急性有機磷中毒患者細胞因子水平與miR—93表達關(guān)聯(lián)性的研究

陸啟峰+鄒才華+李天資+梁燁+李近都+黃元東

【摘要】目的探討急性有機磷中毒（AOPP）患者細胞因子水平與miR-93表達的關(guān)聯(lián)性。方法選取2015年7月至2017年2月收治確診AOPP的 35例患者作為實驗組，選擇同期30例健康就診者作為對照組，對比觀察兩組患者腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、可溶性血管細胞黏附分子-1（sVCAM-1）、促炎因子白細胞介素-1β（L-1β）和miR-93表達水平。結(jié)果實驗組TNF-α、sVCAM-1和IL-1β高于對照組（P<0.001），miR-93表達水平低于對照組（P<0.001）。實驗組不同年齡miR-93水平均較對照組低（P<0.05或0.01）。miR-93表達與TNF-α、sVCAM-1、IL-1β水平呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.694、-0.621和-0.665，對應(yīng)F值分別為74.828、54.065、65.627（均P<0.001）。結(jié)論AOPP不同年齡患者的miR-93呈低表達現(xiàn)象，miR-93表達與TNF-α、sVCAM-1和IL-1β水平呈負相關(guān)，miR-93或許參與AOPP的病理生理過程。

【關(guān)鍵詞】急性有機磷中毒；細胞因子；miR-93

中圖分類號：R595.4文獻標(biāo)識碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.04.006

【Abstract】ObjectiveTo investigate connection between cytokine levels and miR-93 expression in patients with AOPP（acute organophosphorus pesticide poisoning）.Methods35 cases admitted to hospital and confirmed with AOPP from July，2015 to February，2017 were selected as experimental group，and 30 healthy people were selected as control group at the same time.Then，tumor necrosis factor-α（TNF-α），soluble vascular cell adhesion molecule-1（sVCAM-1），proinflammatory cytokines interleukin-1β（L-1β）and miR-93 expression levels were observed and compared between the two groups.ResultsTNF-α，IL-1β and sVCAM-1 of the experimental group were higher than those of the control group（P<0.001），but miR-93 expression level was lower than that of the control group（P<0.001）.The miR-93 levels at different ages in the experimental group were lower than those in the control group（P<0.05 or 0.01）.The miR-93 expression was negatively correlated with TNF-α，sVCAM-1 and IL-1β，and correlation coefficient was -0.694，-0.621，-0.665，respectively，and corresponding F value was 74.828，54.065，and 65.627，respectively（all P<0.001）.ConclusionMiR-93 expression is low in patients with AOPP at different ages，it is negatively correlated with TNF-α，sVCAM-1 and IL-1β.So miR-93 may involve in the pathophysiological process of AOPP.

【Key words】AOPP；cytokines；MiR-93

急性有機磷中毒（Acute organophosphorus pesticide poisoning，AOPP）患者，因各種原因引起有機磷誤進入機體后，其磷?；c乙酰膽堿酶的活性部分結(jié)合成磷?；憠A酯酶，后者不能分解乙酰膽堿，患者體內(nèi)乙酰膽堿異常升高，其膽堿能神經(jīng)過度興奮，最后轉(zhuǎn)入抑制和衰竭，出現(xiàn)臨床癥狀和體征[1]。AOPP患者的癥狀和轉(zhuǎn)歸與其機體的某些炎癥代謝異常有關(guān)[2]，患者的內(nèi)皮功能受損，巨噬細胞被活化，引起多種細胞因子的釋放[3]。miRNA與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)， miRNA-93通過調(diào)節(jié)某些炎癥因子的表達水平，從而影響患者對疾病的抵御反應(yīng)，但其機制還需進一步研究[4]。為了解AOPP患者miR-93和炎癥因子表達水平的關(guān)聯(lián)性，我們檢測35例AOPP患者腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、可溶性血管細胞黏附分子-1（sVCAM-1）、促炎因子白細胞介素-1β（L-1β）和miR-93表達水平，并與30例健康者比較，總結(jié)報告如下。

1對象與方法

1.1研究對象選取2015年7月至2017年2月本院收治符合AOPP診斷標(biāo)準(zhǔn)的 35例患者進入實驗組，男13例，女22例，年齡25～30（27.5±1.5）歲；選擇同期30例健康就診者作為對照組，男11例，女19例，年齡25～30（27.8±1.4）歲。兩組入選者均排除心、肝、腦、腎、肺疾患及代謝性疾病、高血壓和自身免疫性疾病，性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。endprint

1.2AOPP病例入選標(biāo)準(zhǔn)（1）有有機磷農(nóng)藥接觸史；（2）參照《職業(yè)性急性有機磷農(nóng)藥中毒的診斷及處理原則》（GB 7794-87），根據(jù)短時間接觸大量有機磷的職業(yè)史，在24小時內(nèi)出現(xiàn)頭暈、頭痛、惡心、嘔吐、多汗、胸悶、視力模糊、無力等癥狀，瞳孔可能縮小，結(jié)合全血膽堿酯酶活性在50%～70%，參考作業(yè)環(huán)境的勞動衛(wèi)生調(diào)查資料和皮膚污染情況，進行綜合分析，排除其他疾病后，確診為AOPP輕度中毒者，血清膽堿酯酶活力持續(xù)降低。

1.3實驗方法參加實驗者事先知道本項實驗的方法、目的和意義，征得受試者同意并簽署知情同意書后成為觀察對象。

1.3.1TNF-α、sVCAM-1的檢測受試者于清晨采血，采血前夜22：00后禁食，于早上6：00～7：00抽取靜脈血，第一管用EDTA抗凝管。取血2 ml，20～30 min內(nèi)室溫下以3000 r/min，離心10 min分離血清，TNF-α、sVCAM-1的檢測采用ELISA雙抗體夾心法，試劑分別由武漢博士德公司、法國IMMUNOTECH公司、福建邁特生物工程有限公司提供。IL-1β的檢測采用放免分析法，試劑由北京福瑞生物工程公司提供；酶標(biāo)儀使用奧地利LABTECH公司生產(chǎn)的ANTHOSHT 11型；計數(shù)儀為中國科技大學(xué)中佳公司生產(chǎn)的GC300型。

1.3.2提取RNA每位對象于采血前夜22：00后禁食，于早上6：00～7：00抽取靜脈血，第二管用PAX gene Blood RNA Tube，采2 ml全血，將采置血管上下顛倒10次。于4℃冰箱24 h內(nèi)用Taco全自動核酸提取儀提取RNA。經(jīng)2000 c微量分光光度計檢測260/280在1.8～2.0之間，260/230≥1.5。Agilent 2100 Bio analyzer檢測，RIN≥7.0，分裝后放置-80℃冰箱備用。

1.3.3儀器和試劑盒儀器：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Bio systems）實時PCR擴增儀Step One PlusTM，由愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易（上海）有限公司提供。試劑盒：miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒，均由上海江萊生物科技有限公司提供。所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.3.4miRNA-93的表達檢測用qRT-PCR法：按miR-cute miRNA（吸附柱法）提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書操作?；蛞镄蛄杏蒔rime premier 5.0軟件自行設(shè)計，由杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如表1。

1.3.5miR-93的相對表達量計算實驗以U6snRNA為內(nèi)參，⊿CT指標(biāo)的測定：⊿CT指在同一個樣品中，目的基因與內(nèi)參基因平均CT值的差值（CT=miR-93平均CT值-U6平均CT值，2⊿⊿CT表示實驗組目的基因表達/對照目的基因表達變化的倍數(shù)）。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計均由 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件包完成，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗，miR-93表達水平與TNF-α、sVCAM-1和IL-1β的關(guān)系采用線性相關(guān)分析，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2結(jié)果

2.1各組TNF-α、sVCAM-1、IL-1β和miR-93水平比較實驗組TNF-α、sVCAM-1和IL-1β高于對照組（P<0.001），miR-93表達水平低于對照組（P<0.001）。見表2。

2.2各組不同年齡miR-93水平比較實驗組不同年齡miR-93水平均較對照組低（P<0.05或0.01）。見表3、圖1。

2.3miR-93表達與TNF-α、sVCAM-1、IL-1β線性相關(guān)分析miR-93表達與TNF-α、sVCAM-1、IL-1β水平的相關(guān)系數(shù)分別為-0.694、-0.621和-0.665，呈負相關(guān)，對應(yīng)r值分別為74.828、54.065、65.627（均P<0.001）。3討論有機磷中毒患者的膽堿酯酶不能分解乙酰膽堿而導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)支配的器官功能亢進，其臨床癥狀與膽堿能受體的分布、患者生理效應(yīng)和對炎癥的反應(yīng)有關(guān)[5]。研究表明，AOPP迅速使機體發(fā)生膽堿能危象、內(nèi)毒素血癥和其他損傷途徑等導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損，激活單核巨噬細胞系統(tǒng)，使IL-1β、TNF-α和sVCAM-1炎癥因子水平升高[6]，進一步刺激可導(dǎo)致炎癥、組織損傷及血管功能障礙。業(yè)已證明，IL-lβ、TNF-α及sVCAM-l與AOPP患者的病情和預(yù)后有關(guān)聯(lián)[7]。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長20～25個核苷酸[8]。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。miRNA在細胞分化，生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用，miRNA控制發(fā)育開關(guān)或組織特異性基因的表達及其機制倍受關(guān)注。探討miRNA和疾病之間的關(guān)聯(lián)性，使其成為疾病診斷、疾病進展與轉(zhuǎn)歸的觀察指標(biāo)，對疾病治療、調(diào)控基因表達的分子靶點等都有現(xiàn)實意義，因此miRNA成為臨床研究的新熱點[9～18]。目前研究表明，miR-93的差異表達在腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、分化等方面發(fā)揮了重要作用，其通過靶向調(diào)控靶基因促進細胞的增殖，抑制凋亡[19]。本項研究表明，AOPP不同年齡的患者miR-93呈低表達現(xiàn)象，miR-93表達與TNF-α、sVCAM-1和IL-1β水平呈負相關(guān)，miR-93或許參與AOPP的病理生理過程。是否存在相關(guān)通路及靶點，使得miR-93表達水平影響TNF-α、sVCAM-1和IL-1β炎癥因子水平尚不十分清楚，值得廣大臨床工作者進一步研究探討。endprint

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