膝痛方對(duì)木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型IL-1β、TNF-α、MMP-3的影響*

向文遠(yuǎn) 融 愷 郎 毅 陳平波 周瑜博

（新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830001）

膝痛方對(duì)木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型IL-1β、TNF-α、MMP-3的影響*

向文遠(yuǎn) 融 愷 郎 毅 陳平波 周瑜博△

（新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830001）

目的 觀察膝痛方對(duì)骨關(guān)節(jié)炎急發(fā)期動(dòng)物模型白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的調(diào)控作用。方法 28只新西蘭白兔隨機(jī)分為空白組、模型組、扶他林組、膝痛方組，各7只，于第1、4、7日向右膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射2%的木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合液0.5 mL（空白組除外）。末次注射7 d后開始治療。治療14 d后，測(cè)右膝局部皮溫，取右膝關(guān)節(jié)髕下脂肪墊組織處滑膜組織0.3 g，HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，ELISA測(cè)定滑膜勻漿IL-1β、TNF-α、MMP-3濃度。結(jié)果 模型組右膝局部皮溫略高于其他各組，但各組間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組滑膜增生明顯，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，IL-1β、TNF-α、MMP-3明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，膝痛方組及扶他林組滑膜增生較少，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，IL-1β、TNF-α、MMP-3降低（P＜0.05）；與扶他林組比較，膝痛方組IL-1β、TNF-α水平與之差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而MMP-3則低于扶他林組（P＜0.05）。結(jié)論 膝痛方及扶他林均具有抑制膝骨關(guān)節(jié)炎急性期滑膜炎癥反應(yīng)的作用，且這種作用可能是通過降低IL-1β、TNF-α、MMP-3而實(shí)現(xiàn)的。此外，膝痛方抑制MMP-3的作用優(yōu)于扶他林，提示膝痛方可能在遠(yuǎn)期抑制軟骨退變，延緩膝骨關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程方面具有潛在的療效，仍需進(jìn)一步研究。

膝痛方 膝骨關(guān)節(jié)炎 動(dòng)物模型 木瓜蛋白酶 MMP-3

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是一種退行性骨關(guān)節(jié)疾病，臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)及其附屬周圍軟組織疼痛、腫脹、壓痛，關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，甚至畸形，最終喪失關(guān)節(jié)功能［1-3］。KOA急性期以膝關(guān)節(jié)腫痛、功能障礙為主要癥狀，KOA關(guān)節(jié)周圍結(jié)構(gòu)改變誘發(fā)滑膜炎癥反應(yīng)［4］，滑膜急性炎癥進(jìn)而引起的炎性疼痛又會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致關(guān)節(jié)周圍結(jié)構(gòu)失穩(wěn)以及軟骨、韌帶的退行性改變，進(jìn)而加劇膝骨關(guān)節(jié)炎的病情［5］。因此在KOA急性期控制炎癥反應(yīng)，緩解關(guān)節(jié)疼痛，能從一定程度上控制KOA癥狀，延緩疾病的進(jìn)程。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為KOA急性期屬“痹證”“熱痹”范疇［6］。本院骨傷科在多年臨床實(shí)踐中總結(jié)并制定了治療KOA急性期的經(jīng)驗(yàn)方膝痛方，并在臨床的治療中取得了較好的療效。為進(jìn)一步探討該方對(duì)KOA急性期的作用，本研究參照文獻(xiàn)報(bào)道，以木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的急性期膝骨關(guān)節(jié)炎為模型，以末次注射1周后為治療切入時(shí)間點(diǎn)［7］，采用膝痛方治療，以抗炎止痛藥物扶他林為陽性對(duì)照，通過測(cè)量局部皮溫，觀察組織病理形態(tài)學(xué)改變，檢測(cè)滑膜組織白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）水平，對(duì)比分析以闡釋膝痛方治療KOA急性期的潛在作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 28只健康新西蘭大白兔，雌雄不限，平均兔齡5個(gè)月，平均體質(zhì)量（2.3±0.3）kg，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：11804800001704。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，觀察無全身疾患及異常后開始試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的 《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 試藥與儀器 膝痛方由生芪30 g，當(dāng)歸15 g，秦艽12 g，茜草9 g，川芎12 g，延胡索9 g，川萆薢12 g，防己12 g，土茯苓5 g，桑寄生12 g，川牛膝12 g，柴胡10 g，桂枝12 g，甘草3 g組成，統(tǒng)一由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院制劑室煎煮濃縮。扶他林（雙氯芬酸鈉緩釋片，75 mg，10片/盒），北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H10980297。木瓜蛋白酶（美國(guó)Sigma），L-半胱氨酸（美國(guó)Sigma），ELISA試劑盒（美國(guó)R&D），離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica DM1000），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-rad），紅外測(cè)溫儀（美國(guó)Fluke）等。

1.3 分組與造模 將28只兔子隨機(jī)分為空白組、模型組、膝痛方組及扶他林組，各7只。于實(shí)驗(yàn)開始第1、4、7日，將兔子固定后，剔除右膝關(guān)節(jié)局部兔毛，75%酒精消毒后，固定關(guān)節(jié)，以髕韌帶附著點(diǎn)外上方約0.5 cm處為進(jìn)針點(diǎn)。針頭從上前方向下后方傾斜刺入，以垂直方向推入，當(dāng)出現(xiàn)落空感時(shí)，回抽無血性液體，注入0.5 mL 2%的木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合液，活動(dòng)膝關(guān)節(jié)使混合液充分分布在關(guān)節(jié)內(nèi)，注射過程嚴(yán)格按照無菌操作要求［8］。

1.4 藥物治療 根據(jù)Meeh-Rubner公式［A（體表面積m2）=K（系數(shù)）×W（體質(zhì)量）2/3×10-4］計(jì)算用量。膝痛方組每只平均約17.70 g生藥，每只8 mL/d灌胃（每毫升含生藥2.21 g）；扶他林組每只平均約10.73 mg雙氯芬酸鈉，將扶他林溶解于0.9%氯化鈉注射液后，按每只8 mL/d灌胃（每毫升藥量為1.34 mg）；空白組、模型組灌以等同劑量的生理鹽水。灌胃開始時(shí)間均為末次注射木瓜蛋白酶后7 d，持續(xù)灌胃14 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 治療結(jié)束后，使用紅外測(cè)溫儀對(duì)兔膝關(guān)節(jié)正前方進(jìn)行皮溫測(cè)量。將紅外測(cè)溫儀探頭中心處對(duì)準(zhǔn)髕骨下緣，高度為1 cm，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。測(cè)量皮溫后，各組動(dòng)物均以空氣栓塞法處死，大體觀察右膝關(guān)節(jié)后，沿右膝前正中線切開皮膚，沿髕骨內(nèi)、外側(cè)緣切開關(guān)節(jié)囊，顯露膝關(guān)節(jié)，切取髕下脂肪墊處滑膜組織0.3 g。將滑膜組織用蒸餾水沖洗后，一份迅速放入10%中性甲醛溶液中固定，用于病理組織觀察；一份投入液氮中臨時(shí)保存，再放入-80℃冰箱保存，ELISA檢測(cè)備用。

1.6 病理組織學(xué)觀察 滑膜組織經(jīng)甲醛固定24 h，洗凈后，梯度酒精（由50%到100%）脫水，二甲苯溶液透明約1 h，石蠟包埋切片。將切片放入蘇木精染色液10 min，自來水水洗后，放入70%酒精配制的1%鹽酸溶液中處理5 s左右，再放入1%氨水中藍(lán)化10 min。隨后，將切片放入0.5%的伊紅中染色2 min左右，迅速水洗；最后，將切片放入由低到高的梯度酒精中逐級(jí)脫水，再放入二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）溶液中各10 min，用中性樹膠進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.7 ELISA法測(cè)IL-1β、TNF-α、MMP-3濃度 將滑膜組織從-80℃冰箱取出，解凍后加適量PBS液，搗碎勻漿，3000 r/min離心10 min后取上清液檢測(cè)。按照ELISA試劑盒說明書，配置試劑標(biāo)準(zhǔn)品，按順序加入標(biāo)準(zhǔn)品及被測(cè)樣品各50 μL于空白孔中，每組各設(shè)置3復(fù)孔，避光室溫孵育2 h；將標(biāo)準(zhǔn)品及樣品倒出，每孔加清洗緩沖液400 μL，輕搖均勻后倒出緩沖液，反復(fù)5遍，每次清洗5 min左右，每次清洗過后在濾紙上甩干；每孔加100 μL結(jié)合液，避光室溫孵育2 h后，重復(fù)上述洗滌過程；每孔加100 μL基底結(jié)合液，避光室溫孵育30 min；各孔加100 μL終止液，搖均勻，30 min內(nèi)檢測(cè)；使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)450 nm處讀吸光度值數(shù)（OD值）；統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度與標(biāo)準(zhǔn)品OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-1β、TNF-α、MMP-3濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。計(jì)量資料滿足正態(tài)性及方差齊性，采用單因素方差分析，否則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物基本情況 在實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物生長(zhǎng)良好，模型組開始造模后第7日，1只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉并飲食減少，于3 d后死亡。造模開始后，除空白組外其余各組在注射木瓜蛋白酶后當(dāng)天飲食量和運(yùn)動(dòng)量減少，并于1～2 d后飲食逐漸恢復(fù)正常。

2.2 大體觀察 見圖1?？瞻捉M右膝關(guān)節(jié)正常，無關(guān)節(jié)積液及滑膜增厚等；模型組膝關(guān)節(jié)較健側(cè)腫脹明顯，皮膚顏色偏紅，關(guān)節(jié)內(nèi)可見少量關(guān)節(jié)積液，滑膜增厚明顯，滑膜表面毛細(xì)血管增生較多。膝痛方組及扶他林組右膝關(guān)節(jié)腫脹不明顯，皮膚顏色正常，皮溫稍高，關(guān)節(jié)內(nèi)無明顯積液，滑膜增厚顯呈暗紅色。

圖1 滑膜組織大體觀察

2.3 各組右膝部皮溫比較 見表1。模型組皮溫總體略高于其他各組，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能與皮膚溫度相對(duì)較為穩(wěn)定，波動(dòng)范圍較小有關(guān)。同時(shí)，膝痛方組與扶他林組比較，皮溫均低于模型組，但二者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組治療前后兔膝關(guān)節(jié)局部皮溫比較（℃，±s）

表1 各組治療前后兔膝關(guān)節(jié)局部皮溫比較（℃，±s）

組別 n 皮溫空白組 7模型組 6膝痛方組 7 39.19±0.29 40.16±0.37 39.38±0.28扶他林組 739.27±0.21

2.4 各組IL-1β、TNF-α、MMP-3水平比較 見表2。與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α、MMP-3水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，膝痛方組及扶他林組IL-1β、TNF-α、MMP-3水平降低（P＜0.05）；與扶他林組比較，膝痛方組IL-1β、TNF-α水平與之無明顯差異（P＞0.05），而MMP-3則低于扶他林組（P＜0.05）。

表2 各組IL-1β、TNF-α、MMP-3水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組IL-1β、TNF-α、MMP-3水平比較（pg/mL，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與扶他林組比較，△P＜0.05。

組別 n IL-1β TNF-α MMP-3空白組 7模型組 6膝痛方組 7 103.15±5.78*115.29±4.69*42.78±4.59*191.76±6.53 185.76±8.25 103.16±7.12 156.42±10.69*142.68±10.17*63.56±9.83*△扶他林組 7153.71±9.48*139.43±9.43*74.13±7.69*

2.5 組織病理學(xué)觀察 見圖2。HE染色顯示：空白組滑膜組織正常，無增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組滑膜組織增生明顯，達(dá)5～6層，細(xì)胞間及滑膜外層見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，間質(zhì)纖維組織增生明顯。膝痛方組及扶他林組滑膜組織增生，達(dá)2～3層，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)纖維組織增生明顯。

圖2 滑膜組織病理學(xué)觀察（HE染色，400倍）

3 討 論

膝關(guān)節(jié)是人體最大和最為復(fù)雜的關(guān)節(jié)，具有特殊的解剖特點(diǎn)及應(yīng)力載荷，因此KOA是骨關(guān)節(jié)炎中最為常見的一種退變性骨關(guān)節(jié)炎性疾病。一般認(rèn)為，KOA是多個(gè)具有相似生理學(xué)、形態(tài)學(xué)及臨床結(jié)局的關(guān)節(jié)內(nèi)疾病的總和，包括關(guān)節(jié)軟骨退變，軟骨下骨硬化，軟骨下骨囊性變，反復(fù)發(fā)作的滑膜慢性炎癥反應(yīng)及韌帶、關(guān)節(jié)囊、半月板的退行性改變等［9-10］。在KOA急發(fā)期，關(guān)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生大量骨與軟骨的降解產(chǎn)物，這些產(chǎn)物一旦進(jìn)入滑液，將刺激臨近的滑膜組織并引發(fā)滑膜炎性反應(yīng)，滑膜巨噬細(xì)胞分泌增多，關(guān)節(jié)腔內(nèi)大量炎性因子聚集，如IL-1β、TNF-α等，加重軟骨細(xì)胞的代謝紊亂，同時(shí)炎性因子的聚集使滑膜巨噬細(xì)胞及軟骨細(xì)胞大量分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），加劇軟骨基質(zhì)的降解，使軟骨的形態(tài)和生理功能發(fā)生明顯的改變，進(jìn)一步導(dǎo)致關(guān)節(jié)周圍結(jié)構(gòu)失穩(wěn)以及軟骨、韌帶的退行性改變，加速KOA的病理進(jìn)程［4-5，13-15］?？梢娀ぱ装Y反應(yīng)是KOA急性期的重要病理改變。如果在KOA急性期能及時(shí)控制滑膜的炎癥反應(yīng)，將對(duì)穩(wěn)定KOA癥狀，延緩其疾病進(jìn)程具有重要的臨床意義。

目前中醫(yī)學(xué)認(rèn)為膝骨關(guān)節(jié)炎急發(fā)期多以 “水濕”“熱毒”和“血瘀”為主，治療多以除濕止痛、清熱解毒、活血化瘀為主，但膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的內(nèi)在根本在于肝腎的虛衰，因此在治療各期的膝骨關(guān)節(jié)炎是都應(yīng)輔以調(diào)補(bǔ)肝腎以治其本。膝痛方是本院骨科在臨床實(shí)踐中總結(jié)并提出的針對(duì)KOA急性期的驗(yàn)方，在臨床治療中取得了較好的療效。全方由黃芪、當(dāng)歸、秦艽、茜草、川芎、延胡索、川萆薢、防己、土茯苓、桑寄生、川牛膝、柴胡、桂枝、甘草組成。方中以黃芪、當(dāng)歸為君，補(bǔ)氣血，和營(yíng)衛(wèi)，使氣機(jī)通暢，瘀毒消散；同時(shí)臣以茜草、川芎、萆薢等藥，助君藥化濕散瘀、活血行氣、通絡(luò)止痛；此外佐以桑寄生、牛膝以通經(jīng)活血、補(bǔ)益肝腎，以治其本；同時(shí)桂枝溫通經(jīng)脈，佐制藥物寒涼之性。諸藥合用，使氣血調(diào)暢，濕熱得清，瘀毒得化，肝腎得補(bǔ)，標(biāo)本兼治。

大量實(shí)驗(yàn)研究表明，中藥復(fù)方治療骨關(guān)節(jié)炎疾病的機(jī)制主要包括三個(gè)方面。其一，下調(diào)軟骨基質(zhì)降解酶的表達(dá)，減輕其對(duì)軟骨基質(zhì)成分的降解作用；其二，下調(diào)包括促炎性因子在內(nèi)的多種細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，進(jìn)而減輕細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及軟骨代謝紊亂；其三，減少軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，增加軟骨細(xì)胞膠原蛋白、蛋白聚糖的表達(dá)。本研究選用木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的兔膝骨關(guān)節(jié)炎為疾病模型，并參照文獻(xiàn)，以炎性反應(yīng)最為明顯的造模開始后2周為治療切入點(diǎn)。選用扶他林為陽性藥物對(duì)照，通過對(duì)形態(tài)學(xué)及細(xì)胞因子水平的觀察對(duì)比，筆者發(fā)現(xiàn)膝痛方及扶他林能有效減輕KOA急性期膝關(guān)節(jié)的紅腫情況，且組織病理學(xué)觀察顯示，膝痛方及扶他林均能抑制滑膜組織的增生及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，有效控制滑膜炎癥反應(yīng)。此外，膝痛方及扶他林均能降低滑膜IL-1β、TNF-α、MMP-3等細(xì)胞因子的水平，說明二者可能是通過抑制IL-1β、TNF-α等前炎性因子起到控制滑膜炎癥反應(yīng)的，同時(shí)，二者對(duì)MMP-3的調(diào)控作用，說明膝痛方及扶他林能通過抑制MMP-3的水平進(jìn)而緩解軟骨基質(zhì)的降解，對(duì)軟骨起到一定的保護(hù)作用。值得注意的是，膝痛方治療后，滑膜組織中MMP-3的水平降低更為明顯，這提示膝痛方可能在遠(yuǎn)期抑制軟骨退變，延緩膝骨關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程方面具有潛在的療效，但仍需進(jìn)一步研究。

綜之，通過本研究，筆者認(rèn)為膝痛方能通過抑制IL-1β、TNF-α等前炎性因子進(jìn)而控制膝骨關(guān)節(jié)炎急性期滑膜炎性反應(yīng)，且膝痛方也可以降低滑膜細(xì)胞分泌MMP-3的水平，對(duì)軟骨細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，值得進(jìn)一步的研究和推廣運(yùn)用。

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Effect of Xitong Decoction on the Expression of IL-1β，TNF-α and MMP-3 in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis Induced by Papain

XIANG Wenyuan，RONG Kai，LANG Yi，et al. Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Xinjiang，Urumqi，830001，China.

Objective：To investigate the effect of Xitong Decoction on the expression of IL-1 beta，TNF-alpha and MMP-3 in the acute phase of osteoarthritis model.Methods：28 New Zealand white rabbits were randomly divided into the control group，the model group，Voltaren group，Xitong Decoction group，with 7 rats in each.At different time of the experiment（1st/4th/7th day），0.5 mL mixture composed of 2%papain and 0.03 mL-cysteine were injected into the right knee of rabbits.7 days after the end of the intra-articular injection，the treatment started.2 weeks after the treatment，local skin temperature of knee was recorded.Meanwhile，the synovium and infrapatellar fat pad separated from right knees were obtained for histopathological observation and enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：In the model group，the local skin temperature of the right knee was slightly higher than that of the other groups，but there was no significant difference between the groups（P>0.05）. Compared with the control group，synovial hyperplasia was obvious and inflammatory cells were infiltrating in the model group.The levels of IL-1，TNF-α，and MMP-3 increased significantly（P<0.05）.Compared with，there was no significant difference in the level of IL-1 beta and TNF-alpha between Votalin group and Xitong Decoction group（P>0.05），but MMP-3 in Xitong Decoction group was lower than that of Votalin group（P<0.05）.Conclusion：Xitong Decoction and Votalin both can inhibit the inflammatory reaction of synovium in acute phase of knee osteoarthritis，and this effect may be achieved by lowering IL-1 beta，TNF-alpha and MMP-3.In addition，the inhibition of MMP-3 of Xitong Decoction is better than that of Votalin，but it may have a potential therapeutic effect on the long-term inhibition of cartilage degeneration and delaying the pathological process of knee osteoarthritis，but it still needs further study.

Xitong Decoction；Knee osteoarthritis；Animal model；Papain；MMP-3

R285.5

A

1004-745X（2017）08-1343-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.009

2017-04-10）

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳科研課題（201433110）

△通信作者（電子郵箱：18553354680@163.com）