參附注射液對(duì)心力衰竭大鼠氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響*

鄧 萌 郭 麗張 麗

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002）

·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

參附注射液對(duì)心力衰竭大鼠氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響*

鄧 萌 郭 麗△張 麗

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002）

目的 觀察參附注射液對(duì)心力衰竭大鼠氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響并探討其機(jī)制。方法 將36只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（12只）、心衰模型組（12只）、參附治療組（12只），術(shù)后第4周開(kāi)始給予參附治療組每日1次灌胃給藥［日劑量6.0 mL/（kg·d）］，共4周。觀察評(píng)定左室舒張末徑（LVDS）、室收縮末徑（LVDd）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、短軸縮短率（FS）、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)心率（HR）、左心室收縮壓（LVSP）、左室舒張末期壓（LVEDP）、左心室壓變化速率最大值、心肌超氧化物歧化酶（SOD）含量、心肌丙二醛（MAD）含量及心肌目的蛋白質(zhì)等的變化。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組LVDd、LVDS明顯增大，LVEF、FS明顯下降，BNP水平明顯升高（均P<0.05）；參附注射液治療后與模型組比較，各指標(biāo)均改善（均P<0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組LVEDP明顯增大，LVSP下降，+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR明顯下降（均P<0.01）；參附注射液治療后與模型組比較，各指標(biāo)均改善（均P<0.01）。與假手術(shù)組比較，心衰模型組心肌SOD活性明顯降低（P<0.01），給予參附注射液處理后，心肌SOD活性明顯高于心衰模型組（P<0.01）；心衰模型組 MDA含量明顯高于假手術(shù)組（P< 0.01），參附注射液處理后，MDA含量明顯低于心衰模型組（P<0.01）。Bax蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，Bax/Bcl-2的比值明顯降低（P<0.01）。SOD與Bcl-2/Bax線性相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.652，P<0.001），存在線性正相關(guān)關(guān)系；MDA與Bcl-2/Bax線性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.644，P<0.001），存在線性負(fù)相關(guān)關(guān)系。結(jié)論 參附注射液可降低氧化應(yīng)激水平，抑制蛋白凋亡，從而改善心衰大鼠心功能，其機(jī)制可能與上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)有關(guān)。

心力衰竭 參附注射液 氧化應(yīng)激 細(xì)胞凋亡

慢性心力衰竭（CHF）是各種心臟疾病的終末階段，近年來(lái)發(fā)病率居高不下。其發(fā)病機(jī)制是近年來(lái)研究熱點(diǎn)。而其藥物干預(yù)治療研究更為臨床提供了理論依據(jù)。有研究顯示，參附注射液可顯著地將氧自由基去除、使脂質(zhì)的過(guò)氧化水平受到限制、降低血小板聚集、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、使心肌細(xì)胞的耗氧量下降，并抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡、降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡率，從而保護(hù)心?。?-2］。參附注射液影響CHF的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，目前尚未完全闡明，與一些相關(guān)危險(xiǎn)因素的關(guān)系還存在著不同的看法，有待于進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)測(cè)定心力衰竭大鼠氧化應(yīng)激水平及細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的變化，探討心力衰竭發(fā)生時(shí)氧化應(yīng)激水平與細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性，進(jìn)而闡明參附在慢性心力衰竭演變過(guò)程中所表現(xiàn)的保護(hù)作用及其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證：SCXK（黑）2013-001。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 UV751GD紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海分析儀器廠）；參附注射液（四川雅安三九藥業(yè)有限公司，50 mL/瓶，批號(hào)：Z2004-3117）；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，兔抗Bax多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體為美國(guó)Santa Cniz公司產(chǎn)品，由武漢博士德公司提供。

1.3 造模與分組 大鼠實(shí)驗(yàn)前普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組12只、心衰模型組12只、參附治療組12只。所有動(dòng)物均常規(guī)喂養(yǎng)。心衰模型造模方法：采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備心臟壓力負(fù)荷超載心衰模型，主要步驟如下，以10%水合氯醛（3 mg/kg）腹腔麻醉，備皮，常規(guī)強(qiáng)力碘消毒，逐層打開(kāi)腹腔，左側(cè)腎動(dòng)脈上方游離腹主動(dòng)脈長(zhǎng)約1 cm，與腹主動(dòng)脈平行放置7號(hào)鈍針頭，一同結(jié)扎后，腎出現(xiàn)缺血外觀，抽出針頭，使腹主動(dòng)脈部分縮窄，狹窄處內(nèi)徑0.7 mm，關(guān)腹。大鼠術(shù)后均予青霉素10萬(wàn)U 3 d預(yù)防感染。大鼠術(shù)后普通飼料喂養(yǎng)8周。假手術(shù)組除開(kāi)腹暴露、分離雙側(cè)腎動(dòng)脈間腹主動(dòng)脈但不行縮窄處理外，其余步驟與心衰模型組處理一致。參附治療組造模后第4周開(kāi)始每日1次，灌胃給藥［日劑量6.0 mL/（kg·d）］，共4周。

1.4 觀察指標(biāo) 1）超聲心動(dòng)圖檢測(cè)：大鼠以10%水合氯醛3 mL/kg，腹腔注射麻醉后備皮，應(yīng)用超聲工作站測(cè)定左室收縮期內(nèi)徑（LVDS）、舒張期內(nèi)徑（LVDd）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和短軸縮短率（FS）。2）血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：末次給藥后24 h后，采用10%水合氯醛（3 mg/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉。取大鼠頸前正中切口，經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管至左心室，連接BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)大鼠心功能。分別測(cè)定左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）以及左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dt max）及左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dt max）以及心率 （HR）。3）心肌SOD和心肌MDA含量測(cè)定：取心室部分，用0.9%氯化鈉注射液制備心臟勻漿，1500 r/min，離心10 min，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定心肌SOD含量，采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定心肌MDA含量。4）細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取出心臟，置冰上去除心耳心房，取左心室心尖部用于Western blotting檢測(cè)，得出目的蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中兩種變量存在一定的相關(guān)性，使用Pearson線性相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組超聲心動(dòng)指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。結(jié)果示，與假手術(shù)組比較，模型組LVDd、LVDS明顯增大，LVEF、FS明顯下降，BNP水平明顯升高（均P<0.05）；參附注射液治療后與模型組比較，各指標(biāo)均改善（均P<0.05）。

表1 各組LVDd、LVDS、LVEF、FS、BNP指標(biāo)比較（±s）

表1 各組LVDd、LVDS、LVEF、FS、BNP指標(biāo)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n LVDd（cm） LVDS（cm） LVEF（%）FS（%） BNP（pg/mL）術(shù)組 12心衰模型組 8 6.19±0.72 2.81±0.68 81.62±4.60 6.83±0.28*4.57±0.45*61.74±3.17*53.24±3.85 131.82±3.77 32.90±2.01*1088.39±199.21*參附治療組 106.65±0.42△3.33±0.49△71.30±3.24△41.02±2.63△305.28±123.01△

2.2 各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 見(jiàn)表2。結(jié)果示，與假手術(shù)組比較，模型組LVEDP明顯增大，LVSP下降，+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR明顯下降（均P<0.01）；參附注射液治療后與模型組比較，各指標(biāo)均恢復(fù)（均P< 0.01）。

表2 各組LVEDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR指標(biāo)比較（±s）

表2 各組LVEDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、HR指標(biāo)比較（±s）

組 別 n LVEDP（mmHg）LVSP（mmHg）+dp/dtmax（mmHg/s）dp/dtmax（mmHg/s） HR（bpm）假手術(shù)組 12心衰模型組 8 7.07±0.27 144.51±3.76 4523.00±368.27 26.20±1.66**105.99±3.09**2615.38±382.93**3875.25±156.26384.75±3.25 2074.38±160.03**423.88±3.00**參附治療組 1015.61±2.85△△123.65±5.59△△3625.30±365.49△△2968.5±172.94△△400.90±3.78△△

2.3 各組大鼠心肌SOD活性和MDA含量的影響及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)表3。結(jié)果示，與假手術(shù)組比較，心衰模型組心肌SOD活性明顯降低（P< 0.01），給予參附注射液處理后，心肌SOD活性明顯高于心衰模型組（P<0.01）；心衰模型組MDA含量明顯高于假手術(shù)組（P<0.01），參附注射液處理后，MDA含量明顯低于心衰模型組（P<0.01）。Bax蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，Bax/Bcl-2的比值明顯降低（P<0.01）。

表3 各組大鼠心肌SOD活性、MDA含量及、Bcl-2/Bax比較（±s）

表3 各組大鼠心肌SOD活性、MDA含量及、Bcl-2/Bax比較（±s）

組 別 n SOD（KU/L） MDA（μmol/mg） Bcl-2/Bax假手術(shù)組 12心衰模型組 8 140.37±7.84 4.48±1.26 1.58±0.20 80.89±6.65**15.99±2.44**0.45±0.65**參附治療組 10108.95±6.64△△11.59±2.35△△1.14±0.52△△

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2/Bax比值比較

2.4 Bcl-2/Bax與大鼠心肌SOD活性和MDA含量進(jìn)行直線回歸分析 結(jié)果示，SOD與Bcl-2/Bax線性相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.652，P<0.001），存在線性正相關(guān)關(guān)系；MDA與Bcl-2/Bax線性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r= -0.644，P<0.001），存在線性負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

CHF是各種因素引起的心肌損傷，進(jìn)而引起心肌結(jié)構(gòu)和功能改變，引發(fā)組織灌注量不足。CHF是各種心臟疾病的終末期表現(xiàn)，發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，死亡率高，已引起臨床高度關(guān)注［3-5］。

氧自由基可改變心臟結(jié)構(gòu)、導(dǎo)致心臟功能異常，促進(jìn)心衰的演變進(jìn)程［6-7］。近年來(lái)研究表明，心衰動(dòng)物模型中氧自由基顯著增多，抵抗被氧化的能力降低。當(dāng)氧自由基抵抗物質(zhì)活性下降或產(chǎn)生過(guò)度，將導(dǎo)致氧自由基沉積，進(jìn)而刺激細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)。MDA是自由基刺激細(xì)胞膜發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，SOD為代表的抗氧化酶系統(tǒng)可清除體內(nèi)自由基。CHF發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，心肌細(xì)胞減少或（和）剩余心肌收縮功能代償不足導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)異常和功能改變，原因可能是細(xì)胞凋亡。研究表明，抑制凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax水平高低關(guān)乎凋亡調(diào)控；有證據(jù)顯示受凋亡刺激后的細(xì)胞生存能力由Bcl-2/Bax決定，Bcl-2/Bax升高，提升細(xì)胞生存率，否則反之。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心衰模型組心肌MDA、SOD、凋亡蛋白Bcl-2/Bax發(fā)生顯著變化，與假手術(shù)組對(duì)照均有明顯差異，說(shuō)明氧化應(yīng)激可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞和功能異常，心力衰竭演變進(jìn)程中凋亡的程度明顯升高。相關(guān)性分析顯示由于氧化應(yīng)激加速了心肌細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，進(jìn)而引起心功能下降，導(dǎo)致心力衰竭。

CHF按其臨床表現(xiàn)可歸屬于中醫(yī)學(xué) “心悸”“胸痹”“脫證”范疇，其病理基礎(chǔ)為心氣陰虛。虛標(biāo)實(shí)證、心脾腎陽(yáng)虛，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)為瘀血、痰濁、水飲為標(biāo)，血脈瘀滯。參附注射液主要治療陽(yáng)虛所致的各種疾病，成分主要為人參皂苷和去甲烏頭堿，人參皂苷可改善心肌營(yíng)養(yǎng)代謝，提高心肌收縮力。烏頭堿則能顯著提高心臟功能［9-10］。有證據(jù)顯示參附注射液可抗氧化，去除氧自由基，降低細(xì)胞膜受到羥自由基的攻擊［11-12］，改善微小循環(huán)［13-14］。顧云等發(fā)現(xiàn)參附注射液可降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到維護(hù)心臟的效用［15］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用腹主動(dòng)脈部分縮窄方法誘導(dǎo)大鼠心功能的損害，并給予參附注射液抑制心肌損傷。結(jié)果表明與模型組比較，參附治療組SOD活性顯著升高，MDA含量、心肌凋亡蛋白Bcl-2/Bax顯著降低，說(shuō)明參附注射液能夠通過(guò)抗氧自由基損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡和心臟功能的損害，這關(guān)乎參附注射液強(qiáng)大的抵擋被氧化的功能，詳細(xì)機(jī)制有待后續(xù)探討。

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Effects of Shenfu Injection on Oxidative Stress and Apoptosis in Rats with Heart Failure

DENG Meng，GUO Li，ZHANG Li.First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Heilongjiang，Jiamusi 154002，China.

Objective：To investigate the effects of Shenfu Injection on oxidative stress and apoptosis in rats with heart failure.Methods：36 SD rats were randomly divided into three groups with 12 rats in each：the sham operation group，the heart failure model group and Shenfu treatment group.4 weeks after operation，the treatment group was given intragastric administration once a day daily dose：6.0 mL/（kg·d），for 4 weeks.The following data was detected：LVDS，LVDd，LVEF，F(xiàn)S，HR，LVSP，LVEDP，maximum rate of LVP，the content of the SOD and MAD and cardiac target protein.Results：Compared with the sham operation group，LVDd and LVDS of the model group increased obviously；LVEF and FS decreased obviously，and the level of BNP increased obviously（P< 0.05）.Compared with the model group，the indexes recovered after treatment of Shenfu Injection（P<0.05）.Compared with the sham operation group，LVEDP of the model group increased obviously；LVSP decreased，and+dp/ dt，Max，-dp/dt，Max and HR decreased obviously（P<0.01）.Compared with the model group，the indexes recovered after treatment of Shenfu Injection（P<0.01）.Compared with the sham operation group，the activity of SOD in the heart failure model group decreased obviously（P<0.01）.After treated with Shenfu Injection，the myocardial SOD activity was significantly higher than that in the heart failure model group（P<0.01）.The content of MDA in heart failure model group was significantly higher than that in sham operated group（P<0.01）.The content of MDA after the treatment of Shenfu Injection was lower than that in heart failure model group（P<0.01）.The expression of Bax protein was significantly decreased；the expression of Bcl-2 protein increased significantly，and theratio of Bax/Bcl-2 decreased significantly（P<0.01）.The linear correlation between SOD and Bcl-2/Bax was statistically significant（r=0.652，P<0.001），and linear positive correlation existed.Linearity of MDA and Bcl-2/Bax was statistically significant（r=-0.644，P<0.001），and linear negative correlation exists.Conclusion：Shenfu injection can decrease the level of oxidative stress，inhibit protein apoptosis，and thus improve cardiac function in heart failure rats and the mechanism may be related to the up-regulation of apoptosis inhibitory protein Bcl-2 and down-regulation of Pro apoptotic protein Bax.

Heart failure；Shenfu injection；Oxidative stress；Apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2017）08-1401-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.025

2017-05-03）

黑龍江省佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（YZ2016-024）

△通信作者（電子郵箱：332910182@qq.com）