氧化苦參堿對(duì)小鼠哮喘模型保護(hù)作用的初步研究

蘭露莎, 趙兵兵, 楊紅宇, 羅 紅, 江 滟(貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 貴陽 550004)

氧化苦參堿對(duì)小鼠哮喘模型保護(hù)作用的初步研究

蘭露莎, 趙兵兵, 楊紅宇, 羅 紅, 江 滟(貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 貴陽 550004)

目的 初步探討氧化苦參堿(OMT)對(duì)哮喘小鼠的保護(hù)作用。方法 用Al(OH)3和卵清白蛋白誘發(fā)BALB/c小鼠過敏性哮喘，每日觀察小鼠一般情況和體質(zhì)量變化。哮喘模型建立后，予OMT或地塞米松進(jìn)行治療，分別在治療后5 d、15 d處死部分小鼠，留存肺組織和支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行檢測。將留存的肺組織行HE染色觀察其病理變化，BALF預(yù)處理后瑞氏染色行細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果 OMT介入可改善哮喘小鼠體質(zhì)量降低，在治療后5 d和15 d時(shí)，各治療組肺組織亦出現(xiàn)與哮喘模型組相似的病理變化，但炎性細(xì)胞或嗜酸細(xì)胞浸潤不同程度減少。OMT的各治療組與哮喘模型組比較，BALF中的細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論 氧化苦參堿對(duì)哮喘小鼠具有治療作用。

氧化苦參堿(OMT); 哮喘; 病理變化; 保護(hù)作用; 小鼠

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細(xì)胞, 包括炎性細(xì)胞、氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥[1]。反復(fù)發(fā)作可引起氣道重塑, 導(dǎo)致不可逆氣流受限，其原因與氣道慢性炎癥間接引起氣道壁結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，被稱為是哮喘的一個(gè)重要特征[2]。目前對(duì)于哮喘的治療仍以糖皮質(zhì)激素為主，但副作用較大。尚缺乏療效滿意且副作用小的抑制氣道炎癥及抗氣道高反應(yīng)性藥物[3]。氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)又名苦參素，是從豆科屬植物苦參或平科植物廣豆根中分離出來的生物堿。OMT具有調(diào)節(jié)免疫、抗病原體、抗炎性反應(yīng)等廣泛的藥理作用[4]，并被臨床證實(shí)具有一定的抑制氣道炎癥及抗氣道高反應(yīng)性作用，但機(jī)制不詳。因此，本文通過OMT對(duì)建立的小鼠哮喘模型的介入初步探討OMT防治支氣管哮喘的治療作用。為拓寬OMT在臨床治療哮喘疾病的應(yīng)用，以及開發(fā)該藥的新用途提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，并為進(jìn)一步探明OMT的作用及其作用機(jī)制等提供良好的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，54只，4～6周齡，體質(zhì)量18～24 g，購自貴州省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程中心[SCXK(黔)2012-001]，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)[SYXK(黔)2012-001]。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% Al(HO)3凝膠佐劑(Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant)，購自美國InvivoGen公司，10 mg/mL(Cat. Code： vac-alu-250, Lot #5113,Expiry date, Mar. 2017); 卵清白蛋白(Albumin from chicken egg white, OVA)，購自美國Sigma公司,A5378-1G(Lot #SLBD2313V, PCode 1001988500,CAS 9006-59-1); 注射用地塞米松磷酸鈉，購自馬鞍山豐原制藥有限公司, 5 mg/支, 批號(hào)150512-1。用無菌蒸餾水溶解稀釋; 藥物： OMT，購自中國藥品生物檢定所，為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，批號(hào)110780-201007; 蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司，C0105; 瑞氏染液購自北京索萊寶公司，G8220。小動(dòng)物屏障系統(tǒng)和IVC籠具(FRI-42)，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司; 醫(yī)用霧化器(402B)江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司; 倒置顯微鏡(CKX41)日本Olympus公司。

1.3 小鼠哮喘模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)[5]方法并予以改進(jìn)建立哮喘模型： 實(shí)驗(yàn)1 d、8 d、15 d腹腔注射OVA及Al(HO)3凝膠混合液 0.2 mL(內(nèi)含 OVA 60 μg 及 2.25 mg Al(HO)3凝膠)致敏; 實(shí)驗(yàn)21 d開始用5% OVA溶液8 mL行超聲霧化，每次30 min, 連續(xù)霧化5 d進(jìn)行激發(fā)。通過觀察小鼠是否出現(xiàn)煩躁、呼吸急促、抽搐及口唇紫紺等癥狀，支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)和肺組織病理變化情況，以驗(yàn)證建模是否成功。

1.4 OMT治療哮喘小鼠的實(shí)驗(yàn)分組

54只小鼠隨機(jī)分為6組，每組9只： ①正常對(duì)照組(CON), 用生理鹽水代替OVA進(jìn)行致敏和霧化,不給藥; ②哮喘模型組(AST)，按上述方法進(jìn)行致敏和激發(fā), 不給藥; ③治療對(duì)照組(TRE), 按上述方法進(jìn)行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg); ④OMT高劑量組(OMT-H)、中劑量組(OMT-M)和低劑量組(OMT-L), 按上述方法進(jìn)行致敏和激發(fā), 于每次激發(fā)前30 min分別腹腔注射OMT 25 mg/kg、12.5 mg/kg和6.25 mg/kg。于治療后5 d每組處死小鼠3只，同時(shí)①摘眼球取血并制備血清凍存于-20 ℃; ②從氣管注射無菌生理鹽水 0.5 mL入肺，抽吸3次后將抽出液體即BALF凍存于-20 ℃; ③稱小鼠體質(zhì)量并記錄; ④取右下肺葉置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定; ⑤余下肺組織凍存于-80 ℃。各組小鼠不再激發(fā)，隔日給予相應(yīng)藥物1次，持續(xù)5次后，處死小鼠，留存標(biāo)本及相應(yīng)檢查同前。

1.5 BALF 細(xì)胞計(jì)數(shù)

取150 μL BALF細(xì)胞懸液與細(xì)胞計(jì)數(shù)液按1∶1稀釋混勻，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，余下BALF在4 ℃、以2 000 r/min離心10 min，取沉淀物涂片，瑞氏染色后在顯微鏡下觀察，每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共觀察10個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.6 肺組織切片HE染色觀察

質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定24 h后的肺組織按常規(guī)病理學(xué)方法進(jìn)行石蠟包埋、切片及HE 染色，顯微鏡下觀察并留存圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況及體質(zhì)量觀察

每日觀察小鼠一般情況，并稱各組小鼠的體質(zhì)量。在致敏階段，各組小鼠一般情況均好，無明顯差別。開始激發(fā)后，AST、TRE、OMT-H OMT-M和OMT-L組小鼠均出現(xiàn)煩躁、精神萎靡進(jìn)食減少、腹肌抽搐和口唇發(fā)紺等變化，各組間無明顯差異。AST組小鼠體質(zhì)量較CON組下降其他治療組小鼠體質(zhì)量介于二者之間(圖1)。

2.2 BALF 細(xì)胞計(jì)數(shù)

AST組小鼠在激發(fā)后5 d或15 d，BALF中的細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常組都顯著增高(P＜0.01)。使用地塞米松或OMT的各治療組與AST組比較，BALF中的細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低(P＜0.05或P＜0.01，表1)。

2.3 肺組織切片HE染色觀察結(jié)果

HE染色片可見，CON 組氣管、肺組織中無明顯病理改變，肺泡、小血管、支氣管等結(jié)構(gòu)完整(圖2A); AST組肺組織中肺大泡形成，肺充血肺泡內(nèi)出現(xiàn)泡沫樣滲出物，間質(zhì)水腫，可見淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤；肺組織中氣道上皮增厚管腔狹窄，肺間質(zhì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞浸潤氣管壁和肺泡周圍無炎性浸潤(圖2B)。各治療組亦出現(xiàn)于AST組相似的病理變化，但炎性細(xì)胞或嗜酸細(xì)胞浸潤不同程度減少(圖2C、D、E和F)。

3 討論

哮喘是一種世界范圍的呼吸道常見疾病，近年來，哮喘的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)造成的社會(huì)負(fù)擔(dān)不斷增加[6]。已知哮喘是由多種細(xì)胞，包括炎性細(xì)胞、氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥[7]。哮喘會(huì)引起支氣管壁出現(xiàn)炎性增厚改變，肥大細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的活性增加，使肺組織開始出現(xiàn)纖維化，肺泡和肺間質(zhì)就會(huì)隨著纖維化不斷受損，哮喘患者就會(huì)出現(xiàn)呼吸困難、心律失常等一系列呼吸衰竭癥狀,還會(huì)導(dǎo)致哮喘猝死、肺心病等病癥[8]。但是，關(guān)于哮喘確切的發(fā)病機(jī)理目前尚不清楚，目前的治療措施難以取得滿意效果。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況

表 1 BALF細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(n=3) 109/L

圖2 OMT治療5 d哮喘小鼠肺組織病理觀察(HE×200)

苦參堿來源于豆科植物苦參等，藥理作用廣泛，尤其在哮喘病的應(yīng)用方面受到關(guān)注。OMT是豆科槐屬植物中提取的一種生物堿，其結(jié)構(gòu)中均具有四環(huán)的嗪啶。它是一類具有苦參次堿-15-酮化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，具有多方面的藥理活性[9-14]。本文研究結(jié)果表明，OMT能有效改善哮喘動(dòng)物模型的一般情況, 對(duì)抗哮喘動(dòng)物模型肺組織炎性細(xì)胞浸潤，肺組織炎性反應(yīng)得到明顯改善。這為OMT治療哮喘奠定了一定的中醫(yī)理論基礎(chǔ)。OMT減輕肺組織炎癥反應(yīng)的機(jī)制，以及對(duì)抗氣道高反應(yīng)性和肺組織纖維化進(jìn)行調(diào)節(jié)是我們需要進(jìn)一步關(guān)注的問題。

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The Protective Effect of Oxymatrine on Asthma Mice

LAN Lu-sha, ZHAO Bing-bing, YANG Hong-yu, LUO Hong, JIANG Yan
(Experimental Animal Center, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

Objective To study the protective effect of Oxymatrine (OMT) on asthma mice.Methods The asthmatic BALB/c mice were induced by ovalbumin (OVA) and aluminium hydroxide.The general situations and weights of mice were observed every day. Then these mice were treated by using OMT and/or dexamethasone and were sacrificed at 5 or 15 days after treatment. The bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue of mice were obtained. Their pathological reaction was observed through HE stain. The total number of cells and eosinophilscells in BALF were counted. Result OMT can improve the weights of asthma mice. On day 5 and 15, the pathological reactions of the lung tissue in each treatment groups were the same with that of the asthma group, but the number of inflammatory cells in lung tissue was much less than that of the asthma group. The total number of cells and eosinophils cells in BALF were reduced compared with the asthma group (P＜0.05 or P＜0.01). Conclusion OMT has protective effect on the asthma mice.

Oxymatrine(OMT); Asthma; Pathological changes; Protection; Mice

Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0320-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.013

2017-05-30

貴州省科技廳省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合LH字[2016]7369)

蘭露莎(1984-), 女, 碩士研究生, 實(shí)驗(yàn)師。E-mail： 1558809668@qq.com

江 滟(1976-), 女, 醫(yī)學(xué)博士, 教授, 從事病毒致病機(jī)制及抗病毒免疫相關(guān)研究。E-mail： jiangyan3313@sina.com