凋亡抑制基因Livin在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系*

馬 鵬，馮 俊,彭 濤

南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 耳鼻咽喉頭頸外科 (南充 637000)

·論著·

凋亡抑制基因Livin在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系*

馬 鵬，馮 俊△,彭 濤

南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 耳鼻咽喉頭頸外科 (南充 637000)

目的分析Livin基因在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，并探究其在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用及機(jī)制，為喉鱗癌的臨床診斷、治療以及病情預(yù)測提供可參考依據(jù)。方法選取2013年3月至2016年10月南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科經(jīng)手術(shù)切除的34例喉鱗癌組織、19例癌旁組織和15例正常喉黏膜組織，分別應(yīng)用SP免疫組化法檢查Livin的表達(dá)情況，并結(jié)合患者的病理結(jié)果和隨訪資料，探究Livin表達(dá)與各臨床特點(diǎn)以及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果Livin在喉鱗癌組織中的高表達(dá)率為70.59%，在癌旁組織中的高表達(dá)率15.79%，在正常喉黏膜組織中無Livin高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在喉鱗癌中，Livin高低表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、病理分級以及病程差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但與患者年齡、性別、腫瘤病灶大小和臨床分型差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)Cox 回歸性分析發(fā)現(xiàn)，Livin陽性表達(dá)、病程長、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級和癌癥晚期是影響喉鱗癌患者生存率的獨(dú)立危險因素。結(jié)論Livin基因的陽性表達(dá)在喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮著重要作用，可將其作為判斷喉鱗癌病情進(jìn)展及預(yù)后的主要指標(biāo)之一。

喉鱗狀細(xì)胞癌；凋亡抑制基因；Livin；免疫組化法；預(yù)后

喉鱗狀細(xì)胞癌是臨床較為多見的一種頭頸部惡性腫瘤，近年來，隨著人們生活習(xí)慣改變或環(huán)境污染加重，其發(fā)生率呈逐年增長趨勢，極易影響患者的生活質(zhì)量并危害其生命。因此，探討分析喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及其預(yù)后成為了臨床工作者研究的課題之一。相關(guān)研究[1]報道，目前對于喉鱗癌的發(fā)生機(jī)制尚無明確說法，但癌癥發(fā)生的重要原因?yàn)轶w內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡被抑制，而正常組織細(xì)胞的凋亡、增殖功能失調(diào)。Livin是近年新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因，多在癌變組織中呈高表達(dá)，且能夠發(fā)揮極強(qiáng)的抗凋亡作用[2]。本研究主要探究Livin在喉鱗癌組織、癌旁組織及正常組織中表達(dá)情況，并觀察其與喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系，為喉鱗癌的臨床診斷、治療、病情預(yù)測提供可參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料

選取2013年3月至2016年10月南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科經(jīng)手術(shù)切除的原發(fā)喉鱗癌組織標(biāo)本34例，另取距離癌灶邊緣<0.5 cm的癌旁組織標(biāo)本19例和距離癌灶邊緣>2.0 cm的正常喉黏膜組織15例。所有患者均為首次進(jìn)行手術(shù)，術(shù)前未曾接受放化療等其他治療方式，愿意配合研究，簽訂知情同意書，且其臨床資料齊全。術(shù)后經(jīng)病理活檢證實(shí)癌旁組織和正常喉黏膜組織為正常黏膜或炎癥狀態(tài)，而原發(fā)喉鱗癌組織明確為鱗狀細(xì)胞癌。34例原發(fā)喉鱗癌患者中，男32例，女2例；年齡30～72(58.23±2.55)歲；病程1～10(5.04±1.36)年；臨床分期：4例為Ⅰ期，9例為Ⅱ期，11例為Ⅲ期，10例為Ⅳ期；喉癌分型：12例聲門型，20例聲門上、下型，2例跨聲門型；16例患者無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，18例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。上述標(biāo)本均在解剖后1 h內(nèi)收集完畢，并用10%福爾馬林妥善固定，石蠟包埋，連續(xù)4張切片(厚4 μm)，備用。

1.2試劑

Livin兔抗人多克隆抗體(美國Imgenex公司)，SP免疫組化試劑盒(購于上海研卉公司)。

1.3方法

操作步驟嚴(yán)格按照SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。具體操作如下：1)脫臘：將切片常溫放置60 min，隨后將其經(jīng)二甲苯 Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡10 min；2)脫水：在室溫條件下，用3%雙氧水浸濕切片并靜置10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；3)抗原修復(fù)：先用PBS緩沖液沖洗切片3次，然后放置在微波爐內(nèi)，以中檔微波處理10 min；4)血清封閉：用正常山羊血清封閉，室溫下靜置10 min，并吸取多余液體；5)滴加一抗：滴加適量濃度為1∶200的 Livin抗體，室溫放置1 h； 6)滴加二抗：滴加適量生物素標(biāo)記的二抗，室溫靜置30 min；7)滴加三抗：滴加1滴辣根過氧化氫酶標(biāo)記的三抗，室溫靜置30 min；8)顯色和復(fù)染：用PBS緩沖液沖洗切片3次，用DAB顯色液顯色后，再用自來水沖洗10 min，然后利用蘇木素復(fù)染2 min；9)封片：用梯度酒精脫水后，再用二甲苯透明，就可以用中性樹膠滴在組織附近以封片，進(jìn)行鏡檢；10)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照：已知的Livin表達(dá)陽性喉鱗癌切片；陰性對照：利用PBS緩沖液來取代一抗溶液。

1.4結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

每張切片在BX43-12P02顯微鏡(奧林巴斯)下，隨機(jī)選取5個高倍鏡視野，每視野計數(shù)≥100個細(xì)胞。 Livin主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，若切片經(jīng)蘇木素復(fù)染后，在顯微鏡下見胞質(zhì)呈棕黃色則為Livin陽性細(xì)胞[3]。Livin陽性表達(dá)主要根據(jù)細(xì)胞染色深淺程度和Livin陽性細(xì)胞百分比來綜合判斷。1)染色程度：若染色為深褐色則3分，棕黃色則2分，淡黃色則為1分，未染色的為0分；2)Livin陽性細(xì)胞>75%為4分，51%～75%為3分，26%～50%為2分，6%～25%為1分，<6%為0分。若1)×2)得分在9～12分則為強(qiáng)陽性(+++)，4～8分則為陽性(++)，1～3分則為弱陽性(+)，0分則為陰性(-)。其中，將強(qiáng)陽性、陽性患者納入Livin高表達(dá)，而弱陽性、陰性者則為Livin低表達(dá)[4]。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

研究數(shù)據(jù)分析使用SPSS 18.0軟件包，定性資料采用例數(shù)(%)描述，經(jīng)2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；另外，運(yùn)用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，而多因素分析則使用Cox回歸模型。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特別說明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1Livin在喉鱗癌組織、癌旁組織和正常喉黏膜組織中的表達(dá)率比較

經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Livin主要在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核上著色，呈棕黃色顆粒狀(圖1)。此外，Livin在喉鱗癌組織中的高表達(dá)率為70.59%，明顯高于癌旁組織(15.79%)和正常喉黏膜組織(0.00%)(P<0.05)(表1和圖2)。

圖1 喉鱗癌組織、癌旁組織和正常喉黏膜組織的切片免疫組化(×250) 注：A. Livin蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá)；B. Livin蛋白在喉癌旁組織中的表達(dá)；C. Livin蛋白在正常喉黏膜組織中的表達(dá)

表1Livin在喉鱗癌組織、癌旁組織和正常喉黏膜組織中的表達(dá)率比較

樣本樣本數(shù)Livin低表達(dá)高表達(dá)高表達(dá)率[n(%)]喉鱗癌組織34102424(70.59)癌旁組織191633(15.79)正常喉黏膜組織151500(0.00)Fisher精確概率25.508P<0.001

圖2Livin在喉鱗癌組織、癌旁組織和正常喉黏膜組織中的表達(dá)率比較

2.2Livin在喉鱗癌組織中的表達(dá)和與各項(xiàng)臨床特點(diǎn)的關(guān)系

在喉鱗癌組織中，Livin高表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級以及病程差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但與患者年齡、性別、腫瘤病灶大小和臨床分型差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

2.3喉鱗癌組織中Livin表達(dá)與生存率的關(guān)系

2.3.1 單因素分析 將可能影響喉鱗癌患者生存率的9個危險因素應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病程、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級和Livin表達(dá)對患者生存率具有明顯的影響(P<0.05)(表3和圖3)。

表2Livin在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)和與各項(xiàng)臨床特點(diǎn)的關(guān)系

臨床特點(diǎn)樣本數(shù)Livin低表達(dá)高表達(dá)高表達(dá)率/%x2P性別 男3292371.880.4340.510 女21150.00年齡/歲 ≥601541173.330.0970.755 <601961368.42病程 >6個月2222090.9112.398<0.001 ≤6個月128433.33腫瘤病灶大小/cm >31851372.220.0490.824 ≤31651168.75臨床分型 聲門型124866.670.6850.710 聲門上、下型2051575.00 跨聲門型21150.00臨床分期 Ⅰ～Ⅱ期127541.677.4720.006 Ⅲ～Ⅳ期2231986.36病理分級 低分化1411392.867.8520.020 中分化1661062.50 高分化43125.00淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有1811794.4410.4850.001 無169743.75

表3 影響喉鱗癌患者生存率的單因素分析

2.3.2 多因素分析 將性別、年齡、病程、腫瘤病灶大小、臨床分型、臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Livin表達(dá)設(shè)置為自變量進(jìn)行Cox多因素回歸性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Livin高表達(dá)、病程長、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌癥晚期是影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存率的獨(dú)立危險因素(P<0.05)(表4)。

表4 影響喉鱗癌患者生存率的多因素分析

圖3 Livin高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存率曲線圖

3 討論

喉鱗狀細(xì)胞癌是一種由喉部鱗狀上皮黏膜組織發(fā)生病變所導(dǎo)致的癌癥，其發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的2.5%，占頭頸部癌癥的10%～30%[5]。患者多表現(xiàn)為聲嘶、咽喉部及耳部疼痛、咳嗽、血痰、頸部可觸及包塊，甚者還可出現(xiàn)呼吸困難等，影響患者正常生活和工作，并危及其生命。因此，積極尋找合理、有效的治療方案對改善本病患者預(yù)后、延長其生存期具有至關(guān)重要的臨床意義。然而，目前在臨床上對于喉鱗癌的具體發(fā)病原因仍不十分明確，為臨床治療增加了難度，但也有大量研究[6]證實(shí)，細(xì)胞凋亡過程紊亂是喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制之一。因此，如何促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞凋亡、阻止癌癥細(xì)胞增殖，引起了臨床工作者關(guān)注。

Livin為凋亡抑制蛋白家族中一員，具有極強(qiáng)的細(xì)胞凋亡抑制作用，不但能影響細(xì)胞凋亡周期，還可以參與細(xì)胞凋亡信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Nedelcu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Livin在癌癥組織中的表達(dá)率明顯高于正常組織，且存在于多種惡性腫瘤細(xì)胞中，如黑色素瘤、胃癌、膀胱癌、卵巢癌等。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，Livin在喉鱗癌組織中的高表達(dá)率為70.59%，明顯高于癌旁組織(15.79%)和正常喉黏膜組織(0.00%)，與趙厚育等[8]的研究結(jié)果基本吻合，其研究結(jié)果報道，Livin在喉癌組織中的表達(dá)率61.50%，而在正常組織中呈陰性表達(dá)，說明Livin的表達(dá)可能與喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有緊密關(guān)系。

相關(guān)研究[9]報道，喉鱗癌的發(fā)生主要與細(xì)胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡失調(diào)有關(guān)，而Livin在癌組織中的高表達(dá)可進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、凋亡的距離增大，更有利于癌癥細(xì)胞繁殖，使腫瘤發(fā)生浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。黃方名等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Livin基因在喉原發(fā)鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)(72.58%)，且其表達(dá)率可隨癌癥的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級的升高而升高。本研究也顯示，在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中，Livin表達(dá)高低與臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級以及病程長短差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而與患者年齡、性別、腫瘤病灶大小、臨床分型差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因此，推測Livin表達(dá)率升高有可能是喉鱗癌病情進(jìn)一步惡化的標(biāo)志之一。

陳亮等[11]通過進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測90例乳腺癌患者中Livin表達(dá)對其預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)Livin陽性表達(dá)患者其3、5、10年生存率都明顯低于Livin低表達(dá)病患，提示Livin表達(dá)可能會影響患者預(yù)后。本研究為進(jìn)一步探究影響喉癌患者預(yù)后的因素，對有可能影響喉癌患者生存率的9個危險因素進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示，病程、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級和Livin表達(dá)對患者生存率具有明顯影響(P<0.05)，而患者性別、年齡、腫瘤病灶大小、臨床分型與其生存率無明顯相關(guān)性。然而，在臨床研究中可知道，影響喉鱗癌患者生存率的因素是多方面相互作用的，如果只是從某1個因素進(jìn)行論述研究，其結(jié)果缺乏科學(xué)性、真實(shí)性。Cox回歸模型是多因素生存分析方法，可以對各項(xiàng)影響因素進(jìn)行篩查、綜合分析，有效避免混雜因素對研究結(jié)果的影響[12]。本研究利用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Livin高表達(dá)、病程長、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌癥晚期是影響喉鱗癌患者生存率的獨(dú)立危險因素。

綜上所述，Livin基因表達(dá)在喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮著重要作用，可將其作為判斷喉鱗癌病情進(jìn)展及預(yù)后的主要指標(biāo)之一。

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TheExpressionofLivininLaryngealSquamousCellCarcinomaandItsCorrelationwithPrognosis

MaPeng,FengJun△,PengTao.

DepartmentofOtorhinolaryngology-HeadandNeckSurgery,NanchongCentralHospital,TheSecondClinicalMedicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China

ObjectiveTo analyze the expression of Livin gene in the tissues of laryngeal squamous carcinoma, investigate the role and mechanism of Livin gene in the occurrence, development and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma, and provide a reference for the clinical diagnosis and treatment and the disease prediction.MethodsThe tissues insected from34cases of laryngeal carcinoma tissues,19cases of paracancerous tissues and15cases of normal laryngeal mucosa tissues from March of2013to October of2016in Nanchong Central Hospital were selected and examined by the SP immunohistochemical method to detect the expression level of Livin. The pathological results and follow-up data were analyzed to investigate the correlation of the Livin expression level with the clinical features and prognosis respectively.ResultsThe high expression rate of Livin in the tissues of laryngeal squamous cell carcinoma and the paracancerous tissues were70.59% and15.79% respectively and there was no high expression of Livin in the normal laryngeal mucosa tissues. There were significant differences between the three groups (P<0.05). In laryngeal squamous cell carcinoma, the expression level of Livin was correlated with clinical stage, lymph node metastasis, pathological grading and disease course (P<0.05), while it was not correlated with age, gender, tumor size and clinical type (P>0.05). The results of Cox regression analysis showed that the positive expression of Livin, long disease course, lymph node metastasis, pathological grading and advanced cancer were independent risk factors of the survival rate of the patients with laryngeal squamous cell carcinoma.ConclusionThe positive expression of Livin gene plays an important role in the occurrence, development and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma. It can be used as one of the main indexes to evaluate the progress and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma.

Laryngeal squamous cell carcinoma; Apoptosis inhibitory gene; Livin; Immunohistochemical method; Prognosis

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170721.1016.014.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.04.015

川北醫(yī)學(xué)院博士科研啟動項(xiàng)目(No:CBY-QD-08)；南充市科學(xué)技術(shù)和知識產(chǎn)權(quán)局項(xiàng)目(No:16YFZJ0021)

：馮俊，E-mail:flj20041201@163.com

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