基于MicroRNAs的鎖核酸抗腫瘤基因治療新進展

肖樹榮+許桂丹+鄧益斌

【關(guān)鍵詞】鎖核酸；MicroRNAs；腫瘤；治療

中圖分類號：R730.54 文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.04.027

腫瘤是一種涉及編碼或非編碼基因結(jié)構(gòu)和表達異常引起的疾病。MicroRNAs（miRNAs）調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因和其他非編碼轉(zhuǎn)錄的表達，被認為是細胞生理活動的主要調(diào)控物之一，過去十幾年針對miRNAs研究很多。目前認為，miRNAs的異常調(diào)節(jié)，很大程度上影響基因的表達，并且與許多疾病相關(guān)，特別在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。miRNAs在癌癥生物學和腫瘤學中被廣泛研究，給我們帶來大量關(guān)于miRNA在腫瘤細胞的病理生理學、腫瘤與miRNA失衡的相關(guān)信息。在腫瘤細胞內(nèi)調(diào)控miRNA水平的治療策略向臨床前和臨床期新治療方法發(fā)展。鎖核酸（locked nucleic acid，LNA），本質(zhì)是一種核苷酸衍生物，因其具有的親和性、熱穩(wěn)定性、抗酶切性等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于各種疾病治療中，特別是基于miRNAs在腫瘤治療中已被大量研究并取得一定成果。雖然現(xiàn)在針對miRNA治療策略有一定的局限性和障礙，但越來越多的研究成果不斷克服這些障礙，使這種治療策略具有可行性?，F(xiàn)就此綜述如下。

1miRNAs的生物活性

miRNAs是一種內(nèi)源性?。?1～24 nt）單鏈非編碼RNAs，在細胞內(nèi)主要的功能是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控mRNAs翻譯[1]。miRNAs開始的生物合成在細胞核。初級miRNA（pri-miRNAs）由RNA聚合酶Ⅲ和聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成，進一步被核糖核酸酶Drosha和DGCR8蛋白切割形成前體miRNA（pre-miRNAs）。pre-miRNAs接著從細胞核通過轉(zhuǎn)運蛋白Exportin5運到細胞質(zhì)。在細胞質(zhì)核酸內(nèi)切酶Dicer和TRBP蛋白相互作用下，成熟的miRNAs被合成，雙鏈結(jié)構(gòu)被重新整理，引導(dǎo)鏈與Argonau和其他蛋白形成miRISC復(fù)合體，在基因表達中起到積極作用[2]。另外一條鏈，也即是隨從鏈，常在細胞質(zhì)被降解，或者存留，并發(fā)揮自己具有的生物活性。

2作用機制

miRNAs主要與mRNA的3非翻譯區(qū)（3-UTR）結(jié)合，少數(shù)能結(jié)合于5非翻譯區(qū)（5-UTR），或自身的編碼序列。RNA沉默機制中，在不完全匹配的情況下，mRNA：miRNA雜交體翻譯被抑制或翻譯不完全，多肽鏈隨后被降解。miRNAs結(jié)合于目標mRNA也激活mRNA末端的3-poly（A）脫腺苷化，這是mRNA第一步去穩(wěn)定化和隨后被5和3核酸外切酶降解。mRNA：miRNA雜交體在完全匹配的情況下會直接切割目標mRNA，但一般在動物細胞不完全匹配是最普遍的，而完全匹配主要存在于植物細胞。miRNAs種子序列確保結(jié)合的特異性，其包含6～8 nt和種群上非常保守。一種miRNAs能調(diào)控多種不同的基因，而且超過50%的基因被miRNAs調(diào)控，因此，miRNAs通過基本代謝維持、分化、分裂、增殖到死亡，影響大多數(shù)細胞進程。在腫瘤組織，大多數(shù)的miRNAs水平發(fā)生變化，miRNAs減少我們稱之為腫瘤抑制物，反之，在腫瘤細胞中大量的表達為致癌miRNAs。一些細胞實驗和動物實驗結(jié)果證明通過增加特異性miRNAs腫瘤抑制物水平或減少致瘤miRNAs水平，可以逆轉(zhuǎn)miRNAs水平回歸生理平衡，從而達到治療的目的[3]。

3鎖核酸的化學結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

3.1化學結(jié)構(gòu)鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）也稱橋核酸，是一種化學結(jié)構(gòu)較特殊的雙環(huán)狀高親和性RNA衍生物，其分子結(jié)構(gòu)中含有一個或多個 2 -O，4 -C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單體。核糖結(jié)構(gòu)的 2 -O 位和 4 -C 位由于縮水作用不完全相同，可以形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋三種亞甲基橋，并連接成環(huán)形，形似鎖狀或橋狀，因此而得名。這個環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3 - 內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架的局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[4]。LNA 的特殊構(gòu)象能夠?qū)е潞怂峁歉傻念A(yù)組裝，在某種程度上增加堿基堆積力，有利于雙鏈形成[5]。

3.2理化性質(zhì)正是因為LNA化學結(jié)構(gòu)上的特殊構(gòu)象原因，使其理化性質(zhì)比其他寡核苷酸具有以下的六個優(yōu)勢更突出：（1）LNA具有水溶性好的特性，能自由出入細胞，易被機體吸收。（2）明顯改善抗核酸酶切割能力：血液中siRNA極不穩(wěn)定，未修飾的siRNA易被大量的核糖核酸酶迅速分解。有研究證明，在siRNA 3末端被LNA單體修飾后，siRNA抗核酸酶切割能力和在血清中的半衰期明顯提高[6]。（3）LNA與DNA或RNA結(jié)合時，錯配辨別力更強。（4）與互補序列的雜交高親和性：因為LNA堿基與互補DNA、RNA的磷酸鹽骨架相同，不但使得雜交時具有更高親和力，而且這種相同的磷酸鹽骨架能使互補序列容易被LNA識別，從而容易形成高親和力的雜交物。（5）與互補雙鏈的熱穩(wěn)定性增加：LNA單體修飾到寡核苷酸鏈中時，能明顯提高其解鏈溫度（Tm）。有研究證明，在LNA 與DNA形成的雜交雙鏈后，Tm可提高2℃～6℃，而在與RNA形成的雜交雙鏈中，Tm可提高3℃～9℃[7]，可見明顯增加與互補雙鏈的熱穩(wěn)定性。（6）LNA的無毒性：LNA注射進小鼠體內(nèi)后，對其做毒副作用檢測（肝腎功能生化指標和病理檢查），未發(fā)現(xiàn)有明顯變化和病理改變[8～9]。正是因為LNA所具有的這些優(yōu)勢，近年來在腫瘤基因治療中，LNA成了學者的研究熱點。

4鎖核酸在基于miRNAs治療腫瘤

4.1LNA修飾反義miRNAsmiRNAs不僅與腫瘤發(fā)展、分化、凋亡和增殖等生物進程有關(guān)，而且其表達圖譜與腫瘤病人的階段、進程、預(yù)后呈相關(guān)性。miRNA與目標mRNA生物活性功能的發(fā)揮是通過Watson-Crick堿基配對原則相互結(jié)合。因此，如果設(shè)計一種反義寡核苷酸互補于miRNA，并與之牢固結(jié)合，使其不能有效結(jié)合于靶標mRNAs，那么就可以阻斷miRNAs對mRNAs的調(diào)控，從而有效抑制mRNA功能活性，這種治療方法就是反義治療。反義寡核苷酸治療策略依靠RNase H及其他機制成功用于抑制基因的表達在十多年前已經(jīng)報道。然而，要使反義寡核苷酸高效、特異、完好地到達細胞內(nèi)目標部位，必須經(jīng)過有效的修飾。雖然反義治療策略從概念理解是一種簡單、易操作的可行方法，但許多因素影響寡聚物與靶標之間的相互作用。其中的因素主要包括RNA靶標的結(jié)構(gòu)特征，寡聚物雜交的親和性，抗核酸酶的降解能力，與靶標RNA相互作用的機制，這些因素都會決定反義治療成敗，因此必須考慮這些因素才能獲得滿意的結(jié)果。LNA寡核苷酸用脂質(zhì)體、半乳糖配體載體等技術(shù)成功地轉(zhuǎn)染進細胞內(nèi)，他們序列特異、無毒性和提高細胞內(nèi)的抗核酸酶能力，使在反義治療誘導(dǎo)基因沉默更有效。另外，LNA擁有重要的物理化學性能，能為有效和安全的藥物提供更廣闊的發(fā)展空間。除此之外，對RNA目標分子還具有高效能，高親和力，容易被細胞攝取和生物分布的優(yōu)勢。不管是反義抑制mRNAs還是其他沉默的方法，在RNA-DNA雜化雙鏈，要有效地抑制目標mRNA需要激活RNAse H，這種酶能有效切割RNA。此外，完全修飾LNA寡核苷酸不能降低RNAse H的活性。LNA一般位于寡核苷酸的末端，中間部分DNA序列至少有8個核苷酸是未修飾的，這樣有利于RNAse H切割目標mRNA[10～11]。除了LNA外，其他有效修飾anti-miRs的還有硫代核苷酸和肽核酸等。但在這些核苷酸修飾物中，LNA與互補目標RNA擁有更高的親和力，因此LNA-anti-miRs更適合應(yīng)用于miRNA的靶向治療。endprint

4.2LNA-antimiRs在腫瘤中的治療應(yīng)用利用LNA修飾反義miRNAs（LNA-anti-miRs）下調(diào)相應(yīng)miRNAs的表達量而起到干預(yù)治療腫瘤的目的，這個治療策略的有效性在各種腫瘤中均有報道。M Sharifi等[12]在急性巨細胞白血病細胞系（M-07e）用LNA-anti-miR92a-3p轉(zhuǎn)染阻斷miR-29a-3p表達并研究細胞增殖、凋亡和壞死情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染LNA-anti-miR92a-3p后的三個時間點，經(jīng)檢測miR-92a-3p的表達量減少后，細胞的凋亡率、壞死率相應(yīng)增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，證明阻斷miR-92a-3p表達可以誘導(dǎo)急性巨細胞白血病細胞凋亡和壞死。相似的，在急性早幼粒白血病細胞系（HL-60）用LNA-anti-miR92a抑制miR-92a后誘導(dǎo)細胞凋亡，可廣泛減弱細胞的生存能力[13]。在結(jié)腸惡性腺瘤中miR-21明顯升高，針對這個研究背景，R Nedaeinia等[14]設(shè)計LNA-anti-miR-21靶向抑制miR-21表達誘導(dǎo)基因沉默。在結(jié)腸癌LS174T細胞系轉(zhuǎn)染LNA-anti-miR-21后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21的表達量減少，侵襲能力減弱，生存能力降低并誘導(dǎo)細胞的凋亡。LNA-anti-miRs不僅在細胞實驗中取得了良好效果，在小鼠體內(nèi)實驗也證明了方法的有效性。在鼻咽癌細胞和組織中MiR-214過度表達。Zhang Z-C等[15]在細胞實驗中用LNA-anti-miR-214沉默MiR-214后導(dǎo)致促進細胞凋亡和抑制細胞的增殖，在裸鼠體內(nèi)實驗時，發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長受到有效抑制，證明MiR-214在鼻咽癌起到重要作用。髓母細胞瘤（MB）起源于小腦，是兒童腦部最常見的惡性腫瘤。高表達miRNAs被miR-17～92 和miR-106b～25族編碼。Brian L.Murphy等[16]用LNA-anti-miR的治療，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞miR-17 和miR-19a分別被antimiR-17 和 antimiR-19抑制后，在體外腫瘤細胞的增殖能力減弱。同時用antimiR-17 和 antimiR-19治療小鼠，不僅減慢腫瘤的生長速度而且能延長顱內(nèi)移植小鼠的生存率。miR-221/222在多發(fā)性骨髓瘤（MM）t（4；14）易位病人中惡性漿細胞過度表達，Di Martino MT等[17]采用LNA-i-miR-221觀察抗腫瘤效果，結(jié)果顯示在體外LNA-i-miR-221具有很強的對抗活性抑制miR-221和誘導(dǎo)內(nèi)源性目標p27Kip1下調(diào)，有明顯的抗增殖作用。在體內(nèi)LNA-i-miR-221引起明顯抗腫瘤活性對抗t（4；14）MM移植瘤，也誘導(dǎo)miR-221下調(diào)，上調(diào)p27Kip1，減少Ki-67，治療后在相關(guān)器官未發(fā)現(xiàn)毒性改變。

4.3耐藥敏感miRNA在各種惡性腫瘤藥物耐藥的產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用。尤其是在調(diào)控藥物流出轉(zhuǎn)運蛋白、誘導(dǎo)細胞凋亡、細胞周期、DNA修復(fù)機制和其他改變藥物目標作用更突出。例如他莫西芬是一種對雌激素受體陽性（ER+）乳腺癌病人有效的抗雌激素治療藥物，然而，常常會觀察到他莫西芬耐藥的出現(xiàn)。其耐藥潛在的分子機制與某些miRNA（如miR-190b 和 miR-516a-5p）介導(dǎo)調(diào)控ESR1，PGR1，F(xiàn)OXM1 和 14-3-3家族的基因有關(guān)，這些基因的失調(diào)控可能產(chǎn)生他莫西芬耐藥[18]。因此，對miRNA進行調(diào)控有可能改善藥物耐藥情況，國內(nèi)外對此做了大量研究。順鉑（cisplatin，DDP）是肺癌最有效的化療劑之一，被廣泛用于一線化療，然而長期用藥容易產(chǎn)生耐藥。有研究[19～20]設(shè)計合成LNA-anti-miR-21和LNA-anti-miR-196a抑制相應(yīng)的miRNA生成，觀察miRNA-21、miRNA-196a在非小細胞肺癌體內(nèi)和體外敏感性，當下調(diào)miRNA-21、miRNA-196a時DDP在肺癌細胞的化學敏感性提高，反之，上調(diào)時則降低DDP化學敏感性，實驗證明miRNAs在藥物抵抗中起著關(guān)鍵作用。另有研究[21]證明LNA-anti-miR-221能逆轉(zhuǎn)美法侖（melphalan）在多發(fā)性骨髓瘤前臨床模型中藥物抵抗，為臨床實驗克服藥物抵抗和提高多發(fā)性骨髓瘤病人的預(yù)后提供理論依據(jù)，更重要的是在治療的小鼠體內(nèi)沒有找到毒性和副作用的證據(jù)。

5LNA-anti-miR藥物動力學和安全性

LNA-anti-miR用于細胞和小鼠短期能有效抑制miRNA生成，并成為人類疾病有前途的治療靶標，在體內(nèi)體外實驗對腫瘤的治療起到了一定的作用。但是這個方法在高等動物（比如人類和非靈長類動物）長期有效性和安全性并沒有得到證明，因此對其需進一步的研究。在鼠和猴血漿、尿液、及組織評估LNA-anti-miR-221藥物動力學和藥效學，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LNA-anti-miR-221在鼠和猴半衰期短、尿液排泄率低。直到第3周，隨著p27上調(diào)，LNA-anti-miR-221仍然在鼠重要器官和腫瘤中檢測到，并且猴子沒有觀察到毒性反應(yīng)[22]。皮下給藥LNA-anti-miR非靈長性動物超過108天的治療表現(xiàn)出好的耐受性[23]。研究這些數(shù)據(jù)在非靈長類動物代謝疾病模型證明LNA-anti-miR對抗miRNAs的有效性和安全性，表明LNA-anti-miR適合于臨床的應(yīng)用和人類疾病的治療。

6問題與展望

基于調(diào)控miRNA治療腫瘤策略具有較高的特異性和靶向性，使之可能成為一種具有美好前景的治療腫瘤的方法。然而，在此基礎(chǔ)上，要達到更高敏感性和特異性，加快這種治療方法應(yīng)用到臨床仍然要提高他們的化學設(shè)計，研究更好的遞送方式，延長治療的有效性，保證在體內(nèi)長期的安全性。此外，在應(yīng)用到臨床前有必要更深入認識潛在的miRNAs和人類基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學之間復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。總體而言，基于miRNA的治療可能會帶來一個令人興奮的、新的、面向個體化的醫(yī)學腫瘤治療策略。然而，我們必須更深入認識它的生物學知識和其與疾病的關(guān)系。endprint

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