清火梔麥片中穿心蓮含量測定的提取條件優(yōu)化

楊超君+王笑笑+黃蕓

[摘要] 目的 依據(jù)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的穩(wěn)定性機理，結(jié)合清火梔麥片的制法，以君藥穿心蓮主要成分穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯為指標(biāo)，優(yōu)化HPLC法測定清火梔麥片中穿心蓮含量的提取條件。 方法 分析比較不同提取溶劑、提取方法、提取時間及提取溫度對HPLC法測定穿心蓮含量結(jié)果的影響。 結(jié)果 與其他提取溶劑相比，甲醇對穿心蓮的提取效率較高，且提取液的雜質(zhì)含量更低；提取中超聲前是否冷浸、加冰或常溫對檢測結(jié)果影響不大；提取時超聲1 h較超聲30 min的提取效果更好；而在低溫時，隨著溫度的上升有助于主要成分的提取，但當(dāng)溫度超過60℃時發(fā)生降解。 結(jié)論 以甲醇為溶媒，常溫超聲1 h時提取純度和提取效率較優(yōu)。

[關(guān)鍵詞] 清火梔麥片；穿心蓮內(nèi)酯；脫水穿心蓮內(nèi)酯；甲醇；超聲

[中圖分類號] R284 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）22-0039-04

[Abstract] Objective To optimize the extraction conditions of HPLC for the determination of andrographis paniculata in Qinghuo Zhimai tablets， based on the stability mechanism of andrographolide and dehydroandrographolide combined with the preparation method of Qinghuo Zhimai tablets， with the indicator of the main ingredient of herbs andrographis including andrographolide and dehydrated andrographolide. Methods The effects of different extraction solvents， extraction methods， extraction time and extraction temperature on the determination of andrographis paniculata by HPLC were analyzed and compared. Results Compared with other extraction solvents， the extraction efficiency of methanol to andrographis paniculata was higher， and the impurity content of the extract was lower. Whether cold dip， adding ice，room temperature or not had little effect on the detection result. The extraction effect of ultrasound for 1 h was better than that of ultrasound for 30 min. While at low temperature， the increase of temperature was helpful to the extraction of the main components， but the degradation occurred when the temperature exceeded 60℃. Conclusion The extraction purity and extraction efficiency were better when using methanol as the solvent at room temperature for 1 h.

[Key words] Qinghuo Zhimai tablets； Andrographolide； Dehydroandrographolide； Methanol； Ultrasound

清火梔麥片是由穿心蓮、梔子和麥冬三味藥組成，取部分穿心蓮和麥冬粉碎成細(xì)粉、剩余穿心蓮和梔子經(jīng)水煎煮、濃縮成稠膏，最后加入細(xì)粉混勻壓制而成的具有清熱解毒、涼血消腫功效的中藥片劑[1]。其主要成分穿心蓮又名一見喜、苦草、四方草、印度草等，為爵床科植物的干燥地上部分。味苦、性寒，歸心、肺、大腸、膀胱經(jīng)?！度荼静荨酚涊d其有“清熱解毒、消炎退腫，治療咽喉炎、痢疾、高熱等功效”，為清熱解毒類常用中草藥，素有“中藥抗生素”的美譽[2，3]。故現(xiàn)清火梔麥片常用于臨床咽喉腫痛、急性扁桃體炎、發(fā)熱、頭痛、牙痛、目赤、心火旺盛、睡眠不佳等癥狀的患者。

隨著清火梔麥片的臨床應(yīng)用，有關(guān)其分析方法的研究也日益增多。早年其有效成分的測定方法有比色法、重量法等[3]，近年多以薄層掃描法[4，5]、高效液相色譜法（HPLC）等為主[6-9]，此外隨著檢測技術(shù)的發(fā)展新型色譜法以及質(zhì)譜法等也用于其測定[10， 11]。但因HPLC法專屬性強、靈敏度高，含量測定準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好等優(yōu)點，HPLC法測定清火梔麥片有效成分的方法研究較多。其檢測多用紫外可見檢測器、二極管陣列檢測器等[3，12，13]，且隨著分析方法的進一步探索可同時準(zhǔn)確測定2～3種有效成分[14-18]。故本文主要是依據(jù)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的穩(wěn)定性機理，從提取方式、提取溶媒以及熱穩(wěn)定性的角度出發(fā)研究清火梔麥片中穿心蓮含量測定的影響因素?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀，DAD檢測器；UPT-Ⅱ-10T型制水器，成都超純科技有限公司；Mettler XS-205型電子天平；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，工作頻率40 kHz，功率200 W，昆山市超聲儀器有限公司。endprint

1.2 樣品與試劑

清火梔麥片，批號：140505，廣西圣特藥業(yè)有限公司；批號120601，廣西金海堂藥業(yè)有限責(zé)任公司；批號：110208，廣西圣特藥業(yè)有限公司；穿心蓮內(nèi)酯，批號0797-200106，含量100%，經(jīng)五氧化二磷減壓干燥處理12 h以上，中檢院提供；脫水穿心蓮內(nèi)酯，批號0854-200204，含量100%，經(jīng)五氧化二磷減壓干燥處理12 h 以上，中檢院提供；除流動相用甲醇為色譜純，其余均為分析純。

2含量測定

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB C-18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：甲醇-水（55∶45），流速：1 mL/min；檢測波長：穿心蓮內(nèi)酯230 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯250 nm；進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取穿心蓮內(nèi)酯19.19 mg和脫水穿心蓮內(nèi)酯15.86 mg制成每1 mL各含38.38 μg和31.72 μg的混合對照品溶液。

2.3含量測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.4提取溶劑的考察

查《中國藥典》（2015年版）穿心蓮藥材、穿心蓮片和清火梔麥片含量測定的提取溶劑，再結(jié)合蔡松濤等[19]對穿心蓮片中含量測定提取溶劑的考察結(jié)果，本文在其研究基礎(chǔ)上分析比較甲醇、70%甲醇與乙醇的提取效率，結(jié)果與蔡松濤等[19]的研究一致：甲醇對穿心蓮的提取效率最高，且提取液的雜質(zhì)含量更低。（1.6805 mg/片>1.5085 mg/片）。

2.5 提取方法與時間的考察

設(shè)定超聲提取30 min[1]、超聲提取1 h；加冰超聲提取30 min、45 min和1 h；先冷浸1 h再超聲提取1 h及回流提取1 h[20]作為考察對象。方法：取同批清火梔麥片（140505）20片，去糖衣，稱總重，研細(xì)，取細(xì)粉約0.3 g，精密稱定，再精密加入甲醇50 mL，稱定重量，按上述各種方式提取，放冷，用甲醇補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按2.3測定。見封三圖5、表1。

2.6 提取溫度的考察

多個文獻報道[21-23]，穿心蓮主要成分穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對熱不穩(wěn)定。特別是在高熱[24]（90℃、100℃、110℃、120℃）的情況下，隨著溫度的升高，兩者的降解速度加??；其中穿心蓮內(nèi)酯隨著溫度的升高轉(zhuǎn)化率降低，幾乎以降解為主，脫水穿心蓮內(nèi)酯的降解速度隨溫度升高快于穿心蓮內(nèi)酯。結(jié)合文獻，本人比較了加冰超聲、常溫超聲（不設(shè)置溫度，水溫會隨超聲時間的延長而升高）、40℃、50℃、60℃和70℃恒溫超聲提取1 h的提取效果。方法：取同批清火梔麥片（140505）細(xì)粉約0.3 g，精密稱定，再精密加入甲醇50 mL，稱定重量，按上述各種方式提取，放冷，用甲醇補足減失重量，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按2.3測定。見圖1、表1。

3討論

《中國藥典》（2015年版）新標(biāo)準(zhǔn)是在2010年版藥典和蘇建等[21]對清火梔麥膠囊HPLC特征圖譜的建立和3種成分測定的基礎(chǔ)上建立的新標(biāo)準(zhǔn)，其含量提取方法將提取溶劑更換為70%甲醇，超聲功率從原來的250 W，33 kHz更改為250 W，40 kHz，物料比和超聲時間30 min不變。本次實驗對提取條件的考察是在2015年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進行改進，期望通過優(yōu)化提取條件，進一步提高測定的準(zhǔn)確性。

一些研究發(fā)現(xiàn)，清火梔麥片中穿心蓮主要成分含量隨著貯藏時間的延長逐漸降低。而清火梔麥片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量變化的考察結(jié)果[22]也顯示，清火梔麥片在溫度（40.0±2.0）℃，相對濕度為（75.0±5.0）% 條件下6個月后，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量都發(fā)生了變化。其中穿心蓮內(nèi)酯含量隨著時間相應(yīng)降低，而脫水穿心蓮內(nèi)酯含量則隨著放置時間的延長先增加而后趨于平緩，但其增加的量與穿心蓮內(nèi)酯降解的量并不成正比，提示在高溫下，穿心蓮內(nèi)酯可能一部分轉(zhuǎn)換成脫水穿心蓮內(nèi)酯。此外，一項分析穿心蓮片中穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯變異因素的試驗[21]提出，采用新鮮的穿心蓮藥材，減少藥典工藝中的加熱時間和溫度等影響因素，是提高穿心蓮片質(zhì)量的有效途徑。而清火梔麥片中的有效成分亦為穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯，故可推測加熱時間和溫度可以影響其含量測定。而以上結(jié)果均提示清火梔麥片中的有效成分存在不穩(wěn)定性，即提取條件可能影響其測定的準(zhǔn)確性。但因清火梔麥片中穿心蓮主成分的不穩(wěn)定性，其提取條件可能影響HPLC法的測定。如顏玉貞[22]報道，穿心蓮中的主成分穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯不穩(wěn)定，隨貯藏時間的延長部分穿心蓮內(nèi)酯會轉(zhuǎn)化為脫水穿心蓮內(nèi)酯；曾慧芳等[20]報道，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯在雜質(zhì)較少的狀態(tài)下相對較穩(wěn)定，在高溫加熱狀態(tài)下穿心蓮內(nèi)酯以降解為主，轉(zhuǎn)化為輔；另有何詠梅[21]采用初均速法研究清火梔麥片中梔子苷的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)梔子苷在25℃下降解10%的時間為1.62年；黃竹英等[18]采用加速穩(wěn)定性試驗法研究清火梔麥片的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)放置6 個月之后梔子苷含量無顯著差異，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量則均下降，并指出清火梔麥片不適宜存放于高溫高濕環(huán)境。

故本文結(jié)合相關(guān)實驗研究，通過對提取溶劑、提取方法、提取時間以及提取溫度的比較，對清火梔麥片中穿心蓮含量測定的提取條件進行優(yōu)化。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，HPLC法測定清火梔麥片中穿心蓮含量時的提取溶劑包括乙醇、70%乙醇、50%乙醇和甲醇等[4-8]，而周國兒等[6]研究顯示70%乙醇較50%乙醇提取效果好，故我們選擇乙醇、70%乙醇和甲醇作為提取溶劑分別試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇對穿心蓮的提取效率最高，且提取液的雜質(zhì)含量更低。而后我們綜合以往研究中的不同提取方法[4-8]，選擇比較超聲提取、先冷浸再超聲提取和加熱回流提取三種不同提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先冷浸再超聲較直接超聲的提取效率稍高，但無顯著差異；而加熱回流提取的效率較超聲和先浸再超法顯著降低，故穿心蓮的提取選擇直接超聲法即可。但不同提取方法時（冷超和熱超），超聲提取1 h的效率均較30 min好，故提取1 h的時間可能更為合理。穿心蓮的穩(wěn)定性試驗結(jié)果[19-22，24]提示，穿心蓮主要成分對熱不穩(wěn)定，特別是在高熱時會隨著溫度的升高加速降解。故我們比較了加冰、常溫、40℃、50℃、60℃和70℃等不同溫度下超聲1h的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加冰和常溫超聲的提取效果較好，在低溫（<60℃）的情況下，隨著溫度的上升有助于主要成分的提取，但當(dāng)溫度超過60℃時提取效率降低。提示提取溫度過高時清火梔麥片主要成分可能發(fā)生降解，且該結(jié)果可能提示了穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯熱降解動力學(xué)的溫度拐點。endprint

綜上，甲醇常溫超聲1 h為清火梔麥片中穿心蓮含量測定的合適提取條件。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1535.

[2] 賀奮義.穿心蓮內(nèi)酯提取方法及其藥理作用研究進展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2010，29（5）： 27-29.

[3] 徐志勇，劉啟德. 穿心蓮及其制劑中有效成分分析方法的研究進展[J]. 廣東藥學(xué)， 2003，13（6）：39-41.

[4] 徐東來，陳紅軍. 薄層掃描法測定清火梔麥片中脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2001，2（1）：37-39.

[5] 周繼斌. 薄層掃描測定清火梔麥膠囊脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 海峽藥學(xué)，2000，12（1）：55-56.

[6] 周國兒，李彬. HPLC法測定清火梔麥膠囊中脫水穿心蓮內(nèi)酯[J]. 中草藥，2006，37（8）：1186-1187.

[7] 李軍依. 清火梔麥膠囊中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測定[J]. 中國藥業(yè)， 2008，17（12）：39-40.

[8] 王文忠，楊葳，馬占新，等. HPLC法測定清火梔麥口服液中脫水穿心蓮內(nèi)酯和梔子苷含量[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，4（9）：633-635.

[9] 蘇建，劉永利. 清火梔麥膠囊HPLC特征圖譜的建立和3種成分的測定[J]. 中成藥，2016，38（4）：810-815.

[10] 李成平，朱硯屏，高捷，等. 生物分配膠束色譜法同時測定清火梔麥片中3種有效成分[J]. 藥物分析雜志，2016，（5）：816-820.

[11] 張加余，喬延江，高曉燕，等. 清火梔麥片中化學(xué)成分的SPE-HPLC-ESI- MS n快速識別與鑒定[J]. 中國中藥雜志，2013，38（02）：186-192.

[12] 鄒盛勤，陳小玲. 反相高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器法測定清火梔麥片中梔子苷的含量[J]. 生命科學(xué)儀器，2008，6（5）：52-54.

[13] 郭炎榮，路玫. SPE-HPLC法測定清火梔麥片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2008，14（8）：17-19.

[14] 郭敏，鐘保恒，李可林. HPLC法同時測定清火梔麥膠囊中脫水穿心蓮內(nèi)酯和梔子苷的含量[J]. 藥物分析雜志，2008，（11）：1921-1923.

[15] 顏軍，茍小軍，鄔曉勇，等. HPLC法測定穿心蓮中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（8）：3576-3577.

[16] 陳深. HPLC法測定清火梔麥片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 海峽藥學(xué)，2008，20（7）：75-77.

[17] 藍曉玉，林華. HPLC法同時測定清火梔麥片中3種有效成分的含量[J]. 藥物分析雜志，2011，（2）：228-230.

[18] 黃竹英，李淑如，覃仁安.清火梔麥片的穩(wěn)定性研究[J].藥學(xué)研究，2015，34（5）：285-288 .

[19] 蔡松濤，陳向紅，馬琳，等.影響穿心蓮片中穿心蓮、內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測定的因素[J]. 中成藥，2005， 27（3）：361-362.

[20] 曾惠芳，黃曉丹，蘇子仁，等.試析穿心蓮片中穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯的變異因素[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2006，17（4）：299-302.

[21] 何詠梅，陳燕軍.清火梔麥片的穩(wěn)定性研究[J].中南藥學(xué)，2003，1（1）：28-29.

[22] 顏玉貞、謝培山.穿心蓮質(zhì)量控制的再評價[J].中藥新藥與臨床藥理，1998，9（4）：204-206.

[23] 黃曉丹，蘇子仁，賴小平，等.穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮SFE-CO2萃取物的熱降解動力學(xué)[J].中藥新藥與臨床藥理，2003，14（1）：53-56.

[24] 蘇建，劉永利.清火梔麥膠囊HPLC特征圖譜的建立和3種成分的測定[J].中成藥，2016，38（4）：810-815.

（收稿日期：2017-04-21）endprint