茵梔黃對結構性雄甾烷受體CAR介導CYP3A4的轉錄調節(jié)作用*

李寶群，畢紅東△，郭娜娜，龐澤華

（1.承德醫(yī)學院藥理學教研室，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學院2011級中西醫(yī)本科）

基礎醫(yī)學

茵梔黃對結構性雄甾烷受體CAR介導CYP3A4的轉錄調節(jié)作用*

李寶群1，畢紅東1△，郭娜娜1，龐澤華2

（1.承德醫(yī)學院藥理學教研室，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學院2011級中西醫(yī)本科）

目的:探討茵梔黃對CYP3A4轉錄表達的影響及機制。方法：Chang Liver細胞中加入0.01、0.1和1μM茵梔黃分別作用24h、36h和48h，采用RT-PCR法和報告基因方法檢測CYP3A4 mRNA的表達水平。結果：不同濃度茵梔黃分別處理Chang Liver細胞24h和36h可明顯升高CYP3A4 mRNA的表達水平（P＜0.05）；轉入CAR載體的Chang Liver細胞經(jīng)不同濃度茵梔黃處理36h均可激活CYP3A4的轉錄表達。結論：茵梔黃可能通過CAR介導增加Chang Liver細胞CYP3A4的轉錄表達。

茵梔黃；結構性雄甾烷受體CAR；CYP3A4；報告基因；轉錄表達

藥物代謝酶CYP3A4是細胞色素氧化酶CYP450超家族的成員，參與了50%以上臨床常用藥和膽紅素的代謝[1]。近年來發(fā)現(xiàn)，核受體是調控CYP3A4表達的關鍵因子，并且有研究證實結構性雄甾烷受體(CAR，一種核受體)可誘導CYP3A4的轉錄[2]。茵桅黃具有清熱解毒、利膽保肝等多種作用，臨床用于治療肝炎、黃疸等疾病[3]。研究發(fā)現(xiàn)，很多具有解毒保肝的中草藥(TCMs)都可影響藥物代謝酶的表達，但尚缺乏分子機制的研究[4]。本研究在前期發(fā)現(xiàn)茵梔黃可誘導代謝酶CYP2C19的基礎上，以核受體為切入點，應用半定量分析方法和報告基因的方法在轉錄水平進一步探討了茵梔黃對代謝酶CYP3A4表達的影響及可能機制，以期為指導TCMs的安全應用提供有益信息。

1 材料與方法

1.1 材料 Chang Liver細胞，由本教研室凍存；rTaq酶，日本TaKaRa公司；逆轉錄試劑盒/報告基因分析試劑盒，美國Promega公司；重組真核表達載體CAR、報告基因載體CYP3A4，中南大學臨床實驗室惠贈。茵梔黃（DMSO溶解），湖南省藥檢所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理：Chang Liver細胞用DMEM+10%胎牛血清，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。同時設置DMSO為溶媒對照組；10μM/L的苯巴比妥-DMSO為陽性對照組；茵梔黃處理組分別加入終濃度為0.01μM、0.1μM和1μM的茵梔黃，分別孵育24h、36h、48h后收集細胞。采用RT-PCR法檢測Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的表達情況：各組細胞提取總RNA后逆轉為cDNA。CYP3A4正向引物序

列5’-CCCCCTGAAAATTTGGGCCAA-3’，反向引物序

列5’-TAATTTTGGGGCTCAAAGGCT-3’。 擴增條件：94℃ 2min，94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 30s；30個循環(huán)。擴增產物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外成像儀成像，用Quantity One 4.6.2軟件（Bio-Rad公司）進行定量分析，以目的條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為CYP3A4 mRNA的相對表達水平。

1.2.2 細胞轉染和報告基因檢測：轉染前24h，按5×104細胞/孔將細胞接種至96孔培養(yǎng)板，轉染時將200ng CYP3A4-promoter-Luc，50ng hCAR或pcDNA3.1-myc/his B(-)空載體，以及作為內對照的海腎熒光素酶報告載體20ng pRLTK與0.5μl LipofectamineTM 2000陽離子脂質體混合孵育后加入至1個培養(yǎng)孔，轉染4h后更換為DMEM+10% FBS培養(yǎng)基再培養(yǎng)20h進行茵梔黃給藥實驗。分別加入0.01μM、0.1μM和1μM的茵梔黃處理36h后裂解細胞，同設DMSO溶媒對照組和含有10μM/L的苯巴比妥-DMSO陽性對照

組，各組細胞用報告基因分析試劑盒測定熒光素酶活性值，重復3次。

2 結果

2.1 茵梔黃對Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA表達的影響 不同濃度茵梔黃作用24h、36h，Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的表達明顯升高：0.1μM、1μM茵梔黃作用24h，三個濃度的茵梔黃作用36h，Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的表達均明顯高于溶媒對照組（P＜0.05）。不同濃度茵梔黃處理48h，Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的表達明顯降低：茵梔黃三個濃度組Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的表達明顯低于溶媒對照組（P＜0.05）；并且，隨著茵梔黃濃度的升高，Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的表達逐漸降低（P＜0.05）。見表1、附圖：

表1 不同濃度茵梔黃作用不同時間Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的表達（±s ）

表1 不同濃度茵梔黃作用不同時間Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的表達（±s ）

與DMSO溶媒對照組比較：1)P＜0.05；與茵梔黃0.01μM組比較：2)P＜0.05；與茵梔黃0.1μM組比較：3)P＜0.05

組別 24h 36h 48h DMSO溶媒對照組 0.11±0.01 0.17±0.03 0.17±0.02苯巴比妥陽性對照組 0.21±0.01 0.53±0.04 0.54±0.061)茵梔黃處理組0.01μM 0.13±0.02 0.48±0.071) 0.08±0.021)0.1μM 0.19±0.041)0.51±0.061) 0.05±0.011)2)1μM 0.22±0.061) 0.52±0.051) 0.02±0.021)2)3)

附圖 Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的表達（1,4,7：DMSO溶媒對照組；2,5,8：苯巴比妥陽性對照組；3,6,9：0.01μM、0.1μM、1μM茵梔黃作用36h）

2.2 重組真核表達載體CAR對CYP3A4的轉錄激活作用 與轉入CAR載體DMSO溶媒對照組比較，轉入CAR載體茵梔黃各處理組Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的轉錄水平明顯升高（P＜0.05）；并且，轉入CAR載體茵梔黃各處理組Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的轉錄水平均明顯高于轉入空載體Chang Liver細胞（P＜0.05）。無論是否轉入CAR載體，茵梔黃3個濃度組Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的轉錄水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；并且， 茵梔黃3個濃度組Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的轉錄水平與苯巴比妥陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2：

表2 轉入CAR載體后不同濃度茵梔黃處理36h對Chang Liver細胞CYP3A4轉錄水平的影響（±s ）

表2 轉入CAR載體后不同濃度茵梔黃處理36h對Chang Liver細胞CYP3A4轉錄水平的影響（±s ）

與DMSO溶媒對照組比較：1)P＜0.05

組別 轉入不同載體空載體 CAR DMSO溶媒對照組 1.01±0.02 1.44±0.20苯巴比妥陽性對照組 2.94±0.301) 13.24±2.711)茵梔黃處理組0.01μM 2.46±0.211) 9.15±0.461)0.1μM 2.58±0.131) 12.14±1.291)1μM 2.79±0.191) 13.22±2.371)

3 討論

黃疸主要是肝細胞對膽紅素攝取與排泄障礙的結果，中醫(yī)將未結合膽紅素增高所引起的黃疸稱為“陽黃”。茵桅黃為中藥制劑，源于《傷寒論》茵陳篙湯加減，主要成分為茵陳、桅子和金銀花，具有抗炎、解毒、抗腫瘤、退黃之功效，目前臨床上廣泛應用于急、慢性肝炎及重癥肝膽疾病的治療和新生兒病理性黃疸的防治，對于“陽黃”療效肯定[5-6]。目前，臨床上治療黃疸的西藥主要有糖皮質激素、苯巴比妥，新一代藥物有優(yōu)思弗（熊去氧膽酸）等[7]。但傳統(tǒng)西藥都各有副作用，療效也不盡如人意，而新藥又價格昂貴，病人的經(jīng)濟負擔較重。

關于黃疸機制的研究，過去多集中在OATP2（陰離子轉運蛋白2）等膽紅素代謝的轉運體[7]。但眾多研究提示，在膽紅素代謝過程中CYP450超家族中的成員之一的CYP3A4占有重要地位，CYP3A4可代謝藥物和包括膽紅素和膽汁酸在內的多種內、外源性物質，其活性能影響肝臟對膽紅素的攝取和結合能力。構成性雄烷受體(CAR)和孕烷X受體(PXR)屬于孤兒核受體家族成員，肝臟和腸道表達較多，是一種核轉錄調節(jié)因子，具有特異性DNA結合區(qū)和轉錄活性區(qū)[9]，被配體激活后可調控下游一系列靶基因的轉錄，如CYP2C9、CYP3A4等[8-9]。CAR基因敲除鼠，由于CYP3A4

表達量降低導致膽紅素代謝障礙可產生膽汁淤積造成的肝臟損害[10-11]。因此推測，CYP450酶活性降低可能是黃疸發(fā)生發(fā)展的重要因素，對CYP450酶的誘導可能是中藥利膽退黃的作用基礎。

本研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃（不同濃度作用24h、36h）可上調Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的表達水平，且呈一定的劑量依賴性；不同濃度茵梔黃作用48h時Chang Liver細胞CYP3A4 mRNA的表達水平降低，可能與茵梔黃抗腫瘤、抑制細胞增殖的作用有關，但還需進一步研究來驗證。另外，本研究通過共轉染CAR表達載體和CYP3A4報告載體，利用報告基因技術發(fā)現(xiàn)，茵梔黃可通過活化核受體CAR增加CYP3A4的轉錄。因此提示，CYP3A4表達水平增加后導致膽紅素的排出增加可能是茵梔黃治療黃疸的分子機制之一。

綜上所述，通過研究茵梔黃對CYP酶的作用可為開發(fā)和研制治療黃疸的新藥，以及提高和改善臨床上現(xiàn)有治療黃疸藥物的療效提供實驗依據(jù)。

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TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF YINZHIHUANG ON CYP3A4 MEDIATED BY STRUCTURAL

MALE STEROID RECEPTOR CAR
LI Bao-qun, BI Hong-dong, GUO Na-na, et al (Department of Pharmacology, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects and mechanisms of Yinzhihuang on transcription of CYP3A4.Methods:The Chang Liver cells were cultured with 0.01μM, 0.1μM, 1μM Yinzhihuang respectively for 24h, 36h and 48h. The expression of CYP3A4 mRNA was detected by RT-PCR and dual-luciferase reporter assay.Results:The Chang Liver cells were cultured with Yinzhihuang of different concentration for 24h and 36h could obviously increase the expression of CYP3A4 mRNA (P＜0.05). The Chang Liver cells that transfected CAR vector were cultured with different concentrations of Yinzhihuang for 36h could activate transcription of CYP3A4.Conclusions:Yinzhihuang may increase the transcriptional expression of CYP3A4 in Chang Liver cells mediated by CAR.

Yinzhihuang; Structural male steroid receptor CAR; CYP3A4; Reporter gene; Transcriptional expression

R961

A

1004-6879（2017）05-0361-03

2016-10-25）

* 河北省教育廳青年基金項目（QN2016127，QN2017006）

△ 通訊作者