活化T細胞核因子與腫瘤關(guān)系的研究進展

王建，柴嘉穗，張雅敏（.天津市第一中心醫(yī)院移植中心肝膽外科，天津市器官移植重點實驗室，天津市器官移植臨床醫(yī)學研究中心，天津 3009；.天津醫(yī)科大學一中心臨床學院，天津 3009）

活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）最初在活化T細胞核提取物中被發(fā)現(xiàn)，是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，可結(jié)合白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）啟動子激活T細胞［1］。后來發(fā)現(xiàn)NFAT廣泛表達于多種哺乳動物免疫細胞與組織細胞，是具有轉(zhuǎn)錄活性，多向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子［2］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)NFAT與腫瘤的形成、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞轉(zhuǎn)化與生長、腫瘤血管生成等方面發(fā)揮重要作用。

1 NFAT的結(jié)構(gòu)

NFAT家族的5個成員包括NFAT1（NFATc2/NFATp）、 NFAT2（NFATc1/NFATC）、 NFAT3（NFATc4）、NFAT4（NFATc3/NFATx）和NFAT5（TonEBP/OREBP）。NFAT5因高滲透壓而活化［3］，NFAT1-4受 Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin， CaN）信號通路調(diào)節(jié)［4］。NFAT氨基末端和羧基末端各有一個轉(zhuǎn)錄激活 結(jié) 構(gòu)域（transactivation region， TAD），NFAT1-4有與TAD串聯(lián)的2個保守結(jié)構(gòu)域（圖1）：調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，也稱為NFAT同源區(qū)（NFAT-homology region，NHR），是與Ca2+結(jié)合的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域；DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain， DBD），也稱為Rel同源區(qū)［2］。Ca2+/CaN 信號通路調(diào)節(jié) NFAT1-4［4］。NFAT5缺乏NHR結(jié)構(gòu)域，不能被CaN激活［3］。本文主要對Ca2+/CaN/NFAT信號通路與腫瘤的關(guān)系進行概述。

圖1 NFAT的主要結(jié)構(gòu)

2 NFAT的調(diào)控機制

NHR在靜息狀態(tài)下高度磷酸化，保持NFAT在無活性狀態(tài)并局限于細胞質(zhì)。當細胞外配體與胞膜表面受體結(jié)合，如T細胞受體（T cell receptor，TCR）、酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinase，RTK）或G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptor， GPCR），誘導磷脂酶Cγ（PLCγ）激活，隨后將4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）被水解為甘油二酯（DAG）和三磷酸肌醇（IP3），IP3結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上Ca2+通透性IP3受體（IP3R），刺激Ca2+從貯存池釋放到細胞質(zhì)，貯存池Ca2+的消耗導致基質(zhì)相互作用分子（stromal interaction molecule，STIM） 的激活，促進血漿中鈣釋放激活通道（calcium release-activated calcium， CRAC）的開放，引起下游細胞內(nèi)Ca2+水平的持續(xù)升高。胞質(zhì)內(nèi)Ca2+增加導致鈣敏感鈣調(diào)蛋白（Ca2+sensor calmodulin，CaM）激活，CaM進一步激活CaN。CaN水解NFAT使NHR的多磷酸殘基去磷酸化，NFAT核定位序列（nuclear localization sequence， NLS）暴露，導致其易位入核，在細胞核內(nèi)NFAT與Fos、Jun等其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄［5］。而NHR的磷酸化使NFAT出核序列暴露和NLS遮蓋，導致NFAT易位到細胞質(zhì)。這種可逆的磷酸化控制NFAT在細胞核和細胞質(zhì)間穿梭，切換其轉(zhuǎn)錄活性。

CaN在NFAT去磷酸化中具有關(guān)鍵的作用，CaN抑制劑可以有效促進NFAT出核，停留在細胞質(zhì)。環(huán)孢素A（CsA）和他克莫司（FK506）可以抑制CaN，作為免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于臨床。此外，還有一些內(nèi)源性CaN抑制劑如蛋白激酶A前體蛋白79、CaN結(jié)合蛋白1和唐氏綜合征的候選區(qū)域1（Down's syndrome candidate region 1， DSCR 1）［6］。DSCR1通過抑制CaN通路而抑制腫瘤生長，這可能是唐氏綜合征患者不易患惡性腫瘤的原因［7］。

除了CaN，還有多種激酶可以通過磷酸化NFAT蛋白調(diào)控其核穿梭。NFAT的磷酸化激酶根據(jù)作用方式可分為兩類，一類在靜止細胞的胞質(zhì)中使NFAT蛋白保持磷酸化狀態(tài)而阻止其進入細胞核，另一類在T細胞活化和CaN活性下降時于胞核中使NFAT蛋白磷酸化促進其出核。酪蛋白激酶1（casein kinase 1， CK1）磷酸化 NFAT的 SRR1調(diào)節(jié)區(qū)使其出核并停留在胞質(zhì)內(nèi)，糖原合成酶激酶3（GSK3）磷酸化NFAT1 的SP2調(diào)節(jié)區(qū)與NFAT2的SP2/3調(diào)節(jié)區(qū)促進其出核［8］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）在人類腫瘤中過度激活，促進NFAT易位于細胞質(zhì)，其中p38絲裂酶原活化蛋白（mitogen-activated protein，MAP）激酶磷酸化NFAT3中NHR絲氨酸殘基，Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化NFAT2和NFAT4中 CaN 的結(jié)合區(qū)［2］。

此外，還有其他一些調(diào)節(jié)NFAT的分子機制。原癌基因Cot/Tpl2激酶和蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）通路通過磷酸化NFAT1中TAD末端絲氨酸殘基促進其核易位。CsA無法抑制這種轉(zhuǎn)錄激活，NFAT1可以不依賴CaN而被激活［9］。翻譯后修飾，包括泛素化和泛素化修飾也可以調(diào)節(jié)NFAT［10］，這提示NFAT的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)錯綜復雜（圖 2）。

3 NFAT與腫瘤的發(fā)生發(fā)展

NFAT在調(diào)節(jié)細胞周期、基因表達和凋亡中具有重要作用［2］，Ca2+/CaN/NFAT信號通路是維持正常的細胞生理功能所必需的，該通路的失調(diào)可能導致參與細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達，最終發(fā)生腫瘤。

圖2 NFAT信號通路

研究發(fā)現(xiàn)，NFAT拮抗劑FK506對肝癌腫瘤細胞增殖具有抑制作用，F(xiàn)K506對周期蛋白（Cyclin A）表達的影響呈濃度負相關(guān)性，NFAT可能通過Cyclin A對肝癌細胞的增殖起抑制作用［11］。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，胰腺癌NFAT2與CaN的表達明顯增高，正常或炎性胰腺組織低或無表達，CaN抑制劑或用siRNA敲除NFAT2可以抑制胰腺癌細胞增殖。NFAT2可以與胰腺癌細胞中的癌基因c-myc啟動子結(jié)合，上調(diào)c-Myc轉(zhuǎn)錄引起cyclin D的表達，從而促進癌細胞的增殖［12］。NFAT2和c-myc的活化還可以作用于轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β， TGF-β），使其由早期癌的抑制因子轉(zhuǎn)化為進展期癌的啟動因子［13］。膀胱癌、非小細胞肺癌、肝癌、前列腺的腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)了NFAT2的過表達［6］。在胰腺癌中，NFAT2驅(qū)動上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT），可能是干細胞特征的出現(xiàn)的根源［14］，在干細胞從休眠到增殖的轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用。作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的下游轉(zhuǎn)錄因子，NFAT2抑制周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）從而維持干細胞的穩(wěn)定，研究表明NFAT2的激活導致CD34細胞顯著增殖，從而引發(fā)皮膚鱗狀細胞癌［15］。

NFAT1可以抑制CDK4和細胞周期蛋白A2表達，從而控制細胞周期活動和增殖，NFAT1缺陷小鼠對化學致癌物刺激更易發(fā)生腫瘤［16］，這提示NFAT1具有腫瘤抑制作用。乳腺浸潤性導管癌高表達NFAT1和NFAT4，NFAT1可誘導癌基因mdm2轉(zhuǎn)錄，使抑癌基因P53失活，晚期胰腺癌NFAT1的高表達與使抑癌基因p15沉默相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)NFAT1在啟動和促進炎癥相關(guān)的結(jié)腸直腸腫瘤中起關(guān)鍵作用，對黑色素瘤細胞的去分化起促進作用［2，17］。這又提示NFAT1有促癌作用。可能NFAT1在未轉(zhuǎn)化細胞是抑癌基因，但在腫瘤細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?。NFAT3可誘導腺泡對導管去分化，與胰腺癌發(fā)生相關(guān)［18］。在腫瘤形成與發(fā)展過程中，NFAT因組織細胞特異性導致不同蛋白水平、不同亞型的表達以及伴侶蛋白表達的改變，由此引起的信號轉(zhuǎn)導通路變化是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵。

4 NFAT與腫瘤轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移性是腫瘤的基本特征和和重要標志。血管生成和淋巴管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移必需的，腫瘤細胞通過EMT變得具有攻擊性和活動性，并侵入血管或淋巴管進入循環(huán)。越來越多的證據(jù)顯示，NFAT在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

4.1 NFAT與腫瘤血管和淋巴管生成：Ca2+/CaN/NFAT信號通路對脊椎動物的心血管系統(tǒng)形成是必不可少的。已經(jīng)確認與腫瘤血管生成有關(guān)的細胞因子有血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A， VEGFA）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor， FGF）和分泌型卷曲相關(guān)蛋白2（SFRP 2）等［19-20］。VEGFA結(jié)合VEGF受體（VEGFR）激活PLCγ，而FGF23結(jié)合FGF受體1c（FGR1c），二者引起Ca2+/CaN/NFAT信號通路激活。SFRP2通過非經(jīng)典Wnt/Ca2+/ NFAT通路促進NFAT4核易位。易位到核內(nèi)后，NFAT增強參與血管生成的靶基因的轉(zhuǎn)錄，如環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、 組 織 因 子（tissue factor，TF）等。唐氏綜合征患者內(nèi)源性CaN抑制劑DSCR1和NFAT維持激酶DYRK1A上調(diào)，不易患惡性腫瘤。利用轉(zhuǎn)基因小鼠，研究發(fā)現(xiàn)，DSCR1和DYRK1A通過阻斷VEGFA/Ca2+/CaN/NFAT信號通路抑制血管生成［21］。

VEGF和血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor BB， PDGF-BB）是腫瘤轉(zhuǎn)移和淋巴管生成的重要分子，通過VEGF/NFAT1和PDGF/NFAT1途徑促進淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［22］。免疫組化發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌患者NFAT1表達明顯增高［23］，PDGF-BB和VEGF-C的高表達與非小細胞肺癌淋巴管生成和預(yù)后不良相關(guān)［22］。VEGF在腫瘤血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）形成中起著重要的作用［24］，NFAT有可能通過VEGF參與腫瘤（vasculogenic mimicry，VM）的形成，這需要進一步研究來證實。

4.2 NFAT與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移：NFAT1和NFAT5在浸潤性導管乳腺癌的組織切片中高表達，它們是整合素α6β4的下游基因。整合素參與腫瘤細胞的增殖、生存和凋亡等多個環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)，通過α6β4整聯(lián)蛋白的信號傳導和激活NFAT5，可能與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移有關(guān)［25］。與此一致，蛋白激酶B（PKB）依賴性NFAT1泛素化及其隨后的降解蛋白酶體導致乳腺癌細胞系的遷移和侵襲潛能減弱［26］。NFAT是侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因如COX-2和自家趨化素（autotaxin，ATX）的轉(zhuǎn)錄因子。乳腺上皮細胞NFAT1誘導COX-2表達，催化PGE 2的合成。敲除或用藥物抑制COX-2可限制乳腺癌細胞的侵襲，相反COX-2和PGE2的過表達促進細胞侵襲［27］。ATX可以將溶血磷脂膽堿轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA），LPA是乳腺癌的有絲分裂原和運動因子。ATX通過α6β4/NFAT依賴的方式過表達，促進乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移［28］。三陰性乳腺癌NFAT1和NFAT2的表達明顯增高，體外及體內(nèi)實驗進一步證實Ca2+/CaN/NFAT信號通路的激活參與調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［29］。

NFAT1可以促進6-磷脂酰肌醇聚糖 （glypican-6，GPC-6）轉(zhuǎn)錄，后者通過Wnt5a信號激活JNK和p38 MAPK，促進乳腺癌細胞的侵襲性轉(zhuǎn)移［30］。p38 MAPK是NFAT1的出核激酶，這可能是NFAT的一個自反饋機制。在乳腺癌細胞中CK1ε突變可以抑制Wnt/β聯(lián)蛋白，激活Wnt/Rac1/JNK和NFAT通路，降低癌細胞的黏附性，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移［31］。

5 NFAT與腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境是一個由內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、周細胞、肌肉細胞、免疫細胞以及細胞外基質(zhì)組成的復雜系統(tǒng)。它是腫瘤不可或缺的重要組成部分，參與腫瘤的各個階段，包括腫瘤發(fā)生、腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥。腫瘤細胞NFAT信號激活導致產(chǎn)生炎癥趨化因子，促進炎癥細胞，包括肥大細胞，嗜中性粒細胞和單核細胞的浸潤。巨噬細胞浸潤到腫瘤微環(huán)境，分泌表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）和集落刺激因子1（colony stimulating factor 1， CSF1），NFAT也可以誘導免疫細胞和腫瘤細胞分泌CSF1，促進腫瘤的增殖和遷移［6］。NFAT2轉(zhuǎn)基因小鼠容易出現(xiàn)皮膚和卵巢腫瘤。在皮膚與卵巢腫瘤中，高表達和周圍低表達NFAT2細胞c-myc、信號轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）都上調(diào)，這表明NFAT2的活化可以影響微環(huán)境，在原位建立腫瘤微環(huán)境，進一步影響到周圍的細胞。CaN抑制劑DSCR1的缺失，導致肺血管內(nèi)皮細胞Ca2+/CaN/NFAT/促血管生成素-2 （angiopoietin-2，Ang-2）通路的過量激活，促進預(yù)轉(zhuǎn)移微血管生成，形成肺轉(zhuǎn)移［32］。

6 NFAT與腫瘤的治療

越來越多的證據(jù)表明，NFAT家族參與化療和靶向藥物的耐藥。伊馬替尼可以改善費城染色體陽性（Ph+）慢性粒細胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia， CML）患者的預(yù)后，但腫瘤經(jīng)常會出現(xiàn)耐藥并變得更有侵襲性。研究表明，Wnt/Ca2+/NFAT通路介導CML細胞對伊馬替尼的耐藥，Wnt/Ca2+/NFAT信號通路的阻斷可以提高Ph+的CML細胞對伊馬替尼的敏感性［33］。Wnt/Ca2+/NFAT通路也介導胰腺癌細胞耐受藥物誘導的細胞凋亡，Wnt5A敲除可使吉西他濱誘導的細胞凋亡顯著增加，NFAT1作為Wnt5a下游的目標，也通過抗凋亡機制起作用［34］。EGF受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）顯著延長EGFR突變的非小細胞肺癌患者的總生存期，但耐藥性的出現(xiàn)最終導致治療失敗。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3通過Wnt/Ca2+/NFAT通路，介導癌細胞對 EGFR-TKI的耐藥［35］。CsA 通過抑制STAT3可以增強EGFR-TKI對癌細胞的抗癌活性［36］。

鈣調(diào)磷酸酶抑制劑CsA和FK506作為免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于器官移植患者［37］。CsA與親免蛋白親環(huán)素結(jié)合，而FK506結(jié)合FK結(jié)合蛋白。兩種藥物-免疫親和素復合物與CaN直接作用，抑制其磷酸酶活性，導致NFAT失活。這會導致廣泛的NFAT抑制，NFAT抑制劑臨床應(yīng)用常伴隨各種毒副作用。腫瘤特異性或NFAT亞型特異性抑制劑可能是一種更有效的腫瘤治療方法，已有報道多種化合物和藥物有此功能，在不同類型的腫瘤都具有很好的抗腫瘤作用，如唑來膦酸、洋地黃和異黃酮［6］。內(nèi)源性CaN抑制劑DCSR1也可以作為治療的靶點［21］，NFAT的靶基因，如COX-2、VEGF和IL，也可以作為治療的靶點。另一方面，利用NFAT抑制劑聯(lián)合抗癌藥物來克服腫瘤耐藥也是很有前景的方法。達沙替尼聯(lián)合CsA治療慢性粒細胞白血病的臨床試驗（NCT01426334）正在進行中。

7 總 結(jié)

NFAT在腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥和腫瘤微環(huán)境中起重要作用。免疫和炎癥是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要組成部分，NFAT處于二者的交叉點，如何在免疫和腫瘤之間取得平衡可能是關(guān)鍵所在。目前尚不清楚NFAT不同亞型在不同腫瘤中的作用相反的機制以及NFAT特定亞型的功能。在腫瘤細胞中，編碼NFAT的基因是否存在突變或擴增，調(diào)節(jié)NFAT的激酶或結(jié)合NFAT的配體是否存在功能失調(diào)尚不明確。找到這些重要問題的答案，進一步理解NFAT在腫瘤中的作用，有助于將NFAT通路作為腫瘤治療的靶點。