Ⅱ受體活性，降低心血管疾病發(fā)生率、病死率和致殘率[12]。MATSUURA等[13]研究表明，ARBs可有效阻斷血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和胰島素抵抗等對(duì)EPCs的影響。

YAO等[14]研究表明，氯沙坦可促進(jìn)EPCs增殖、遷移。本研究結(jié)果顯示，B組EPCs 12 h、24 h、36 h、48 h、72 h OD535高于A組、C組，EPCs穿膜細(xì)胞數(shù)多于A組、C組，提示氯沙坦可促進(jìn)慢性心力衰竭患者外周血EPCs增殖和遷移。CHEN等[15]研究表明，激活PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路可提高小鼠外周血EPSs增殖、遷移和新生血管分化能力。本研究結(jié)果顯示，B組EPCs的Akt和eNOS蛋白表達(dá)量高于A組、C組，提示氯沙坦可提高慢性心力衰竭患者外周血EPCs的Akt和eNOS蛋白表達(dá)量，其可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路而發(fā)揮作用。

綜上所述，氯沙坦可促進(jìn)慢性心力衰竭患者外周血EPCs的增殖和遷移，可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，有一定的臨床參考價(jià)值。但本研究仍處于EPCs研究的初級(jí)階段，有待進(jìn)一步深入研究，今后研究方向?yàn)镋PCs在冠心病、腦出血、高血壓等疾病治療中的應(yīng)用效果。

作者貢獻(xiàn)：陳菊明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；左琦、宋艷玲、麥華德、紀(jì)新博、王雅純、林蕓蕓進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；顧申紅進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李潔晨)

ImpactofLosartanonPeripheralBloodEndothelialProgenitorCellsinPatientswithChronicHeartFailure

CHENJu-ming1，ZUOQi2，SONGYan-ling1，MAIHua-de1，JIXin-bo1，WANGYa-chun1，LINYun-yun1，GUShen-hong1

1.DepartmentofGerontology，theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege，Haikou570102，China2.DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege，Haikou570102，China

Correspondingauthor：GUShen-hong，E-mail：1574063710@qq.com

ObjectiveTo investigate the impact of losartan on peripheral blood endothelial progenitor cells in patients with chronic heart failure.MethodsFrom March 2015 to March 2016，a total of 30 patients with chronic heart failure were selected in the Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College，10 ml peripheral blood was collected from each case and endothelial progenitor cells were cultured in vitro.Cultured endothelial progenitor cells were divided into A group，B group and C group，each of 10 samples.Endothelial progenitor cells of A group did not

any intervention，endothelial progenitor cells of B group received losartan(10 μmol/L)，while endothelial progenitor cells of B group received losartan(10 μmol/L)combined with PI3K inhibitor(10 μmol/L).OD535of endothelial progenitor cells after 12 hours，24 hours，36 hours，48 hours and 72 hours of culture，number of transmembrane cells，protein expressions of Akt and eNOS were compared among the three groups.ResultsThere was interaction between time and method in OD535of endothelial progenitor cells(P<0.05)；main effects of time and method were significant in OD535of endothelial progenitor cells(P<0.05)；OD535of endothelial progenitor cells of B group was statistically significantly higher than that of A group and C group after 12 hours，24 hours，36 hours，48 hours and 72 hours of culture，respectively(P<0.05).Number of transmembrane cells of B group was statistically significantly more than that of A group and C group，respectively(P<0.05).Protein expressions of Akt and eNOS of B group were statistically significantly higher than those of A group and C group(P<0.05).ConclusionLosartan can effectively promote the proliferation and migration of peripheral blood endothelial progenitor cells in patients with chronic heart failure，is helpful to improve the endothelial cell function,losartan may play a role through adjusting PI3K/Akt/eNOS signal pathway.

Heart failure；Losartan；Endothelial progenitor cells

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(814355)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560054)

顧申紅，E-mail：1574063710@qq.com

R 541.6

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.08.010

2017-04-03；

2017-07-26)

1.570102海南省?？谑?，海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年病科

2.570102海南省?？谑?，海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科

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